整合素連接激酶和黏著斑激酶在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與人乳頭瘤病毒感染的關(guān)系

李曉丹，費(fèi)曉鶯，韓 敏，張香玲，趙 靜

(1.邯鄲市第一醫(yī)院婦科，河北 邯鄲 056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院手術(shù)室，河北 邯鄲 056002)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其最常見的病理類型是宮頸鱗狀細(xì)胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)，CSCC約占宮頸癌的75%～80%[1]。研究表明，人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染是宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素之一[2]，宮頸上皮內(nèi)瘤病(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是宮頸癌的癌前病變，因此，預(yù)防HPV感染對(duì)降低宮頸癌發(fā)病率具有重要意義。整合素連接激酶(integrin linked kinase,ILK)是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，其在整合素、生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化、遷移、浸潤(rùn)及腫瘤血管生成等過程[3]。黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是生長(zhǎng)因子受體和整合素介導(dǎo)信號(hào)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可通過其激酶活性和支架功能調(diào)控正常及癌細(xì)胞的基本過程[4]。本研究旨在探討ILK和FAK的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征和HPV感染的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本來源選擇2015年10月至2019年8月邯鄲市第一醫(yī)院保存的30例正常宮頸組織(對(duì)照組)、30例CIN組織(CIN組)和60例CSCC組織標(biāo)本(CSCC組)為研究對(duì)象，納入對(duì)象均經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷，病歷資料完整，且排除患有其他系統(tǒng)腫瘤及可能有影響本研究結(jié)果的不利因素者。CIN和宮頸癌患者中HPV-DNA陽性75例，HPV-DNA陰性15例。對(duì)照組、CIN組和CSCC組患者的年齡分別為41～76(58.36±9.24)、40～76(57.86±9.35)、42～77(59.46±9.63)歲，3組患者的年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，SYBR-green實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，抗ILK、抗FAK抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)正常宮頸組織、CIN組織和CSCC組織中ILK、FAK mRNA的表達(dá)取正常宮頸組織、CIN組織和CSCC組織，TRIzol 法提取總 RNA，溶于焦碳酸二乙酯水，測(cè)定濃度與純度；以cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR；引物序列：ILK的上游引物序列為5′-GCACTCAATAGCCGTAGTG-3′，下游引物序列為5′-CCTACTTGTCCTGCATCTTC-3′；FAK的上游引物序列為5′-GCGTCTAATCCGACAGCA-3′，下游引物序列為5′-GCCGACTTCCTTCACCAT-3′；內(nèi)參β-actin的上游引物序列為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′,下游引物序列為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性35 s，60 ℃退火30 s，72 ℃擴(kuò)增30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng)5 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算正常宮頸組織、CIN組織和CSCC組織中ILK、FAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)正常宮頸組織、CIN組織、CSCC組織中ILK和FAK蛋白的表達(dá)取正常宮頸組織、CIN組織和CSCC組織，40 g·L-1多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片(厚度約為5 μm)，置于40 ℃溫水中，待組織受熱展開，應(yīng)用載玻片撈起，植入37 ℃溫箱中烘干；二甲苯、梯度乙醇脫蠟與水化處理；微波抗原修復(fù)，胰蛋白酶消化；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗3次，每次5 min；滴加體積分?jǐn)?shù)4 %羊血清封閉30 min；滴加一抗(滴度1100)，4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗(滴度1200)，孵育30 min；PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染；脫水，透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。ILK、FAK蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)，黃色、棕黃色、棕褐色。高倍鏡下(×200)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用半定量方法判斷，根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陽性細(xì)胞率<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色計(jì)0分，黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。以陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分的乘積為最終綜合評(píng)分，綜合評(píng)分≥5判定為陽性(+)，<5分判定為陰性(-)。

2 結(jié)果

2.1 正常宮頸組織、CIN組織和CSCC組織中ILK、FAK mRNA表達(dá)比較結(jié)果見表1。CIN組織和CSCC組織中ILK、FAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常宮頸組織，CSCC組織中ILK、FAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于CIN組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 正常宮頸組織、CIN組織和CSCC組織中ILK、FAK mRNA的表達(dá)比較

2.2 正常宮頸組織、CIN組織和CSCC組織中ILK、FAK蛋白表達(dá)比較正常宮頸組織中ILK、FAK蛋白陽性表達(dá)率分別為6.67%(2/30)、3.33%(1/30)，CIN組織中ILK、FAK蛋白陽性表達(dá)率分別為63.33%(19/30)、56.67%(17/30)，CSCC組織中ILK、FAK蛋白陽性表達(dá)率分別為85.00%(51/60)、71.67%(43/60)；CSCC組織中ILK、FAK蛋白陽性表達(dá)率顯著高于CIN組織和正常宮頸組織，CIN組織中ILK、FAK蛋白陽性表達(dá)率顯著高于正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 ILK和FAK蛋白表達(dá)與CSCC臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表2。ILK和FAK蛋白表達(dá)與CSCC的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而ILK和FAK蛋白表達(dá)與CSCC患者年齡無關(guān)(P>0.05)。

表2 ILK和FAK蛋白表達(dá)與CSCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 ILK和FAK蛋白表達(dá)與HPV感染的關(guān)系HPV-DNA陽性者ILK蛋白陽性表達(dá)率為86.67%(65/75)，HPV-DNA陰性者ILK蛋白陽性表達(dá)率為33.33%(5/15)；HPV-DNA陽性者ILK蛋白陽性表達(dá)率顯著高于HPV-DNA陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.070，P<0.05)。HPV-DNA陽性者FAK蛋白陽性表達(dá)率為76.0%(57/75)，HPV-DNA陰性者FAK蛋白陽性表達(dá)率為20.0%(3/15)；HPV-DNA陽性者FAK蛋白陽性表達(dá)率顯著高于HPV-DNA陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.990，P<0.05)。

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，HPV是致癌過程中的主要致病因素，約70%的宮頸癌和50%的CIN 3期病變是由于HPV16或HPV18的持續(xù)感染引起的[5-7]。FAK是一種典型的多功能蛋白，其通過整合素或生長(zhǎng)因子受體將信號(hào)整合和轉(zhuǎn)導(dǎo)到癌細(xì)胞中。有研究顯示，ILK在宮頸癌組織中過表達(dá)，且與腫瘤分級(jí)、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其也是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[8]。本研究旨在探討FAK和ILK在CIN和CSCC中的表達(dá)及其與CSCC臨床病理特征、HPV感染的相關(guān)性，以期為宮頸癌的臨床診斷與治療提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，CIN組織和CSCC組織中ILK、FAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常宮頸組織，CSCC組織中ILK、FAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于CIN組織；CSCC組織中ILK、FAK蛋白陽性表達(dá)率顯著高于CIN組織和正常宮頸組織，CIN組織中ILK、FAK蛋白陽性表達(dá)率顯著高于正常宮頸組織；且ILK和FAK蛋白表達(dá)與CSCC的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；提示ILK和FAK可能參與了CSCC的發(fā)生和發(fā)展。FAK參與腫瘤血管的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，介導(dǎo)血管通透性[9-11]，F(xiàn)AK和ILK可通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B信號(hào)通路共同促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。研究顯示，高危型HPV持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致宮頸癌前病變甚至宮頸癌[12-13]。本研究結(jié)果顯示，HPV-DNA陽性者ILK、FAK蛋白陽性表達(dá)率顯著高于HPV-DNA陰性者，提示ILK和FAK蛋白表達(dá)可能與HPV感染有相關(guān)性。整合素介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，并刺激參與細(xì)胞增殖、存活和遷移的信號(hào)傳導(dǎo)，ILK在整合素、生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)AK基因被認(rèn)為是整合素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的核心基因[14-15]。

綜上所述，ILK、FAK在CSCC組織中呈高表達(dá)，且ILK和FAK蛋白表達(dá)與CSCC病變程度及HPV感染有相關(guān)性，ILK、FAK可能參與了CSCC的發(fā)生和發(fā)展，其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。