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    羧基化聚酰胺—胺/無定形磷酸鈣改善牙本質(zhì)粘接的實(shí)驗(yàn)研究*

    2022-04-28 10:48:18黃婧嫻楊婧謝紅宇嚴(yán)凱琦謝方方
    關(guān)鍵詞:粘接劑小管復(fù)合體

    黃婧嫻,楊婧,謝紅宇,嚴(yán)凱琦,謝方方△

    (1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科,廣西口腔頜面修復(fù)與重建研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西頜面外科疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學(xué)研究中心,南寧 530021;2.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院口腔科,柳州 545005)

    齲病是人類最常見的口腔疾病,樹脂粘接修復(fù)是其主要治療手段。隨著樹脂粘接材料研究的深入,樹脂牙本質(zhì)粘接修復(fù)技術(shù)得到了飛躍發(fā)展,在粘接強(qiáng)度及耐久性都有顯著的進(jìn)步。然而,樹脂牙本質(zhì)粘接耐久性的改善仍是樹脂粘接技術(shù)的一個(gè)難點(diǎn)。受樹脂單體溶解度的限制,樹脂單體不足以完全替換膠原微分子間的水分子,使得混合層底部存在部分暴露的膠原纖維,這些膠原纖維易被外源性細(xì)菌和內(nèi)源性膠原酶降解形成粘接界面缺陷,造成粘接耐久性下降[1]。

    近年來,牙本質(zhì)膠原纖維仿生礦化為改善粘接界面缺陷提供了新的思路。羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)是礦化膠原纖維的主要成分,仿生礦化是通過人工方法誘導(dǎo)HAP在脫礦膠原纖維內(nèi)有序沉積。其無定形相的礦化前驅(qū)體無定形磷酸鈣納米粒子(amorphous calcium phosphate,ACP)具有重要的生物礦化調(diào)控作用,可在膠原纖維內(nèi)部通過一系列分子水平的自組裝,形成有序的膠原纖維內(nèi)礦化[2]。自然狀態(tài)下,ACP熱力學(xué)極不穩(wěn)定,很容易自發(fā)形成大尺寸HAP而無法進(jìn)入膠原纖維內(nèi)部,通過加入一些有機(jī)物或無機(jī)物添加劑可使其穩(wěn)定存在[3]。根據(jù)已有研究報(bào)道,羧基化的聚酰胺—胺(carboxylated polyamidoamine,PAMAM—COOH)具有維持ACP小尺寸的能力,能誘導(dǎo)與牙本質(zhì)相似的礦物質(zhì)產(chǎn)生[4]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)中首次合成了PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體,使用PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體再礦化完全脫礦的膠原纖維,觀察到膠原纖維大部分橫截面均可見高密度晶體,膠原纖維周圍可見致密、連續(xù)的晶體形成,證實(shí)PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體具有誘導(dǎo)牙本質(zhì)膠原纖維仿生礦化的能力[5]。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)以自酸蝕粘接劑作為載體,探討并評(píng)價(jià)PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體通過仿生礦化樹脂—牙本質(zhì)粘接界面中裸露的膠原纖維來改善粘接性能的能力,觀察加入PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體后自酸蝕粘接劑粘接的樹脂—牙本質(zhì)粘接界面的剪切粘接強(qiáng)度及斷裂后的粘接界面,初步探討PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體仿生礦化技術(shù)應(yīng)用于樹脂—牙本質(zhì)粘接缺陷改善的可行性,為其臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1牙齒 征得患者知情同意并簽署知情同意書后,收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科新鮮完整拔除的前磨牙第三磨牙,并儲(chǔ)存于4℃的0.1%麝香草酚溶液中,離體后的牙齒1個(gè)月內(nèi)使用完畢。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)前磨牙或第三磨牙;(2)無齲壞、無白斑,未行充填治療或根管治療;(3)無裂紋,牙冠完整。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

    1.2實(shí)驗(yàn)材料和儀器 氯化鈣(CaCl2)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氫氧化鈉(NaOH)、無水乙醇(生工生物,中國);PAMAM—COOH(Sigma,美國);人工唾液(源葉生物,中國);光固化復(fù)合樹脂(3M,美國);一步法自酸蝕粘接劑幻彩-Bond(GC,日本)。恒溫磁力攪拌器(新瑞,中國);多功能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge,德國);電熱真空干燥箱(工興,中國);電動(dòng)打磨切割系統(tǒng)(Robert Bosch,德國);金相試樣拋光機(jī)(精博,中國);大功率超聲設(shè)備(新芝,中國);光固化燈(啄木鳥,中國);電腦控制萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(威邦,中國);超景深三維顯微系統(tǒng)(KEYENCE,日本)。

    1.3 ACP的制備方法 采用溶液共沉淀法制備ACP[6]。首先制備10 mmol/L的CaCl2溶液與6 mmol/L的Na2HPO4溶液,分別用1 mmol/L的NaOH調(diào)定pH=10.00±0.05,制得的CaCl2溶液與Na2HPO4溶液按1∶1體積比快速混合,室溫下攪拌反應(yīng)1 min,將反應(yīng)液分裝在帶有過濾膜的離心管中離心5 min(10 000 r/min,4℃),產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇洗滌后,再次離心5 min(10 000 r/min,4℃),無水乙醇洗滌離心步驟重復(fù)兩次。洗滌后產(chǎn)物置于真空干燥箱中,37℃干燥4 h,最終可得白色粉末狀A(yù)CP,于室溫下干燥保存并于60 d內(nèi)使用[7]。

    1.4 PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體的制備方法 采用溶液共沉淀法合成PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體[6]。首先將CaCl2和PAMAM—COOH依次溶于去離子水中制備相對分子質(zhì)量濃度比值為16∶1的10 mmol/L的CaCl2溶液,與6 mmol/L的Na2HPO4溶液分別用1 mmol/L的NaOH調(diào)定pH=10.00±0.05,制得的CaCl2溶液與Na2HPO4溶液按1∶1體積比快速混合,室溫下攪拌反應(yīng)30 min,離心、洗滌、干燥步驟同ACP,最終可得淡黃色粉末狀PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體,于室溫下干燥保存并于60 d內(nèi)使用[7]。產(chǎn)物通過傅立葉紅外光譜、X射線衍射驗(yàn)證其是否為PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體[5]。

    1.5樣本制備及分組 將“1.1項(xiàng)”中收集到的離體牙,使用電動(dòng)打磨切割系統(tǒng)在水冷卻條件下垂直于牙體長軸磨除冠部釉質(zhì),至釉—牙本質(zhì)下以完全暴露牙本質(zhì)面,將試樣的牙本質(zhì)面倒置于硅膠模具中,加入環(huán)氧樹脂包埋,脫模后制成僅暴露待粘接面的1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm立方體牙本質(zhì)試樣共80個(gè),在流水下冷卻下用600目碳化硅砂紙打磨待粘接面15 s,制備統(tǒng)一牙本質(zhì)粘接面。試樣用超純水充分漂洗5 min,反復(fù)3次,并用超聲振蕩清洗15 min。將試樣隨機(jī)分為4組(n=20):(1)空白對照組(A組):試樣粘接面經(jīng)拋光處理后,氣槍輕吹,按照廠家說明,使用一步法自酸蝕光固化粘結(jié)劑處理10 s,強(qiáng)吹5 s,光固化燈照射10 s,復(fù)合樹脂分層充填,每層2 mm,光固化20 s,堆成4 mm厚的樹脂冠;(2)ACP組(B組):試樣處理完全同上,但粘接劑中加入0.3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的ACP;(3)PAMAM—COOH組(C組):試樣處理完全同上,但粘接劑中加0.3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PAMAM—COOH;(4)PAMAM—COOH/ACP組(D組):試樣處理完全同上,但粘接劑中加入0.3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體。

    1.6剪切強(qiáng)度測試 將各組制好的離體牙—樹脂粘接樣本浸泡在人工唾液中,每24 h更換1次人工唾液,37℃恒溫孵育3個(gè)月后取出。剪切強(qiáng)度通過電腦控制萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測試,以MPa為單位。

    1.7掃描電鏡觀察與斷裂模式分析 所有樣本測試完成后,使用SEM對牙本質(zhì)斷端進(jìn)行觀察。在超景深三維顯微系統(tǒng)(50倍)下評(píng)估斷裂模式。斷裂類型有3種:(1)黏附破壞:包括斷裂在粘結(jié)劑與牙本質(zhì)之間和斷裂在粘結(jié)劑與樹脂之間;(2)內(nèi)聚破壞:包括牙本質(zhì)內(nèi)聚斷裂和復(fù)合樹脂內(nèi)斷裂;(3)混合破壞:黏附破壞和內(nèi)聚破壞均發(fā)生。

    1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本文數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1剪切強(qiáng)度測試結(jié)果PAMAM—COOH組和PAMAM—COOH/ACP組的剪切強(qiáng)度均高于空白對照組(P<0.05),但ACP組、PAMAM—COOH組、PAMAM—COOH/ACP組的剪切強(qiáng)度兩兩之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

    表1 各組粘接劑的剪切粘接強(qiáng)度結(jié)果

    表1 各組粘接劑的剪切粘接強(qiáng)度結(jié)果

    與空白對照組比較,△P<0.05。

    2.2斷裂模式分析 空白對照組、ACP組、PAMAM—COOH組、PAMAM—COOH/ACP組的斷裂模式均以黏附破壞為主,除空白對照組外,其余各組均發(fā)生少量內(nèi)聚破壞或混合破壞,見表2。

    表2 各組牙本質(zhì)粘接界面斷裂類型對比

    2.3 SEM觀察結(jié)果 經(jīng)人工唾液仿生礦化3個(gè)月,各組試件剪切強(qiáng)度測試后斷裂面在SEM下觀察(圖1),空白對照組除牙本質(zhì)小管內(nèi)可見樹脂殘留外,管內(nèi)和管周均未見明顯礦化產(chǎn)物生成(A1、A2)。ACP組牙本質(zhì)小管內(nèi)及管周可見少量新生成礦化物,牙本質(zhì)小管周圍沉積礦化物不連續(xù),高倍鏡下觀察到礦化產(chǎn)物與牙本質(zhì)小管連接疏松,牙本質(zhì)小管管徑未見明顯改變(B1、B2)。PAMAM—COOH組牙本質(zhì)小管內(nèi)與管周均可見新生成礦化產(chǎn)物,牙本質(zhì)小管周圍可見大塊連續(xù)的礦化物沉積,高倍鏡下觀察到新生成礦物深入牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)壁,并可觀察到部分小管管徑減?。–1、C2)。PAMAM—COOH/ACP組牙本質(zhì)小管內(nèi)部及管周可見明顯新生礦化產(chǎn)物生成,有連續(xù)的礦物沉積在牙本質(zhì)小管周圍,高倍鏡下觀察到大量新生礦物沿小管內(nèi)部緊密排列,并可觀察到牙本質(zhì)小管管徑呈不同程度的縮小(D1、D2)。

    圖1 剪切強(qiáng)度測試后各組斷端SEM觀察結(jié)果

    3 討論

    樹脂充填修復(fù)是目前臨床上最主要的齲病治療方法。牙本質(zhì)粘接界面缺陷會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)齲的產(chǎn)生,影響樹脂—牙本質(zhì)粘接耐久性,最終造成樹脂粘接失敗[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì),美國因齲病修復(fù)失敗而進(jìn)行二次修復(fù)的費(fèi)用占齲病治療費(fèi)用的50%~70%[9]。因此,牙本質(zhì)粘接界面缺陷的改善具有十分重要的意義。研究表明,只有礦化的膠原纖維可以長時(shí)間保留,甚至可維持?jǐn)?shù)萬年穩(wěn)定不變[10]。Tay等[11]提出了引導(dǎo)組織再礦化這一種由粒子介導(dǎo)的仿生再礦化模式。Huang等[12]將引導(dǎo)組織再礦化技術(shù)應(yīng)用于自酸蝕樹脂—牙本質(zhì)粘接界面中,發(fā)現(xiàn)再礦化主要集中在膠原纖維內(nèi)可具有更好的樹脂粘接效果。因此,調(diào)控HAP在膠原纖維內(nèi)有序沉積是改善樹脂—牙本質(zhì)粘接界面缺陷的關(guān)鍵。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體尺寸為(22.03±3.85)nm,小于膠原纖維內(nèi)間隙(40 nm),符合誘導(dǎo)形成膠原纖維內(nèi)礦化的基本要求,且經(jīng)殼聚糖選擇性脫除膠原纖維外礦物后新礦物的形貌和密度幾乎沒有變化,證實(shí)PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體具有誘導(dǎo)膠原纖維形成纖維內(nèi)礦化的能力[5]。因此本研究將PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體加入自酸蝕粘接劑中,探討其對樹脂—牙本質(zhì)粘接性能的影響。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)人工唾液孵化3個(gè)月后,加入PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體的自酸蝕粘接劑,其剪切強(qiáng)度高于空白對照組,證實(shí)了納米復(fù)合體加入可增強(qiáng)樹脂—牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度。PAMAM—COOH組的剪切強(qiáng)度也高于空白對照組,且與PAMAM—COOH/ACP組無明顯差異。分析原因?yàn)槿斯ね僖褐泻械挠坞x鈣、磷離子,可被PAMAM—COOH吸附,為HAP在膠原纖維上的沉積提供成核位點(diǎn)和礦化模板。本課題組前期研究已證實(shí),PAMAM—COOH在礦化環(huán)境中能誘導(dǎo)牙本質(zhì)再礦化[13]。SEM下也觀察到小管內(nèi)礦物的伸入及管周礦物的生成。

    然而,PAMAM—COOH可快速進(jìn)入膠原纖維內(nèi)部并與位點(diǎn)結(jié)合,而大多數(shù)ACP由于失去穩(wěn)定性而在膠原纖維外成核,從而導(dǎo)致纖維內(nèi)礦化不良[14]。本實(shí)驗(yàn)SEM下見PAMAM—COOH組管周多有大塊的礦物沉積,證實(shí)產(chǎn)物多為大尺寸礦物。PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體通過穩(wěn)定ACP,更好地誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化,以此改善牙本質(zhì)粘接性能。SEM結(jié)果也證實(shí),經(jīng)人工唾液處理3個(gè)月后,與PAMAM—COOH組相比,PAMAM—COOH/ACP組形成的礦化產(chǎn)物與牙本質(zhì)結(jié)合更加緊密,是更為理想的改善樹脂—牙本質(zhì)長期耐久性的添加劑。

    綜上,將PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體加入到自酸蝕粘接劑中改善樹脂—牙本質(zhì)粘接性能具有可行性。本研究將人離體牙放置于人工唾液中進(jìn)行評(píng)估,是常用的體外實(shí)驗(yàn)方法,然而,人體口腔情況較為復(fù)雜,體外實(shí)驗(yàn)并不能完全模擬口腔環(huán)境,存在局限性。PAMAM—COOH/ACP納米復(fù)合體與牙本質(zhì)的結(jié)合機(jī)制及其對樹脂—牙本質(zhì)長期粘接效果的影響仍未明確,在其轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用前,還需要進(jìn)一步研究。

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