動(dòng)物負(fù)重長骨牽張成骨模型建立與評估研究進(jìn)展

宋若愚，齊新文

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬珠海醫(yī)院骨二科，廣東 珠海 519100)

牽張成骨(distraction osteogenesis,DO)是一種不需要骨移植，僅通過手術(shù)施加漸變和可控的牽張力分離2個(gè)骨段而誘導(dǎo)骨和軟組織再生的外科技術(shù)，其已被廣泛用于治療骨缺損、骨髓炎和骨畸形等[1]。目前，行DO的患者需長期攜帶外固定器，由此引發(fā)的釘?shù)浪蓜?dòng)、釘?shù)栏腥尽⒐堑V化不良、再骨折等并發(fā)癥日益突出[2]。而且，DO促進(jìn)骨和軟組織形成的潛在機(jī)制尚未完全闡明，限制了該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展[3-4]。因此，建立合適的DO動(dòng)物模型有助于深入了解組織再生的生理機(jī)制，并為DO的臨床應(yīng)用提供新思路[5]。但動(dòng)物負(fù)重長骨DO模型的建立尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，難以比較各種研究結(jié)果的優(yōu)劣[6]。本文從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和外固定器的選擇、手術(shù)及牽張方案、圍術(shù)期方案、評估方案等方面出發(fā)，對動(dòng)物負(fù)重長骨DO模型的建立與評估作一綜述，為進(jìn)一步研究牽張成骨提供參考。

1 DO實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

目前，哺乳類動(dòng)物如綿羊、犬、兔及嚙齒類動(dòng)物的股骨和脛骨在DO模型中應(yīng)用較為廣泛。大型動(dòng)物中，相對于犬類，綿羊更溫順且易于管理，應(yīng)用于負(fù)重長骨DO研究的綿羊年齡應(yīng)不小于2.5歲[7]，NIEMEYER等[8]、SCHUELKE等[9]在DO研究中均選擇使用年齡3～6歲的雌性綿羊。相比于兔，較大的哺乳動(dòng)物DO模型與人類骨骼生物學(xué)特征更為相似[10]。FLOERKEMEIER等[11]研究顯示，在DO模型中應(yīng)用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，其對骨形成的作用受所用動(dòng)物的影響較大，因此，DO研究有必要在更能代表人類行為的大型動(dòng)物中進(jìn)行[12]。膜內(nèi)骨化在大型動(dòng)物DO過程中占主導(dǎo)地位，而小型動(dòng)物DO過程中主要以軟骨內(nèi)骨化為主。在中、小型動(dòng)物DO模型研究中，體質(zhì)量2.0～4.0 kg的新西蘭、日本白兔及中國家兔均有應(yīng)用[5，13-14]。MONTES-MEDINA等[15]研究發(fā)現(xiàn)，建立兔股骨DO模型更經(jīng)濟(jì)，安置環(huán)境要求較低，手術(shù)操作簡單，且實(shí)驗(yàn)周期短。OHATA等[16]認(rèn)為，相比于骨骼缺少哈弗斯系統(tǒng)且在DO過程中對甲狀旁腺素的反應(yīng)比人類更高的大鼠，兔則與人類具有更相似的生理特性，因此，兔是研究DO的常用動(dòng)物之一，且經(jīng)濟(jì)便捷。

嚙齒類動(dòng)物負(fù)重長骨DO模型研究中，12～20周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠應(yīng)用最為廣泛[17-20]。相對于大型動(dòng)物，嚙齒類動(dòng)物有更多相關(guān)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究材料[21]。20周齡的大鼠在生理上與20～30歲人類相似[22]，隨著年齡增長，骨骼發(fā)育和修復(fù)的病理生理過程也會(huì)發(fā)生變化，使用不同年齡的大鼠進(jìn)行DO研究是否會(huì)得到類似的結(jié)果尚未知[23]。研究發(fā)現(xiàn)，性激素可能會(huì)對骨骼愈合過程產(chǎn)生潛在的影響，但尚不清楚大鼠脛骨DO模型是否因性別而產(chǎn)生不同的結(jié)果[24]。因此，在DO研究過程中，有必要關(guān)注性別和雌激素對結(jié)果的影響。

盡管兔和大鼠是DO基礎(chǔ)研究中應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物，但小鼠特別適用于基因敲除等基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[5]。CYP24A1缺失小鼠[25]、表達(dá)人類軟骨發(fā)育不全突變G380R的Fgfr3ach小鼠[26]及無病毒成年雄性C57BL/6小鼠[27]在負(fù)重長骨DO研究中均有應(yīng)用。為避免年齡對骨愈合速度的影響，用于研究DO小鼠的年齡差異應(yīng)在2周以內(nèi)[28]。但小鼠作為DO實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)，其負(fù)重長骨直徑大小是限制因素，如骨骼直徑太小，外固定手術(shù)則難以實(shí)施[5]。

綜上所述，在動(dòng)物負(fù)重長骨DO研究中，大鼠和兔在適用性方面的優(yōu)勢較為明顯，也是使用最廣泛的動(dòng)物。但需要注意的是，動(dòng)物的種屬、年齡、體質(zhì)量、性別等因素對負(fù)重長骨DO動(dòng)物的選擇至關(guān)重要[29]。與此同時(shí)，研究目標(biāo)和內(nèi)容的不同也影響著負(fù)重長骨DO實(shí)驗(yàn)動(dòng)物類型的選擇。

2 DO外固定器選擇

DO所用的外固定器構(gòu)型大致由兩側(cè)的固定模塊和中間的牽張模塊組成，型號應(yīng)與所用動(dòng)物、骨骼直徑大小及需牽張的長度相匹配，這在一定程度上決定了DO外固定器的穩(wěn)定性和最大牽張范圍。使用大、中型動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁r(shí)更易使用和開發(fā)堅(jiān)硬可控的外固定器[8]，以獲得良好的固定和DO伸展量評估。另外，DO外固定器的技術(shù)規(guī)格應(yīng)包括：(1)符合Llizarov技術(shù)規(guī)范；(2)合適的大小以允許對骨骼和周圍組織施加適當(dāng)?shù)臓恳Γ?3)能使兩側(cè)牽張骨段對齊，同時(shí)不在釘骨交界處產(chǎn)生剪應(yīng)力；(4)操作簡單，且可以量化控制骨骼牽張的長度；(5)輕量化且穩(wěn)固，生物相容性好，不影響動(dòng)物的步態(tài)；(6)可在不需要給動(dòng)物鎮(zhèn)靜的情況下持續(xù)調(diào)節(jié)牽張骨段，且可以消毒而不會(huì)被損壞[6,11]。相比于臨床使用的DO外固定器，目前大多數(shù)DO動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中均對外固定器進(jìn)行簡化，減少了中間的固定模塊[30]。

大型動(dòng)物DO研究中多選擇穩(wěn)定性更佳的環(huán)狀或半環(huán)狀外固定器，DEHGHAN等[31]在一項(xiàng)犬脛骨DO研究中使用了直徑100.0 mm的雙3/4環(huán)牽張外固定器，所有動(dòng)物均未出現(xiàn)外固定器松動(dòng)及繼發(fā)骨折等并發(fā)癥，CT及組織形態(tài)計(jì)量學(xué)也顯示出良好的骨礦化結(jié)果。POBLOTH等[7]在一項(xiàng)羊脛骨DO研究中使用了4個(gè)半環(huán)的外固定器，相比于單臂式固定器，環(huán)形外固定器可以減少屈曲和扭轉(zhuǎn)力的產(chǎn)生。在大型動(dòng)物DO模型中，屈曲和扭轉(zhuǎn)產(chǎn)生的切應(yīng)力通常會(huì)導(dǎo)致固定裝置故障，影響裝置的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響成骨方式[21]。DO的愈合機(jī)制取決于骨折的穩(wěn)定性和所用器械的剛性[8]。堅(jiān)固的固定和穩(wěn)定的環(huán)境有利于膜內(nèi)成骨，反之可能會(huì)導(dǎo)致軟骨內(nèi)成骨[32]。SHEN等[21]的一項(xiàng)大鼠脛骨骨缺損修復(fù)研究顯示，相比于膜誘導(dǎo)技術(shù)，環(huán)狀外固定器DO技術(shù)治療大段骨缺損在成骨速度方面更具優(yōu)勢，但研究觀察到軟骨內(nèi)骨化占據(jù)了DO的大部分過程，且在骨礦化方面耗費(fèi)了更多時(shí)間，這可能和使用外固定器的剛度較小有關(guān)。

對于中、小型動(dòng)物，如兔和大鼠的股骨和脛骨DO所使用的外固定器多為靈活的單臂式外固定器[12，20，24]。OHATA等[16]在兔脛骨DO的研究中直接使用Orthofix M-100人短管狀骨外固定器，影像學(xué)和生物力學(xué)結(jié)果顯示出良好的骨礦化效果。單臂式外固定器大體結(jié)構(gòu)包括兩側(cè)各由2根克氏針或半螺紋釘組成的銷釘作為固定模塊固定兩側(cè)骨塊和連接兩側(cè)固定模塊的連接桿，以及調(diào)節(jié)連接桿長度的牽張調(diào)節(jié)器[33]，其中銷釘錨定的穩(wěn)定程度至關(guān)重要，松開1個(gè)銷釘會(huì)使設(shè)備剛度降低約50%[6]。SAILHAN等[34]在兔左側(cè)脛骨DO中使用了Orthofix M-103外固定器，約14%的動(dòng)物術(shù)后發(fā)生經(jīng)銷釘孔骨折，這可能與其使用的器械有關(guān)。目前DO單臂式外固定器中兔脛骨和股骨多應(yīng)用直徑1.5～2.0 mm的銷釘，大鼠脛骨多應(yīng)用直徑0.8～1.0 mm的稍釘[2，13-14，35-36]。大鼠股骨DO所用銷釘?shù)闹睆蕉酁?.8～1.4 mm[6，17]。銷釘?shù)闹睆綉?yīng)與目標(biāo)骨的粗細(xì)相匹配，直徑過大可能會(huì)導(dǎo)致經(jīng)稍釘孔的繼發(fā)骨折，過小則容易使稍釘彎曲松動(dòng)。建立大鼠脛骨DO模型使用環(huán)形外固定器可加強(qiáng)肢體的穩(wěn)定性，但會(huì)影響動(dòng)物的步態(tài)[21，33，37]。盡管AO基金會(huì)下屬的幾家公司已經(jīng)開發(fā)出一系列標(biāo)準(zhǔn)化且穩(wěn)定性更高的設(shè)備用于小鼠等嚙齒動(dòng)物DO的研究，但目前小鼠負(fù)重長骨DO研究中尚需要開發(fā)或定制部分或全部設(shè)備[28]，其結(jié)構(gòu)與材料與傳統(tǒng)醫(yī)用外固定器差距較大。FUJIO等[5]在小鼠脛骨DO研究中開發(fā)了一種由2個(gè)不完整的丙烯酸樹脂環(huán)和4個(gè)直徑0.4 mm的銷釘構(gòu)成1個(gè)擴(kuò)張螺釘連接，其優(yōu)點(diǎn)是在輕量化的條件下與臨床常用的DO外固定器相似。WAHL等[27]將單臂式微型鈦外固定器用于小鼠脛骨DO模型，其優(yōu)點(diǎn)是滿足穩(wěn)定性的同時(shí)降低了手術(shù)難度。但將銷釘穿過小鼠脛骨遠(yuǎn)端較為困難，如果沒有足夠的骨量，銷釘容易松動(dòng)，需要足夠的熟練度和更長的手術(shù)時(shí)間[5]。LYBRAND等[28]介紹了一種小鼠股骨DO模型，與前者不同的是，其應(yīng)用鋼絲作為固定模塊通過張力捆綁技術(shù)將牽張模塊進(jìn)行固定，可以避免因骨量太少而導(dǎo)致的穿釘困難，但固定的穩(wěn)定性還需進(jìn)一步研究。

總而言之，外固定器應(yīng)根據(jù)動(dòng)物的大小和應(yīng)用部位進(jìn)行個(gè)性化的選擇，選擇合適的外固定器有助于減少DO過程中的并發(fā)癥，控制適宜的牽張速率，在不影響動(dòng)物步態(tài)的同時(shí)維持肢體足夠的穩(wěn)定性。

3 DO手術(shù)技術(shù)細(xì)節(jié)

DO過程中骨痂的形成受截骨部位和方法、周圍組織血供和軟組織狀況等因素的影響[30]。截骨位置通常位于目標(biāo)骨中段，截骨前應(yīng)將外固定器牽張模塊最大限度地打開和關(guān)閉，以確保功能正常，并提前定位鉆孔位置[16，28]。放置外固定器時(shí)確保銷釘與骨面呈90°，單臂式外固定器的銷釘應(yīng)相互平行以保證截骨后斷端對齊[17]。目前，在建立動(dòng)物負(fù)重長骨DO模型中，屈曲折斷截骨、鉆孔截骨即郵票式截骨、骨鋸直接橫斷截骨等截骨方式均有應(yīng)用[2，11，13]。無論截骨及手術(shù)方式如何，DO需要截骨端周圍良好的軟組織條件，手術(shù)過程中應(yīng)注意保護(hù)軟組織[21]。屈曲折斷截骨術(shù)盡管能最大程度地保護(hù)血供，但其骨折部位難以掌控；骨鋸直接橫斷截骨往往創(chuàng)傷較大，而郵票式截骨法則能二者兼顧[33]。郵票式截骨應(yīng)采用小直徑鉆頭，截骨中可用沖洗系統(tǒng)對截骨部位持續(xù)降溫來減少熱損傷，同時(shí)應(yīng)減少操作過程中對周圍軟組織、骨膜和髓腔的破壞[6，13，15-16，19，28]；截骨后兩側(cè)殘端進(jìn)行閉合，如為脛骨模型，應(yīng)同時(shí)截?cái)嚯韫?，不予固定[16]?？p合時(shí)盡可能縫合骨膜，如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠，可將骨膜和真皮組織一起縫合[27，35]。

4 DO術(shù)后管理及并發(fā)癥防治

因DO需長時(shí)間佩戴及調(diào)整外固定器，術(shù)后管理及并發(fā)癥防治對DO造模成功至關(guān)重要，尤其應(yīng)當(dāng)注意術(shù)后鎮(zhèn)痛、術(shù)后感染、固定器松動(dòng)、骨折等問題。MCDONALD等[17]在建立大鼠股骨DO模型過程中有28例出現(xiàn)感染、外架松動(dòng)繼發(fā)骨折等并發(fā)癥，并發(fā)癥發(fā)生率約15.6%。FUJIO等[5]在建立小鼠脛骨DO模型研究中，術(shù)后骨折與感染的發(fā)生率均為3.3%。

動(dòng)物DO術(shù)后應(yīng)安置在四壁光滑的籠子里，以防籠框鉤住外固定器導(dǎo)致動(dòng)物無法活動(dòng)或外架松動(dòng)[6，36]。動(dòng)物在麻醉清醒后手術(shù)肢體應(yīng)立即負(fù)重，并在48 h內(nèi)正常行走[6，28]。有研究認(rèn)為，綿羊在DO術(shù)后約3 d后恢復(fù)到完全負(fù)重[9]。但也有研究認(rèn)為，綿羊等大型動(dòng)物DO術(shù)后立即負(fù)重出現(xiàn)銷釘松動(dòng)的概率高于小型動(dòng)物，應(yīng)提前預(yù)防，可在術(shù)后動(dòng)物仍處于麻醉狀態(tài)下行X線檢查評估手術(shù)情況，除觀察動(dòng)物活動(dòng)和步態(tài)外，應(yīng)每日手動(dòng)檢查外固定器松緊[6-7]。為符合倫理規(guī)范，預(yù)防動(dòng)物受激而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)制定合理的術(shù)后鎮(zhèn)痛方案，術(shù)后6～12 h應(yīng)加強(qiáng)注射1次鎮(zhèn)痛藥物，并至少應(yīng)用鎮(zhèn)痛藥物至術(shù)后3 d[18，35]。POBLOTH等[7]在綿羊脛骨DO中聯(lián)合局部應(yīng)用芬太尼貼劑至術(shù)后7 d，可減少全身藥物的應(yīng)用對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響。鎮(zhèn)痛藥物選擇應(yīng)避免使用非甾體類抗炎藥，其可能會(huì)損害骨愈合[28]。感染是DO術(shù)后第1周最常見的并發(fā)癥，其主要表現(xiàn)為動(dòng)物嗜睡、拒動(dòng)、術(shù)肢切口紅腫等，偶有膿性引流[28]。預(yù)防應(yīng)用抗生素可從手術(shù)時(shí)開始，持續(xù)到術(shù)后第3天[20]。同時(shí)，從術(shù)后到最終獲取標(biāo)本前，每天需行傷口和釘?shù)雷o(hù)理1～2次，評估及消毒清潔釘?shù)揽冢缓笫褂脽o菌繃帶覆蓋環(huán)狀固定器[7，36]。如果發(fā)生感染，可嘗試抗生素治療3 d，若感染未能控制則應(yīng)對動(dòng)物實(shí)施安樂死[28]。切口開裂是股骨DO模型小鼠術(shù)后感染的常見原因，在DO過程中，外固定器會(huì)對皮膚產(chǎn)生張力導(dǎo)致切口裂開，如首次出現(xiàn)切口裂開可在麻醉下縫合切口；如再次切口裂開，可每天使用抗生素軟膏進(jìn)行切口護(hù)理，直至切口愈合[28]。

5 DO牽張方案

牽張方案由3個(gè)階段組成：(1)潛伏期，即截骨后至牽張前的時(shí)間；(2)牽張期，即在特定的速率和頻率下，在一段時(shí)間內(nèi)通過外固定器主動(dòng)牽開兩側(cè)骨段；(3)礦化期，即牽張后牽張區(qū)新生骨形成和礦化[31]。潛伏期和礦化期的長短、牽張的速率和頻率及最大長度是動(dòng)物負(fù)重長骨DO造模的關(guān)鍵參數(shù)，與動(dòng)物大小、研究目的等相關(guān)，并影響成骨方式和質(zhì)量及終點(diǎn)時(shí)間[28]。

5.1 潛伏期動(dòng)物負(fù)重長骨DO模型研究中，潛伏期跨度為3～7 d[13-14，34，38]。潛伏期的長短與動(dòng)物大小、牽張部位無明顯相關(guān)，而與初始炎癥反應(yīng)和組織愈合的需要有關(guān)[31]。潛伏期成骨細(xì)胞通過截骨部位和骨膜周圍的血管到達(dá)骨折帶，在骨折帶間內(nèi)生出與骨骼長軸平行的Ⅰ型縱向膠原纖維，為牽張期搭橋[39]。動(dòng)物DO模型研究顯示，潛伏期促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-6的表達(dá)上調(diào)，然后在潛伏期內(nèi)迅速恢復(fù)至基線水平，在牽張期開始后，白細(xì)胞介素-6表達(dá)第2次升高[40]。

總之，3～7 d潛伏期通常可使截骨端形成牽張器所需的組織條件，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理情況和日常活動(dòng)恢復(fù)到術(shù)前狀態(tài)。

5.2 牽張期

5.2.1 牽張速率牽張速率過快會(huì)導(dǎo)致骨痂內(nèi)形成囊腫或壞死組織，造成骨不連，牽張速率過慢則會(huì)導(dǎo)致過早的骨愈合，無法達(dá)到合適的長度[6]。有研究在成年羊脛骨DO模型中采用了1.25 mm·d-1的速率進(jìn)行牽張，最終脛骨延長了25 mm[11，38]。DEHGHAN等[31]在犬脛骨DO模型研究中采用 1.0、1.5 mm·d-1的牽張速率直至脛骨延長(60±3)mm，約占犬脛骨總長度的30%。KITOH等[41]在犬脛骨DO模型研究中采用0.5 mm·d-1的牽張速率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后10 d骨過早愈合，因此，牽張速率應(yīng)根據(jù)骨痂的狀態(tài)和軟組織內(nèi)的張力而調(diào)整。

OHATA等[16]在兔脛骨DO模型研究中采用0.75 mm·d-1的牽張速率，最終脛骨延長了10.5 mm，占其總長度的9.4%；另有幾項(xiàng)兔脛骨DO模型研究中采用0.1 mm·d-1的牽張速率，最終脛骨延長了10～21 mm[13-14，34]；KIM等[35]在兔脛骨DO模型研究中采用0.2 mm·d-1的牽張速率，最終脛骨延長了20 mm。MONTES-MEDINA等[15]在兔股骨DO模型研究中采用1 mm·d-1的牽張速率，最終股骨延長了15 mm，是目前兔股骨最大牽張長度。有研究顯示，在兔脛骨DO模型中，牽張速率從0.3 mm·d-1增加至0.7 mm·d-1可以促進(jìn)成骨及血運(yùn)重建，但進(jìn)一步增加至1.3 mm·d-1并不能改善最終成骨質(zhì)量[42]。有研究顯示，在兔脛骨DO模型中，2.7 mm·d-1的快速牽張會(huì)導(dǎo)致再生組織血管生成不良[36]。

在大鼠脛骨DO模型中采用0.2 mm·d-1的牽張速率，最終脛骨延長了8 mm，未發(fā)現(xiàn)過早的骨愈合[11]。?ZDEL等[36]在大鼠脛骨DO模型中采用0.8 mm·d-1的牽張速率，連續(xù)10 d，最終對骨再生的速度和質(zhì)量造成負(fù)面影響，而0.5 mm·d-1的牽張速率則表現(xiàn)出更好的結(jié)果[4，24]。KIM等[35]在大鼠脛骨DO模型中采用1.0 mm·d-1的牽張速率，最終脛骨延長了5～10 mm，均未見明顯骨缺損。在大鼠股骨DO模型中采用0.5 mm·d-1的牽張速率，最終股骨延長了7 mm，約占初始長度的16%[6，17，20]。

LYBRAND等[28]在小鼠脛骨DO模型中采用0.15 mm·d-1的牽張速率，最終脛骨延長了1.5 mm。 OSAWA等[26]在小鼠脛骨DO模型中分別以0.4 mm·d-1和0.6 mm·d-1的牽張速率延長5 d，最終新生骨段內(nèi)骨體積/組織體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明，嚙齒類動(dòng)物脛骨DO模型中，在0.4 mm·d-1的牽張速率下脛骨的延長量等效于患者在1 mm·d-1牽張速率下的延長量[25]。

由此可見，DO牽張速率與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和目標(biāo)骨的大小相關(guān)，合適的牽張速率可以避免骨過早礦化及骨不連，同時(shí)可減少對周圍軟組織的損傷。大型動(dòng)物可以使用與人相同的牽張速率，但目前仍缺少足夠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)以確定不同動(dòng)物的最佳牽張速率。

5.2.2 牽張頻率無論何種動(dòng)物，大多數(shù)DO模型研究采用每日1～2次的牽張頻率。較高的牽張頻率應(yīng)該比較低的牽張頻率更可取。此外，頻繁的小增量牽張比間斷、階梯式牽張的成骨速度更快，這種“更平滑”的牽張減少了峰值應(yīng)變，特別是在初期，應(yīng)使?fàn)繌埓碳け３衷谶m度區(qū)域內(nèi)，以避免骨生成不良[8]。DHALIWAL等[3]認(rèn)為，DO在穩(wěn)定的外固定架下使用較低的牽張頻率時(shí)膜內(nèi)骨化占主導(dǎo)地位。但目前最適宜的牽張頻率仍存在爭議，仍需進(jìn)一步研究。

5.3 礦化期礦化期骨痂的形成和骨礦化主要從牽張區(qū)的遠(yuǎn)端和近端開始，逐漸向中心區(qū)域移動(dòng)，最終完成骨連接，直到截骨端之間新形成的骨在生物力學(xué)上變得足夠堅(jiān)固，去除固定后能夠承受動(dòng)物生理機(jī)械壓力，故礦化期不需要骨骼完全重塑完畢[12，21，25]。目前研究認(rèn)為動(dòng)物DO模型礦化期通常比牽張期長2～3倍[35]。一項(xiàng)研究中，犬的脛骨延長60 mm后礦化期持續(xù)100 d，去除外固定器后所有犬均可正常活動(dòng)[31]。一項(xiàng)羊的脛骨DO模型中，脛骨牽張25 mm后礦化期持續(xù)50 d，最終的力學(xué)特性約是完好的對側(cè)肢體的50%～70%[38]。KIM等[35]研究認(rèn)為，在兔脛骨DO模型中，只有在正側(cè)位X線片上觀察到至少3/4的皮質(zhì)連接時(shí)才可移除外固定器。對大鼠脛骨DO模型的研究顯示，脛骨延長7 mm后鞏固6周骨不連發(fā)生率為23%～26%[17]。HUSSEINI等[25]對大鼠股骨DO模型研究顯示，股骨延長5 mm后，經(jīng)7周礦化期后取下外固定器，動(dòng)物可自由行走，認(rèn)為動(dòng)物在去除外固定器后新生骨痂可正常承重且無骨折發(fā)生即可證明功能性的骨再生。一項(xiàng)小鼠脛骨DO模型研究顯示，對脛骨行3.2 mm 延長并持續(xù) 28 d礦化期[5]，牽張間隙有新骨填充，但未對礦化組織進(jìn)行量化。OSAWA等[26]對小鼠脛骨DO模型的研究顯示，對脛骨行3.0 mm 延長并在礦化期第28天取出外固定器，大多數(shù)牽張的骨骼表現(xiàn)為假關(guān)節(jié)，其認(rèn)為可能是骨礦化期較短所致。HUSSEINI等[25]研究顯示，小鼠脛骨行3.0 mm延長，礦化期最長持續(xù)了40 d后所有樣本的新骨完全橋接并填充了牽張間隙。LYBRAND等[28]認(rèn)為， DO模型小鼠的骨結(jié)構(gòu)、組織學(xué)和mRNA表達(dá)完全恢復(fù)至術(shù)前狀態(tài)至少需要31～41 d。

臨床常應(yīng)用骨愈合指數(shù)(外固定時(shí)間/肢體延長長度)來評估DO礦化期，其通常超過30 d·cm-1[43]。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，礦化期的終點(diǎn)往往是指去除外固定器后新生骨的強(qiáng)度足夠滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的日?；顒?dòng)，而并不要求骨骼完全重塑完畢。同時(shí)，在基礎(chǔ)研究中，研究終點(diǎn)并不等同于礦化期的終點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)所用動(dòng)物和研究目的針對性地選擇合適的礦化期。

6 DO模型評估方案

除大體觀察外，為遵循“3Rs”動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則，需進(jìn)一步對牽張過程和再生組織進(jìn)行評估。通常采用影像學(xué)、組織學(xué)、生物力學(xué)等方法對動(dòng)物承重長骨DO模型進(jìn)行評估[19]，最好使用2種及以上方法評估骨愈合情況，恢復(fù)全骨功能的情況下，可以對全骨生物力學(xué)進(jìn)行評估[28]，評估參數(shù)可量化為建模側(cè)肢體占對側(cè)肢體未牽張骨的百分比[2，11]。

6.1 影像學(xué)評估X線檢查常用于DO手術(shù)質(zhì)量評估以及動(dòng)態(tài)監(jiān)測成骨狀態(tài)。術(shù)前可對目標(biāo)骨行X線檢查以進(jìn)行手術(shù)方案準(zhǔn)備，術(shù)后用來評估截骨兩端對位、對線及銷釘情況[28，38]。在整個(gè)DO過程中，每周可采用X線對目標(biāo)骨進(jìn)行監(jiān)測，觀察外固定器是否松動(dòng)，同時(shí)觀察目標(biāo)骨牽張間隙骨動(dòng)態(tài)愈合情況，即對兩牽張骨塊間的距離、骨形成、骨折線持續(xù)和骨重塑等方面進(jìn)行評估[2]。骨痂形成可以通過骨填充評分進(jìn)行量化，也可根據(jù)新生骨皮質(zhì)情況來評估骨愈合[17，44]。盡管X線可以粗略地通過像素來分析骨礦化量，但難以精確量化[13，35]。對再生骨的骨礦含量和骨密度進(jìn)行定量分析可以借助雙能量X射線吸收測定術(shù)或外周骨定量計(jì)算機(jī)斷層掃描術(shù)[16，38]。應(yīng)用外周骨定量計(jì)算機(jī)斷層掃描術(shù)和微型計(jì)算機(jī)斷層成像還可根據(jù)不同的灰度閾值對圖像賦值重建，從而對目標(biāo)骨的骨體積和組織體積進(jìn)行量化[19，24]，并用骨體積/組織體積表示礦化組織占比，也能對包括皮質(zhì)骨面積、內(nèi)膜周長和厚度在內(nèi)的皮質(zhì)骨信息以及骨小梁的厚度、間距和數(shù)量等進(jìn)行評估[13，16，35]?；贑T圖像的有限元分析建立一個(gè)在DO過程中對牽張骨痂的硬度進(jìn)行動(dòng)態(tài)的活體測量模型，可以行無創(chuàng)化新生骨力學(xué)評估，從而為全骨功能恢復(fù)及移除外固定器的時(shí)間提供參考[12]。

6.2 生物力學(xué)評估評估骨痂的力學(xué)特性對于考察DO過程的演變極其重要。骨痂內(nèi)組織硬度的增加代表著目標(biāo)骨的機(jī)械穩(wěn)定性增強(qiáng)，有助于確定愈合終點(diǎn)和改進(jìn)治療策略[12]。在DO動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，評估骨痂力學(xué)性能的最常用方法是終點(diǎn)時(shí)間節(jié)點(diǎn)處死動(dòng)物后24 h內(nèi)使用整個(gè)標(biāo)本進(jìn)行力學(xué)測試,包括三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)、四點(diǎn)彎曲試驗(yàn)、扭轉(zhuǎn)測試和壓縮測試[13，33，35]。三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)和四點(diǎn)彎曲試驗(yàn)可以對骨痂斷裂前的吸收能量(失效能量)、使骨痂斷裂的峰值力(極限載荷)以及載荷-變形曲線線性部分的斜率(彈性模量)參數(shù)進(jìn)行量化評估[4]。扭轉(zhuǎn)測試可以評估最大扭矩、扭轉(zhuǎn)角，從而計(jì)算新生骨的抗扭強(qiáng)度及剛度[14]。壓縮測試可以對新生骨段的垂直抗壓強(qiáng)度進(jìn)行量化。FLOERKEMEIER等[45]對綿羊脛骨DO模型進(jìn)行壓縮測試、四點(diǎn)彎曲試驗(yàn)和扭轉(zhuǎn)測試進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，在對綿羊脛骨DO模型的生物力學(xué)評估中，扭轉(zhuǎn)測試的性能略優(yōu)于壓縮測試和四點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。FLOERKEMEIER等[11，38]在綿羊脛骨DO模型上應(yīng)用環(huán)狀外固定器，通過連接外固定器遠(yuǎn)端雙環(huán)上的帶有縱向可變差動(dòng)變壓器和稱重傳感器的特殊夾具，可在礦化期對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行活體扭轉(zhuǎn)剛度的動(dòng)態(tài)測量。MEYERS等[46]在綿羊脛骨橫向DO的外固定器上設(shè)計(jì)了一種傳感器來評估牽張過程中力的大小，這種方法排除了動(dòng)物活動(dòng)時(shí)出現(xiàn)瞬時(shí)應(yīng)力的干擾。

6.3 組織學(xué)評估組織學(xué)方法除常規(guī)蘇木精-伊紅染色外，DO模型靜態(tài)組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析中常用到一些特殊的骨和周圍組織染色方案[14，20]。藏紅花O染色和固綠染色可用于檢測軟骨成分[19，26，35]；Masson Trichrome染色可對膠原纖維進(jìn)行區(qū)分[33]；Von kossa和茜素紅染色可通過礦化結(jié)節(jié)顯示礦化骨[15]；Trap染色可用來標(biāo)記破骨細(xì)胞[26]；Goldner Trichrome染色可對礦化骨、類骨質(zhì)及軟骨進(jìn)行區(qū)分，由圖像分析軟件對骨體積/牽張面積、類骨質(zhì)體積/牽張面積、骨體積/組織體積、類骨質(zhì)體積/組織體積、類骨質(zhì)體積/骨體積等參數(shù)進(jìn)行評估[47]。組織學(xué)評估一般多采用復(fù)合染色，SHEN等[21]采用McNeal′s Tetrachrome染色、甲苯胺藍(lán)O染色和堿性品紅染色對目標(biāo)骨進(jìn)行染色觀察，礦化骨組織呈粉紅色，而未礦化組織呈淡藍(lán)色。與靜態(tài)評估不同，在礦化期不同時(shí)間注射鈣黃綠素和二甲酚橙可最終通過動(dòng)態(tài)組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測量評估新骨形成的速率[19，24]。

7 結(jié)語

選擇合適的DO動(dòng)物模型至關(guān)重要，本研究綜述了目前國內(nèi)外可用于DO研究的動(dòng)物模型及評估方案，為科研人員提供了更多的選擇空間。動(dòng)物負(fù)重長骨DO模型建立中的各種參數(shù)如外固定器類型、牽張長度、牽張速率、礦化期、施加于牽張骨痂上的機(jī)械應(yīng)力類型等均會(huì)影響骨修復(fù)[6]。DO與骨折修復(fù)有不同的骨化機(jī)制、時(shí)機(jī)及促進(jìn)骨修復(fù)或再生的信號，在選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型進(jìn)行研究時(shí)需要考慮這些差異并選擇合適的評估方法[39]。