高效液相色譜法測定運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品中黃曲霉毒素M1方法研究

戴云華，祁 奇

（常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇常州 213000）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，是曲霉菌等菌類的高毒代物。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）定為Ⅰ類致癌物，能使人體或動(dòng)物的免疫功能喪失，誘導(dǎo)畸形、癌癥的發(fā)生[1]。黃曲霉毒素M1的毒性和致癌性與黃曲霉毒素B1相當(dāng)，因此含有黃曲霉毒素M1的牛奶危害很大[2]。多數(shù)政府機(jī)構(gòu)都對人體和動(dòng)物可攝入的黃曲霉毒素量有嚴(yán)格的法規(guī)限制。很多國家已經(jīng)對牛奶和乳制品中的黃曲霉毒素M1含量有了明確的限量標(biāo)準(zhǔn)[3]。

運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品是為滿足運(yùn)動(dòng)人群的生理代謝狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)能力及對某些營養(yǎng)成分的特殊需求而專門加工的食品。為了滿足營養(yǎng)補(bǔ)給，一般的代餐和蛋白棒中的主蛋白粉基本是濃縮乳清蛋白粉、濃縮牛奶蛋白粉等。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了乳及乳制品、含乳特殊膳食用食品、運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品等各類別中AFM1的限量，但在《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測定》（GB 5009.24—2016）中并沒有涉及到運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品中AFM1的檢測方法。本文通過甲醇提取，由免疫親和柱凈化為前處理手段，氮吹復(fù)溶后通過液相色譜熒光檢測器檢測，建立了操作簡單、靈敏度高、可廣泛推廣的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.3 μg/mL），浙江農(nóng)科院；黃曲霉毒素M1免疫親和柱，上海必諾檢測技術(shù)服務(wù)有限公司；甲醇、乙腈，默克股份兩合公司；乳清蛋白棒，杭州衡美食品科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20ADXR高效液相色譜儀（帶熒光檢測器），島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司；Waters Symmetry C18色譜柱，沃特世科技（上海）有限公司；FOTECTOR PLUS全自動(dòng)固相萃取儀，?？萍瘓F(tuán)股份有限公司；CP513電子天平（千分之一），奧豪斯儀器（常州）有限公司；高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TurboVap LV氮吹儀，拜泰齊貿(mào)易（上海）有限公司；渦旋儀，德國IKA。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)液配制

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲(chǔ)備液（10.3 μg/mL）用乙腈稀釋成40 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液12.5 μL、25.0 μL、50.0 μL、125.0 μL、250.0 μL、500.0 μL及1 250.0 μL至10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，配制成0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL和5.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：甲醇+乙腈（1∶1），流動(dòng)相B：水；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；熒光檢測波長：激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長430 nm；進(jìn)樣體積：50 μL。

1.3.3 樣品前處理

（1）提取。稱取1 g粉碎均勻的乳清蛋白棒（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入4 mL 50 ℃熱水渦旋混勻。加入10 mL甲醇，渦旋3 min。置于4 ℃、6 000 r/min下離心10 min。用玻璃纖維濾紙過濾至澄清。移取4.0 mL樣品提取液至50 mL離心管中，用40 mL水稀釋，混勻備用。

（2）凈化。將上述樣液以約1 mL/min的速度注入免疫親和柱內(nèi)，帶樣液滴完后，用10 mL水淋洗親和柱，真空抽干親和柱，然后用2 mL甲醇以1 mL/min的速度洗脫，收集全部洗脫液至刻度試管中。該步驟用了兩種方法：①固相萃取儀，在設(shè)置凈化方法時(shí)需注意上樣的速度，上樣后需清洗注射器，淋洗速度也要慢；②手動(dòng)過柱，同樣需要注意上樣和淋洗的速度，經(jīng)比對，回收率相差不大。固相萃取儀更方便，效率高。

（3）氮吹復(fù)溶。在50 ℃下氮?dú)饩従彽貙⑸鲜鱿疵撘捍抵良s0.5 mL，加入流動(dòng)相復(fù)溶定容至1 mL，渦旋30 s溶解殘留物，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜儀分析。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。注意氮吹時(shí)不能吹干，以免造成AFM1的流失。復(fù)溶后要混勻。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)檢驗(yàn)，空白實(shí)驗(yàn)和樣品乳清蛋白棒中的黃曲霉毒素M1均為陰性。黃曲霉毒素M1標(biāo)樣的液相色譜圖見圖1。

圖1 黃曲霉毒素M1的液相色譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

配制的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度為0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL和5.00 ng/mL，以黃曲霉毒素M1濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=34 616X-68.307，R2=1。見圖2。

圖2 黃曲霉毒素M1的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.3 檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲(chǔ)備液稀釋成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為0.10 ng/mL、0.07 ng/mL、0.05 ng/mL和0.02 ng/mL，并進(jìn)樣分析，以3倍信噪比作為檢出限，得出黃曲霉毒素M1的檢出限為0.07 μg/kg。

2.4 精密度

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1 ng/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果分別為0.980 ng/mL、0.977 ng/mL、0.986 ng/mL、0.988 ng/mL、0.978 ng/mL及0.979 ng/mL，黃曲霉毒素M1的RSD值為0.463%，表示精密度良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿意。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取試樣加標(biāo)（加入濃度為3.5 ng/mL的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL），換算值為0.35 μg/kg，按照上述檢驗(yàn)方法檢測分析，測定6平行，結(jié)果分別為0.339 6 μg/kg、0.332 8 μg/kg、0.336 0 μg/kg、0.346 6 μg/kg、0.329 2 μg/kg 及 0.336 1 μg/kg， 黃 曲 霉 毒 素 M1的RSD為1.78%，可見重復(fù)性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿意。

2.6 回收率試驗(yàn)

取樣品（樣品空白顯示陰性）1 g，加入濃度為3.5 ng/mL的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL（換算值為0.175 μg/kg、0.350 μg/kg、1.750 μg/kg），檢測結(jié)果見表1，平均回收率為96.78%，從而可以看出此方法可以滿足檢測要求。

表1 回收率檢驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述的重復(fù)性試驗(yàn)用試樣，6 h進(jìn)樣一次分析，記錄峰面積，結(jié)果顯示，在24 h之內(nèi)，峰面積相差不大，判定黃曲霉毒素M1的化學(xué)性質(zhì)基本穩(wěn)定。

3 結(jié)果與討論

該研究方法基于免疫親和柱對黃曲霉毒素吸附的專一性，在原始的HPLC方法上加以優(yōu)化改進(jìn)，找到最合適的凈化和分離條件，利用HPLC的良好分離效果，達(dá)到了靈敏、準(zhǔn)確的檢測效果[4]。原標(biāo)準(zhǔn)中洗脫用的是4 mL乙腈，再氮?dú)獯抵两?，乙腈相對來說毒性比較大，氮吹至干的操作會(huì)直接影響最終測定結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。經(jīng)研究證明，用2 mL甲醇進(jìn)行洗脫即可將黃曲霉毒素M1洗脫完全，氮吹也不能吹干，控制在0.5 mL左右，復(fù)溶至1 mL，結(jié)果證明測定結(jié)果較準(zhǔn)確，回收率較高。本文建立了測定運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品中黃曲霉毒素M1的高效液相色譜法，前處理并不復(fù)雜，熒光檢測器靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好，回收率高，是可切實(shí)推廣的HPLC標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。