朝天罐總酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用*

張琳珮，陳依雨，陸洪艷，史雯雪，郭 玲，蔣霞

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

炎癥是人體抵御外源性入侵物或調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)失調(diào)必不可少的防御手段[1]。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，巨噬細(xì)胞參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中具有重要作用[2]。研究顯示，中草藥可降低脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中腫瘤壞死因子（TNF）-α、一氧化氮（NO）等炎癥因子水平[3-4]。朝天罐（Osbeckia opipara C.Y.Wu et C.Chen）為野牡丹科金錦香屬植物，是廣西少數(shù)民族地區(qū)的常用藥材，主要以根入藥，其味甘、微苦，性平，歸腎、大腸經(jīng)，功能益腎、止血、解毒[5-6]。目前大量研究表明，酚類化合物在抗炎方面有很高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景[7-8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，朝天罐總酚為朝天罐根中重要的活性物質(zhì)，朝天罐粗提物具有抗炎作用[9-11]。但目前對(duì)LPS刺激下朝天罐總酚的抗炎作用研究尚未見報(bào)道。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）為研究對(duì)象，探討朝天罐總酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，為深入研究朝天罐抗炎活性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物 朝天罐采于廣西金秀瑤族自治縣，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)天然藥物與生藥學(xué)教研室焦愛軍教授鑒定為野牡丹科植物朝天罐的根。采用課題組前期研究方法制備朝天罐總酚純化物[9]，臨用前以無(wú)菌培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

經(jīng)計(jì)算，研究區(qū)內(nèi)黑云母二長(zhǎng)花崗巖巖石生熱率估算為3.23～12.34 μW/m2，平均值5.24 μW/m2，除孔深600 m處巖石生熱率突變外，整體上比較穩(wěn)定，處于3.23～5.18 μW/m2，見圖2，其中U、Th和40K放射性產(chǎn)熱分別占巖石生熱率的30.84%、59.68%、9.48%，說(shuō)明巖石生熱率主要依靠鈾釷貢獻(xiàn)，鉀貢獻(xiàn)率較小，研究區(qū)巖石生熱率高于世界范圍內(nèi)花崗巖放射性生熱率平均值2.5 μW/m2，為高產(chǎn)熱花崗巖(HHP)。

1.2細(xì)胞和主要試劑 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。LPS（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：L2880）；地塞米松（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：503F051）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20200617）；TNF-α、白細(xì)胞介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（Elabscience公司，批號(hào)：UGS26LDTHZ、ZMH73FDG6E）；中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：070720200930）。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和分組RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，并置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及不同濃度（1.88μg/mL、3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL）朝天罐總酚組。模型組加入1μg/mL的LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型，陽(yáng)性對(duì)照組加入10μg/mL地塞米松，正常對(duì)照組不予處理。

單臥軸攪拌機(jī)是由德國(guó)公司開發(fā)的。雙水平軸攪拌機(jī)是隨著混凝土施工技術(shù)的逐步完善而發(fā)展起來(lái)的新型機(jī)型。國(guó)外從第二十世紀(jì)末開始在美國(guó)和德國(guó)，但軸封技術(shù)不成熟，其發(fā)展基本上處于停滯狀態(tài)。直到七十年代初，這項(xiàng)技術(shù)已形成了一系列產(chǎn)品。早在上世紀(jì)80年代中國(guó)的發(fā)展，但發(fā)展迅速，在產(chǎn)品說(shuō)明書和產(chǎn)品的數(shù)量，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了其他模型。

反季節(jié)種植即是在植物的非正常栽植時(shí)間進(jìn)行種植，其在一定程度上違背了植物的正常生長(zhǎng)規(guī)律，如果在種植過(guò)程中技術(shù)處理不當(dāng)、苗木選擇不當(dāng)，那苗木的成活率就得不到保證。為有效提升苗木成活率，保證工程施工質(zhì)量，在選擇苗木時(shí)應(yīng)注意以下要點(diǎn)：

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以1.2×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔100μL。培養(yǎng)24 h后吸棄上清液，細(xì)胞分組處理后，置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，避光振搖10 min；用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，即實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.6 NO含量檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞以2×105個(gè)/mL接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基，細(xì)胞分組處理后，置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min離心5 min，取上清液；采用Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO的含量，用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處各孔的OD值。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照NO試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 RAW264.7細(xì)胞吞噬功能檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞按1×106個(gè)/mL接種于96孔板，每孔200μL。培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基，細(xì)胞分組處理后，置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h；棄上清液，PBS清洗，每孔加入200μL細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入20μL中性紅染色液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h；吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗，每孔加入200μL中性紅裂解液，于搖床上振搖10 min；用酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm波長(zhǎng)處各孔的OD值，計(jì)算吞噬指數(shù)，即實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值。

2.4朝天罐總酚對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNFα、IL-6含量的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6含量升高；與模型組比較，朝天罐總酚中、高劑量組細(xì)胞上清液中TNF-α含量降低，朝天罐總酚各劑量組IL-6含量降低，見表1。

2.1朝天罐總酚對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 不同濃度的LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率在（100±10）%范圍內(nèi)，可視為對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響。模型組與空白對(duì)照組細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白對(duì)照組比較，朝天罐總酚30μg/mL、60μg/mL組細(xì)胞存活率降低，而當(dāng)朝天罐總酚濃度≤15μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞存活率均高于90%，與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可視為無(wú)細(xì)胞毒性，見圖1。

2.3朝天罐總酚對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO含量的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中NO含量升高；與模型組比較，朝天罐總酚中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞上清液中NO含量降低，見圖3。

2 結(jié)果

潘國(guó)文曾說(shuō)“中國(guó)人善形象思維，西方人善邏輯思維”，其中，形象思維就是我們常說(shuō)的具體思維，而邏輯思維即抽象思維。由此看來(lái)，漢民族更注重具體思維，而西方民族更傾向于抽象思維。

建立促進(jìn)融資租賃業(yè)發(fā)展的政策支持體系。引進(jìn)融資租賃公司、設(shè)立分支機(jī)構(gòu)，支持符合條件的各類資本設(shè)立融資租賃公司，提高融資租賃對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展各行業(yè)的覆蓋面和市場(chǎng)滲透率[4]；支持設(shè)立專門面向中小微企業(yè)的融資租賃公司，發(fā)揮其融資便利、期限靈活、財(cái)務(wù)優(yōu)化的優(yōu)勢(shì)，提供適合中小微企業(yè)特點(diǎn)的產(chǎn)品和服務(wù)；鼓勵(lì)融資租賃公司加大對(duì)通用航空、支柱產(chǎn)業(yè)、教育醫(yī)療、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、中小微企業(yè)等領(lǐng)域的支持力度，拓寬融資渠道。

圖1 不同濃度朝天罐總酚對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

2.2朝天罐總酚對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬功能的影響 與空白對(duì)照組比較，朝天罐總酚（3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL）能增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力（圖2），故選擇3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL作為低、中、高給藥濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同濃度朝天罐總酚對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬功能的影響

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 不同濃度朝天罐總酚對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞NO含量的影響

1.7細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6水平檢測(cè) 采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的含量，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔的OD值。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

表1 不同濃度朝天罐總酚對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞TNF-α、IL-6含量的影響 ，n=3

表1 不同濃度朝天罐總酚對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞TNF-α、IL-6含量的影響 ，n=3

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

3 討論

朝天罐主治腰膝酸軟、咯血、痢疾、咽喉痛等疾病，其根的主要化學(xué)成分為酚類和鞣質(zhì)[12-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，朝天罐總酚具有較強(qiáng)的體外抗氧化、抗癌作用[9,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，朝天罐總酚能夠提高LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖活性，減少細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6，抑制細(xì)胞產(chǎn)生NO，增強(qiáng)細(xì)胞吞噬能力。由此表明，朝天罐總酚具有抗炎作用。

LPS是細(xì)胞內(nèi)毒素的有效成分，是激活機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要誘導(dǎo)因子，其誘導(dǎo)的RAM264.7細(xì)胞炎癥模型是一種常用的炎癥反應(yīng)模型[15-17]。在LPS的誘導(dǎo)下，RAW264.7細(xì)胞分泌大量炎癥因子如TNF-α、IL-6、NO等，這些炎癥因子將進(jìn)一步活化RAW264.7細(xì)胞，從而加重炎癥反應(yīng)[18]。巨噬細(xì)胞是一種免疫細(xì)胞，可通過(guò)吞噬功能及分泌多種細(xì)胞因子等參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分[19-20]。NO是炎癥反應(yīng)中的炎癥介質(zhì)之一，隨著NO釋放量的升高，巨噬細(xì)胞吞噬能力也增強(qiáng)，吞噬指數(shù)可以反映吞噬功能的強(qiáng)弱，是衡量巨噬細(xì)胞活性的一個(gè)重要指標(biāo)[21]。本研究結(jié)果顯示，朝天罐總酚可顯著減少LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6的分泌，這提示朝天罐總酚可能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的水平以活化巨噬細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)吞噬能力來(lái)發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，朝天罐總酚通過(guò)抑制炎癥因子的分泌和產(chǎn)生，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能發(fā)揮抗炎作用，這為中藥新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但關(guān)于朝天罐總酚的抗炎作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。