基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實(shí)驗(yàn)探討蛭巖消積方治療肝癌的作用機(jī)制*

仇雯霞，謝小慧，陳欣欣，王宗玉，陳闖△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200；3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021）

原發(fā)性肝癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率目前仍位居高位[1]。臨床研究表明，中醫(yī)藥對(duì)肝癌防治有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[2-4]，但大多數(shù)方藥作用機(jī)制不明確，阻礙了中醫(yī)藥的推廣應(yīng)用。蛭巖消積方是廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的院內(nèi)制劑（備案號(hào)：桂藥制備字M20220001000），組方包括巖黃連、水蛭、白花蛇舌草、黨參、柴胡、莪術(shù)、絞股藍(lán)、薏苡仁。研究表明，蛭巖消積方能減輕肝癌患者的臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，但蛭巖消積方的抗肝癌機(jī)制尚未明確。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)蛭巖消積方治療肝癌的作用靶點(diǎn)及通路，并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行初步驗(yàn)證，為蛭巖消積方的抗肝癌機(jī)制研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞HepG2由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基（含青—鏈霉素100 U/mL），置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2主要試劑FBS、DMEM、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青—鏈霉素混合液、姬姆薩、4%多聚甲醛、二甲基亞砜（DMSO）、PBS購(gòu)自北京索萊寶公司；Matrigel基底膜基質(zhì)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本東仁公司；細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物；兔抗PI3K、AKT、mTOR、磷酸化（p-）PI3K、p-AKT、p-mTOR、CDK2、CyclinA、p-CHK1、Cdc25A購(gòu)自博奧森；二抗購(gòu)自碧云天。

1.3蛭巖消積方水提物的制備 蛭巖消積方從廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院藥房采購(gòu)。蛭巖消積方加15倍水，煎煮1 h后，用400目濾布過(guò)濾，濃縮成膏，凍干機(jī)干燥成粉，臨用時(shí)用培養(yǎng)基溶解，0.22μm微孔濾器過(guò)濾除菌。

1.4 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度（3 200μg/mL、1 600μg/mL、800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL和25μg/mL）蛭巖消積方水提物，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h；加入CCK8溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD）值。計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），選取IC50附近低、中、高濃度繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，即（1-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。

1.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 收集細(xì)胞，分別加入低、中、高濃度蛭巖消積方水提物，培養(yǎng)48 h；調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，取200 μL無(wú)血清DMEM細(xì)胞懸液接種于小室，24孔板下室中加入600μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，姬姆薩染液室溫染色30 min，清洗風(fēng)干，光鏡下觀察記錄膜背面遷移的細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室膜底部用Matrigel稀釋膠包被、水化，處理方法同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集低、中、高濃度蛭巖消積方處理后的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，4℃下離心5 min，棄上清液；加入1 mL DNA Staining solution和10μL Permeabilization solution，渦旋振蕩10 s混勻；室溫避光孵育30 min，選擇最低上樣速度，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入一抗PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、CDK2、CyclinA、p-CHK1、Cdc25A（均1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色液曝光、顯影。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8蛭巖消積方肝癌治療靶點(diǎn)的獲取 本研究利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP（https://www.tcmspw.com/tcmsp.php）、Batman-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）以及文獻(xiàn)檢索[5]收集蛭巖消積方組成藥物的活性成分及作用靶點(diǎn)。在TCMSP中以口服生物利用度（OB）≥20%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在Batman-TCM中以Score cut off≥20，校正P值＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到有效的活性成分及靶點(diǎn)。將獲得的靶點(diǎn)蛋白名導(dǎo)入到Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，獲取標(biāo)準(zhǔn)基因名，即為蛭巖消積方的所有靶點(diǎn)。以“hepatocellular carcinoma”及“Liver cancer”為關(guān)鍵詞，從GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、OncoDB.HCC（http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/index.htm）中查詢肝癌相關(guān)基因，將所有得到的基因合并后去除重復(fù)，即為肝癌相關(guān)的疾病基因。將獲得的疾病靶點(diǎn)與獲得的蛭巖消積方靶點(diǎn)取交集即可得到蛭巖消積方治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)。

1.9蛭巖消積方治療肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)和蛋白—蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將蛭巖消積方治療肝癌的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://stringdb.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。選擇物種為“homo sapiens”，將交互得分最高置信度設(shè)置為≥0.9，隱藏游離靶點(diǎn)，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到靶蛋白之間的PPI網(wǎng)絡(luò)，并將相互作用信息導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件中。利用CytoNCA功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的度中心度（DC）、中間性中心性（BC）、緊密性中心性（CC）、特征向量中心性（EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（NC）和局部平均連通性（LAC）。利用R語(yǔ)言進(jìn)行篩選，同時(shí)滿足大于各因素中位值的條件，得出核心網(wǎng)絡(luò)。

1.10蛭巖消積方治療肝癌靶點(diǎn)的GO功能分析和KEGG通路富集分析 基于Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）及R語(yǔ)言（version 3.6.3）中的ggplot2、clusterProfiler、AnnotationHub、org.Hs.eg.db、DOSE、ggpurb程序包對(duì)蛭巖消積方治療肝癌的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析及GO功能富集分析，并對(duì)富集分析的結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1蛭巖消積方治療肝癌的靶點(diǎn) 依據(jù)篩選條件，去除無(wú)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)和重復(fù)項(xiàng)后得到93種有效活性成分，其中白花蛇舌草有8個(gè)化合物，柴胡有16個(gè)化合物，黨參有22個(gè)化合物，莪術(shù)有2個(gè)化合物，絞股藍(lán)有19個(gè)化合物，水蛭有15個(gè)化合物，薏苡仁有7個(gè)化合物，巖黃連有12個(gè)化合物，重復(fù)化合物8種。查詢上述93種有效活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白，將得到的靶蛋白輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇人類(lèi)，共得到399個(gè)經(jīng)人工注釋的人類(lèi)基因，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索肝癌的相關(guān)作用靶點(diǎn)有17 034個(gè)（圖1），兩者取交集得到蛭巖消積方作用于肝癌的靶點(diǎn)381個(gè)（圖2）。

圖1 4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因并集

圖2 藥物與疾病靶點(diǎn)的交集基因

2.2關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲得及PPI網(wǎng)絡(luò)圖 首次篩選的閾值為DC≥21、EC≥0.017 619、LAC≥9、BC≥178.963 4、CC≥0.231 436、NC≥10.177 12，得到106個(gè)節(jié)點(diǎn)，7 454條邊的網(wǎng)絡(luò)圖；第2次篩選閾值為DC≥75、EC≥0.091 881、LAC≥36.357 14、BC≥810.798 2、CC≥0.252 513、NC≥48.678 17，得到30個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 282條邊的網(wǎng)絡(luò)圖。經(jīng)過(guò)2次篩選后得到核心網(wǎng)絡(luò)（圖3），表1所示的作用靶點(diǎn)均為PPI網(wǎng)絡(luò)中度值較高且受到蛭巖消積方中藥物活性成分調(diào)控的靶點(diǎn)蛋白，為蛭巖消積方治療肝癌的關(guān)鍵靶基因。

表1 蛭巖消積方治療肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選過(guò)程

2.3蛭巖消積方治療肝癌靶點(diǎn)的GO及KEGG分析GO富集包括3個(gè)模塊，分別為生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）。主要涉及癌癥通路、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氧水平的反應(yīng)、前列腺癌、離子遷移的調(diào)節(jié)、IL-4和IL-13通路、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、光動(dòng)力療法誘導(dǎo)NF-κB生存信號(hào)、炎癥反應(yīng)、體液水平的調(diào)節(jié)等（圖4）。KEGG通路富集分析中，取校正過(guò)的P值最小的前30條通路。蛭巖消積方治療肝癌的靶蛋白主要富集在PI3K/AKT、乙肝、丙肝、前列腺癌、AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號(hào)通路（圖5）。

圖4 蛭巖消積方治療肝癌靶點(diǎn)的GO富集分析

圖5 蛭巖消積方治療肝癌靶點(diǎn)的GO富集分析

2.4蛭巖消積方水提物抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 蛭巖消積方水提物作用于HepG2細(xì)胞48 h的IC50為1 499μg/mL，故選擇800μg/mL、1 600μg/mL、2 400μg/mL作為蛭巖消積方水提物低、中、高劑量處理HepG2細(xì)胞72 h。

隨著蛭巖消積方水提物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞增殖活性逐漸降低；隨著蛭巖消積方水提物濃度的增加，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少，見(jiàn)圖6、表2。

表2 各組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較 ，n=3

表2 各組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較 ，n=3

與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

圖6 蛭巖消積方水提物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

2.5蛭巖消積方水提物對(duì)細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組比較，蛭巖消積方水提物中、高劑量組G1期細(xì)胞所占比例減少，S期細(xì)胞所占比例增加，見(jiàn)圖7。

圖7 蛭巖消積方水提物對(duì)細(xì)胞周期的影響

2.6各組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，蛭巖消積方水提物中、高劑量組CDK2、Cdc25A、CyclinA蛋白表達(dá)量及p-AKT/AKT比值、p-PI3K/PI3K比值降低，p-CHK1蛋白表達(dá)量升高；各組p-mTOR/mTOR比值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖8、表3。

圖8 Western blotting蛋白電泳圖

表3 各組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 ，n=3

表3 各組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 ，n=3

與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，蛭巖消積方水提物以濃度依賴(lài)的方式抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)KEGG富集結(jié)果可知，PI3K/AKT通路是蛭巖消積方作用于肝癌的相關(guān)重要通路之一，且組方藥物有效成分的靶點(diǎn)均參與PI3K/AKT通路。PI3K與AKT組成的信號(hào)通路與多種生物信號(hào)調(diào)節(jié)有關(guān)，其作用包括抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成，同時(shí)還與肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲密不可分，在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-9]。mTOR是PI3K/AKT信號(hào)通路的主要下游靶點(diǎn)，是一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)因子。本研究中，蛭巖消積方中、高劑量組PI3K、AKT的磷酸化水平顯著下降，但mTOR磷酸化水平無(wú)明顯變化，推測(cè)蛭巖消積方水提物可能通過(guò)阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路抑制HepG2細(xì)胞增殖。中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，且磷酸化和降解之間的相互關(guān)系是復(fù)雜的，因此仍需進(jìn)一步的研究。

細(xì)胞增殖失控是癌細(xì)胞的一個(gè)基本特征，而這種失控是由細(xì)胞周期調(diào)控紊亂引起的[10]。CDK2是CDK家族中的重要成員，為PI3K/AKT通路的下游蛋白，可與CyclinE和CyclinA相互結(jié)合，啟動(dòng)DNA合成，促進(jìn)細(xì)胞分裂，加快細(xì)胞周期[11]。Cdc25A與CDK2相互促進(jìn)，在多種腫瘤中呈高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤的惡性程度和預(yù)后有關(guān)[12-13]。研究表明，調(diào)控Cdc25A降解可阻滯細(xì)胞周期，活化的CHK1通過(guò)磷酸化Cdc25A的第82位絲氨酸，促進(jìn)Cdc25A的泛素化降解，最終導(dǎo)致G1/S期阻滯[14-15]。本研究中，蛭巖消積方水提物下調(diào)CDK2、Cdc25A、CyclinA蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)p-CHK1蛋白表達(dá)；細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示，該藥可將肝癌細(xì)胞阻滯在S期，從而抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，蛭巖消積方水提物可能通過(guò)阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路抑制HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本組今后將開(kāi)展蛭巖消積方作用于肝癌小鼠的體內(nèi)研究，以期為蛭巖消積方在肝癌臨床治療中的應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。