漢防己甲素納米晶的制備及質(zhì)量評價*

黃文秀，周先果，黃錦平，馮麗珍，呂玉蓮，鄧婉瑤，劉勝君，王瑤，黃興振△

（1.廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧 530021 ；2.廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所，南寧 530021）

粉防己堿（Tetrandrine，Tet）是從防己科千金藤屬植物漢防己干燥塊根中提取的一種雙芐基異喹啉生物堿，具有抗纖維化、降低門靜脈壓力、消炎、鎮(zhèn)痛等作用[1]。但Tet作為一種生物堿，其水溶性差，導致生物利用度低，藥效的發(fā)揮及臨床應(yīng)用均受到了極大的限制。目前已有通過制備納米粒[2]、脂質(zhì)體[3]等新劑型來提高Tet的溶解性，但仍存在載藥量少、包封率低等問題。

納米晶體藥物無需載體材料，是將純藥物形成亞微米顆粒的膠狀分散體系，不受包封率的制約，藥物劑量可調(diào)范圍寬，依靠電荷保護劑和立體保護劑維持制劑的穩(wěn)定[4]。作為一種新的制劑技術(shù)，納米晶體藥物能夠提高低溶解度藥物的口服生物利用度[5]，也可用于靜脈注射或肺部給藥[6]。本研究采用超聲法制備防己甲素納米晶（Tet-NCs），并對納米晶的粒徑、晶型等進行質(zhì)量評價，為Tet-NCs的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機（900 W），寧波新芝生物科技股份有限公司；Nano ZSMPT-2納米粒度電位儀，英國Malvern公司；B13-3型智能恒溫定時磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；Smartlab 9kw型X射線衍射儀,日本理學RIGAKU公司；DSC1型差示熱掃描儀，梅特勒公司；SU8100型掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.2藥品和試劑Tet（南京景竹生物科技有限公司，含量＞98%，批號：JZ20110401）；羥丙基甲基纖維素（HPMC，上海麥克林生化科技有限公司，批號：C11847616）；大豆磷脂（上海太偉藥業(yè)股份有限公司）；吐溫80（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20200309）；泊洛沙姆68（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10263859）；泊洛沙姆188（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10751103）；蛋黃卵磷脂（合肥博美生物科技有限責任公司，批號：RUIBIO P4378）；甘露醇（上海瑞永生物科技有限公司，批號：RT21U1124）；蔗糖（天津光復(fù)精細化工有限公司，批號：20180313）。

1.3 Tet-NCs混懸液的制備方法篩選 精密稱取Tet 10 mg，溶解于1 mL甲醇（作為有機相）；稱取0.1 g吐溫80和0.1 g大豆磷脂，加至20 mL去離子水中溶解（作為水相）；水相置于冰浴中，將有機相一次性加至水相中。然后分別按照以下方法制備Tet-NCs混懸液：（1）超聲法[7]：超聲10 min（功率300 W），即得Tet-NCs混懸液；（2）攪拌法[8]：攪拌10 min（速度為1 200 r/min），即得Tet-NCs混懸液；（3）超聲—高壓均質(zhì)法[9]：超聲10 min（功率300 W），得到Tet-NCs粗混懸液，將Tet-NCs置于高壓均質(zhì)機，在200 Pa壓力下循環(huán)10次，然后在300 Pa壓力下循環(huán)20次，即得Tet-NCs混懸液。

將上述3種方法制備的Tet-NCs進行粒徑的檢測，并觀察其外觀，根據(jù)外觀、粒徑、PDI確定最佳的制備方法。

1.4最佳方法制得的Tet-NCs的影響因素考察

以平均粒徑、多分散系數(shù)（PDI）等為指標，分別對Tet-NCs制備過程中的穩(wěn)定劑類型、Tet濃度、有機相與水相的體積比等6個影響因素進行考察。

1.5穩(wěn)定系數(shù)（SI）和再分散指數(shù)（RDI）測定 取適量Tet-NCs混懸液，3 000 r/min離心30 min，取未沉淀部分測定粒徑，重復(fù)3次，計算SI[10]，SI＝離心后未沉淀部分的平均粒徑/離心前的平均粒徑。SI越接近1，表明納米混懸劑穩(wěn)定性越好。以RDI作為Tet-NCs凍干后再分散性的評價指標之一[11]，RDI＝凍干再分散后測得的粒徑/初始粒徑。RDI越接近1，表明凍干后“固化損傷”越小。

1.6凍干保護劑的篩選 按“1.3項”下制備Tet-NCs，分別加入5%蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇以及2.5%甘露醇+2.5%葡萄糖、2.5%甘露醇+2.5%葡萄糖、2.5%甘露醇+2.5%乳糖作為凍干保護劑[12]，以平均粒徑、PDI、RDI及外觀作為評價指標，考察不同的凍干保護劑對于Tet-NCs的影響。

1.7 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝 基于單因素的考察結(jié)果，選擇并考察對制備Tet-NCs影響較大的3個因素對Tet-NCs制備工藝的影響，以粒徑作為響應(yīng)值，運用Design Expert 13軟件進行3因素3水平的試驗設(shè)計[13-15]。

1.8 Tet-NCs質(zhì)量評價（1）掃描電子顯微鏡（SEM）觀察形態(tài)：取Tet原料藥和Tet-NCs適量，均勻黏附在樣品池上，表面減壓噴金處理，于SEM下觀察形態(tài)。（2）X射線衍射和DSC檢測：將Tet原料藥、物理混合物和Tet-NCs凍干粉分別加入帶有凹槽的定性分析用塑料玻璃板材中，用毛玻璃壓實。掃描參數(shù)：銅鈀，k線，掃描范圍（2θ）30°～60°，管壓40 kV，管流200 mA，掃描波長1.540 56 a，掃描速度：2°/min[2]。分別取5 mg Tet原料藥，物理混合物及Tet-NCs凍干粉，進行DSC分析。設(shè)置氣體為氮氣，掃描溫度范圍為30～270℃，升溫速率為10℃/min，氣體流速為50 mL/min[2]。

1.9 Tet-NCs溶出度測定（1）色譜條件：流動相為0.06%二乙胺甲醇∶水（60∶40），色譜柱C18（250 mm×4.5 mm，5μm），檢測波長257 nm，柱溫30℃，流速1 mL/min，進樣量10μL[16]。（2）標準曲線：精密稱取20 mg Tet對照品置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，甲醇定容至刻度，即得對照品溶液（2 mg/mL）；精密吸取對照品溶液適量，用甲醇稀釋濃度為0.02～0.1 mg/mL對照品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，以藥物濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

參考2020年版《中國藥典》（第四部）中溶出度測定（槳法）[17]，進行溶出度實驗。取Tet原料藥10 mg溶解于1 mL甲醇中，再取20 mL Tet-NCs混懸液（相當于含Tet約10 mg），各3份，設(shè)置溶出介質(zhì)為900 mL pH為7.4的緩沖溶液、水溫（37±0.5）℃、轉(zhuǎn)速100 r/min。于投樣后不同時間取樣2 mL，取樣后迅速補足2 mL pH為7.4的緩沖溶液。取樣溶液用0.05μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，按上述色譜條件進行進樣分析，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線法計算Tet的濃度，計算累積溶出度，并繪制Tet累積溶出度—時間曲線。

2 結(jié)果

2.1不同制備方法對Tet-NCs粒徑、PDI和外觀的影響 超聲法制得的Tet-NCs粒徑和PDI較小，攪拌法制得的Tet-NCs粒徑較大，PDI較小，高壓均質(zhì)法制得的Tet-NCs粒徑和PDI較小，見表1。

表1 不同制備方法對Tet-NCs粒徑、PDI和外觀的影響 ，n=3

表1 不同制備方法對Tet-NCs粒徑、PDI和外觀的影響 ，n=3

2.2不同穩(wěn)定劑對Tet-NCs粒徑、PDI和SI的影響

吳三大提出過“書法之源源于自然”的論斷。實踐中，他從鑿石和彈棉花中感悟出書法的節(jié)奏和韻律，從觀云卷云舒琢磨到字體的靈動和變化，從民族舞蹈中尋覓到字體的造型和變異。因此，他的作品極具節(jié)奏感和韻律感，從他落款的三大的“大”字，可以看出橫平不平，捺劃采用藏族舞蹈中“巴喳嗨”的動作造型，讓書法呈現(xiàn)舞美感。

吐溫80+大豆磷脂作為穩(wěn)定劑時Tet-NCs粒徑和PDI較小，SI為0.96；其他穩(wěn)定劑粒徑和PDI較大，SI不接近1.00，見表2。

表2 不同穩(wěn)定劑對Tet-NCs粒徑、PDI和SI的影響 ，n=3

表2 不同穩(wěn)定劑對Tet-NCs粒徑、PDI和SI的影響 ，n=3

2.3不同因素對Tet-NCs粒徑和PDI的影響

（1）有機相與水相的比例為1∶10時粒徑和PDI也較大，有機相與水相比例為1∶20以上時粒徑和PDI變化幅度不大；（2）超聲功率低于180 W時粒徑和PDI相對較大，超聲功率大于270 W時粒徑和PDI變化幅度不大；（3）超聲時間為1 min時粒徑和PDI相對較大，超聲時間長于5 min時粒徑和PDI隨時間的延長變化幅度不大；（4）吐溫80的含量為0.5%時，大豆磷脂的含量增高時粒徑變化幅度不大，PDI逐漸減小，隨著吐溫80的含量升高Tet-NCs的粒徑逐漸減小，PDI變化不明顯；（5）Tet濃度從7 mg/mL增至10 mg/mL時，Tet-NCs的粒徑逐漸減小，PDI變化不明顯，見表3。

表3 不同因素對Tet-NCs粒徑和PDI的影響 ，n=3

表3 不同因素對Tet-NCs粒徑和PDI的影響 ，n=3

2.4不同凍干保護劑對Tet-NCs粒徑、PDI和RDI的影響 以蔗糖為保護劑的凍干粉，粒徑、PDI和RDI最小，其他凍干保護劑，粒徑、PDI和RDI較大，見表4。

表4 不同凍干保護劑對Tet-NCs粒徑、PDI和RDI的影響 ，n=3

表4 不同凍干保護劑對Tet-NCs粒徑、PDI和RDI的影響 ，n=3

2.5響應(yīng)面結(jié)果 運用Design Expert 13軟件進行多元線性回歸，得回歸方程為Y=90.81-2.64*X1-4.06*X2-19.27*X3-5.41*X1X2+2.35*X1X3-1.98*X2X3-0.852 3*X12-3.74*X22+0.420 3*X32（R2=0.886 6），對回歸模型進行方差分析，因素水平見表5，試驗設(shè)計與結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表5 試驗設(shè)計因素與水平

表6 實驗設(shè)計與結(jié)果

表7 方差分析

通過響應(yīng)面設(shè)計模型及回歸方程計算，分析得出最佳工藝參數(shù)如下：超聲功率為270 W，超聲時間為8.44 min，吐溫80的含量為0.1%，預(yù)測粒徑為115.38 nm，綜合本實驗條件及設(shè)備多方面，最終調(diào)整工藝為：超聲功率為270 W、超聲時間為8 min、吐溫80的含量為0.1%。在響應(yīng)面篩選出的最佳處方及工藝的條件下，平行制備3批Tet-NCs見表8。

表8 3批Tet-NCs穩(wěn)定性驗證結(jié)果

2.6 Tet-NCs質(zhì)量分析SEM顯示：Tet原料藥以大小不均勻，不規(guī)則結(jié)構(gòu)存在，而Tet-NCs呈不規(guī)則橢圓形和圓形，粒度和大小分布較均勻，見圖1。

圖1 原料藥（A）和Tet-NCs（B）的電鏡圖

2.7溶出度結(jié)果 標準曲線回歸方程為Y=192.83X-194.96，R2=0.999 7。5 min以內(nèi)Tet-NCs累積溶出度約為66.50%，而Tet原料藥累積溶出度約為52.30%，Tet-NCs的累積溶出度較Tet原料藥高約14%左右；120 min內(nèi)Tet-NCs累積溶出度約為82.64%，而Tet原料藥累積溶出度約為58.57%，Tet-NCs的累積溶出度較Tet原料藥高約24%左右，見圖2C。

圖2 Tet-NCs的X射線衍射（A）和DSC（B）分析結(jié)果及溶出曲線（C）

3 討論

本研究在進行Tet-NCs混懸液制備工藝考察時發(fā)現(xiàn)，吐溫80+大豆磷脂作為穩(wěn)定劑時，制得的納米混懸劑粒徑小，體系能保持長時間的穩(wěn)定，其原因一可能是其他穩(wěn)定劑臨界膠束濃度高于吐溫80+大豆磷脂，因此當穩(wěn)定劑用量相同時，其他穩(wěn)定劑未達到臨界膠束濃度，使得產(chǎn)生納米粒子表面無法完全被穩(wěn)定劑包裹，從而粒徑多大于吐溫80+大豆磷脂；其原因二可能是吐溫80+大豆磷脂在用量相同時，表面張力小于其他穩(wěn)定劑，使得體系表現(xiàn)出更佳的穩(wěn)定性。納米晶的粒徑隨著吐溫80含量升高粒徑逐漸減小，PDI變化不明顯，可能原因是穩(wěn)定劑用量過多，超過其臨界膠束濃度時，多余的穩(wěn)定劑會形成膠束，與藥物納米粒競爭吸附穩(wěn)定劑，使藥物納米晶的粒徑減小。吐溫80+大豆磷脂的SI越接近1，表明Tet-NCs穩(wěn)定性越好，體系能保持長時間的穩(wěn)定，其效果優(yōu)于其他穩(wěn)定劑。當大豆磷脂的含量低于0.4%時，靜置數(shù)分鐘后會析出沉淀，大豆磷脂為0.5%時，靜置數(shù)分鐘依舊澄清透明。綜合以上結(jié)果，大豆磷脂的含量為0.5%較為合適。在一定的范圍內(nèi)，穩(wěn)定劑的含量越低越好，吐溫80的選擇范圍為0.1%～0.3%。

以蔗糖為保護劑的凍干粉，復(fù)溶速率快，并且粒徑相對較小，PDI和RDI最小，并未發(fā)現(xiàn)明顯的“固化損傷”，其他的凍干保護劑復(fù)溶后粒徑增大比較明顯，并且PDI和RDI也較大，出現(xiàn)了明顯的“固化損傷”。

失擬項不顯著，表明方程擬合度較好，模型具有極顯著性差異，預(yù)測性高。R2=0.886 6，說明該模型與實際值擬合度良好，可以用該模型來分析和預(yù)測試驗結(jié)果。回歸方程的顯著性表明，吐溫80含量對結(jié)果影響顯著，其余各項對結(jié)果影響不顯著。此外，從方程中可以看出各因子對Tet-NCs的粒徑大小影響順序為吐溫80含量（%）＞超聲時間＞超聲功率。平行制備3批Tet-NCs，預(yù)測值（115.38 nm）與實測值接近，表明該模型預(yù)測性良好，可信度高，可用于后期實驗。

Tet原料藥在8.44°、11.51°、14.14°、15.45°、19.62°、26.42°有較強的衍射峰出現(xiàn)，表明Tet原料藥具有特定的晶體形態(tài)，物理混合物中Tet的特征峰基本得到保留，而Tet-NCs的XRD圖譜中特征峰消失，呈現(xiàn)彌散的狀態(tài)，表明Tet-NCs中Tet呈現(xiàn)無定型結(jié)構(gòu)[13]。Tet原料藥在219℃出現(xiàn)特征吸收峰，表明熔點在為219℃。物理混合物中出現(xiàn)了Tet特征吸收峰，但發(fā)生了偏移，可能是由于與輔料混合后引起的熔點變化，并且在185℃出現(xiàn)特征吸收峰，表明輔料熔點在為185℃。而Tet-NCs中Tet特征吸收峰減弱，可能由于在制備超聲的過程中及凍干過程中導致Tet晶型發(fā)生了改變[13]。

綜上所述，本研究成功優(yōu)化了Tet-NCs的制備工藝，所制備的Tet-NCs質(zhì)量也符合要求，可為進一步開發(fā)Tet-NCs提供參考，也為Tet-NCs的工業(yè)化提供技術(shù)支持。