HLA-DQ單核苷酸多態(tài)性與嬰兒牛奶蛋白過(guò)敏的相關(guān)性分析

李才學(xué)　　余楚烈　　何佳

[摘要] 目的 分析HLA-DQ單核苷酸多態(tài)性與嬰兒牛奶蛋白過(guò)敏（CMPA）的相關(guān)性。 方法 回顧性收集杭州市兒童醫(yī)院2020年1～8月確診的80例CMPA患兒（CMPA組）和80名健康嬰兒（對(duì)照組）為研究對(duì)象，統(tǒng)計(jì)兩組基本臨床信息;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析HLA-DQ單核苷酸多態(tài)性;采用多因素logistic回歸分析探討CMPA的危險(xiǎn)因素。 結(jié)果 本研究共納入160例嬰兒進(jìn)行分析，CMPA組嬰兒純母乳喂養(yǎng)時(shí)間顯著短于對(duì)照組，而家族過(guò)敏史和HLA-DQA1基因頻率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）;多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，有家族過(guò)敏史（OR=2.99，95%CI：1.721～15.193）和HLA-DQA1基因型（OR=10.412，95%CI：5.010～21.636）是嬰兒發(fā)生CMPA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，純母乳喂養(yǎng)時(shí)間≥4個(gè)月是兒童發(fā)生CMPA的保護(hù)因素（OR=0.405，95%CI：0.306～0.775）。 結(jié)論 HLA-DQ單核苷酸多態(tài)性與嬰兒CMPA的發(fā)生有相關(guān)性，HLA-DQA1基因型可能是CMPA的易感基因型。

[關(guān)鍵詞] HLA-DQ;單核苷酸多態(tài)性;牛奶蛋白過(guò)敏;相關(guān)性分析

[中圖分類號(hào)] R512.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）08-0004-04

Correlation between HLA-DQ single nucleotide polymorphism and infant cow′s milk protein allergy

LI Caixue1? YU Chulie1? HE Jia2

1.Department of Pediatrics， Hangzhou Children′s Hospital， Hangzhou? ?310003，China;2.Department of Dermatology， Hangzhou Children′s Hospital， Hangzhou? ?310003，China

[Abstract] Objective To analyze the correlation between HLA-DQ single nucleotide polymorphism and infant cow′s milk protein allergy （CMPA）. Methods Eighty infants with CMPA （the CMPA group） and 80 healthy infants （the control group） who were diagnosed in Hangzhou Children′s Hospital from January to August 2020 were retrospectively collected as the research subjects， and the basic clinical information of the two groups was statistically analyzed. HLA-DQ single nucleotide polymorphism was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR.The risk factors of CMPA were analyzed by multivariate logistic regression analysis. Results A total of 160 infants were included in this study. The duration of exclusive breastfeeding in the CMPA group was significantly shorter than that in the control group， and the family history of allergy and the frequency of HLA-DQA1 gene were significantly higher than those in the control group （P<0.05）. Multivariate logistic regression analysis showed that the family history of allergy（OR=2.99，95%CI： 1.721-15.193） and HLA-DQA1 genotype（OR=10.412，95%CI：5.010-21.636） were independent risk factors for CMPA in infants， and exclusive breastfeeding≥4 months was a protective factor for CMPA in children （OR=0.405，95%CI： 0.306-0.775）. Conclusion HLA-DQ single nucleotide polymorphism is associated with the occurrence of infant CMPA， and HLA-DQA1 genotype may be the susceptibility genotype of CMPA.

[Key words] HLA-DQ; Single nucleotide polymorphism （SNP）; Cow′s milk protein allergy （CMPA）; Correlation analysis

牛奶蛋白過(guò)敏（cow′s milk protein allergy，CMPA）是兒童常見的過(guò)敏性疾病之一，其主要引起患兒產(chǎn)生皮膚和消化系統(tǒng)等不良癥狀，且隨著患兒年齡的增長(zhǎng)可引起過(guò)敏性鼻炎和支氣管哮喘[1-2]。引起兒童發(fā)生CMPA的因素有很多，其中遺傳因素為主要因素之一[3]。人類白細(xì)胞抗原（HLA）基因是一組位于人類6號(hào)染色體上的基因復(fù)合體，是目前發(fā)現(xiàn)的人類最富多態(tài)性的基因群，其功能與人體免疫密切相關(guān)[4-5]。HLA-DQ是HLA基因的一個(gè)亞區(qū)，有研究顯示，對(duì)哮喘患者的HLA-DQ進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HLA-DQ基因在哮喘發(fā)病機(jī)制中有明確的顯現(xiàn)，表明其與哮喘的發(fā)病存在一定的關(guān)聯(lián)性[6]。目前關(guān)于HLA-DQ基因在牛奶蛋白過(guò)敏中的作用還未見報(bào)道，但是有研究顯示，對(duì)3000多例日本小麥水解蛋白過(guò)敏患者進(jìn)行HLA-DQ基因分析，發(fā)現(xiàn)HLA-DQA1與小麥水解蛋白過(guò)敏具有顯著的相關(guān)性[7]?；谝陨涎芯窟M(jìn)展，筆者推測(cè)HLA-DQ可能與CMPA也存在一定的關(guān)聯(lián)性，因此本研究選取HLA-DQA1和HLA-DQA2兩個(gè)基因位點(diǎn)，以探討HLA-DQ單核苷酸多態(tài)性與嬰兒牛奶蛋白過(guò)敏的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取杭州市兒童醫(yī)院兒內(nèi)科2020年1～8月就診的80名CMPA兒童作為病例組（CMPA組），另選80例既往無(wú)過(guò)敏史且身體健康體檢的兒童作為對(duì)照組;本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且已取得患兒家屬知情同意。

1.2 CMPA診斷標(biāo)準(zhǔn)

本研究中對(duì)嬰兒牛奶蛋白過(guò)敏的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2013版“中國(guó)嬰幼兒牛奶蛋白過(guò)敏診治循證建議”[8]，在嬰兒接觸牛奶過(guò)敏源后，突發(fā)蕁麻疹、口腔過(guò)敏等癥狀或者遲發(fā)性胃腸道癥狀，可結(jié)合嬰兒病史和家族史確診為IgE介導(dǎo)的CMPA。采用免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)患兒特異性IgE抗體（CM-sIgE），當(dāng)CM-sIgE≥0.35 IU/ml時(shí)，即為結(jié)果陽(yáng)性。對(duì)所有疑似牛奶蛋白過(guò)敏的患兒進(jìn)行干擾排除，具體方法為：①若嬰兒為母乳喂養(yǎng)，則母親禁止接觸牛奶蛋白等相關(guān)產(chǎn)品;②若為非母乳喂養(yǎng)，則以深度水解蛋白奶粉或氨基酸奶粉代替;③若為母乳和奶粉混合喂養(yǎng)，則母親禁止接觸牛奶蛋白等相關(guān)產(chǎn)品的同時(shí)，嬰兒采用深度水解蛋白奶粉或氨基酸奶粉喂養(yǎng)。若嬰兒過(guò)敏癥狀無(wú)明顯改善，則排除CMPA診斷。對(duì)診斷有所改善的嬰兒采用口服牛奶激發(fā)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，則確診為CMPA。牛奶激發(fā)試驗(yàn)：一滴牛奶滴在嬰兒嘴唇，并逐漸增加牛奶用量，分別為1.0、3.0、10、30、50、100、200 ml。增量間隔時(shí)間20～30 min，并做好癥狀記錄。若試驗(yàn)過(guò)程中嬰兒出現(xiàn)之前過(guò)敏相同癥狀，則可確診為CMPA，若未見明顯癥狀，則繼續(xù)觀察72 h，避免漏診[9]。

1.3 資料收集

通過(guò)本院兒內(nèi)科和兒童保健科門診問診的方式，收集160例納入樣本的年齡、性別、是否早產(chǎn)兒、是否低出生體重兒、出生方式、純母乳喂養(yǎng)時(shí)間和家族過(guò)敏史等信息。

1.4 DNA提取

采用EDTA抗凝管于清晨采集CMPA組和對(duì)照組空腹外周血2 ml，并使用南京建成生物有限公司生產(chǎn)的人血全基因組DNA提取試劑盒提取全基因組DNA，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HLA-DQ基因分型

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）對(duì)HLA-DQ基因分型分析，本研究選擇兩種最具代表性的兩個(gè)基因型HLA-DQA1和HLA-DQA2，通過(guò)RT-PCR對(duì)兩種基因型進(jìn)行鑒定。實(shí)時(shí)定量反應(yīng)體系為：模板DNA3.25 μl，SYBR Green qPCR SuperMix 16.25 μl，正向引物3.25 μl，反向引物3.25 μl，DEPC水6.5 μl，總共32.5 μl。反應(yīng)條件為：95℃，10 min;95℃，10 s;60℃，30 s;72℃，20 s;共40個(gè)循環(huán)。PCR引物設(shè)計(jì)為：HLA-DQA1：正向引物5′-CATGCGTAGCAAGCT-CGCGACTG-3′，反向引物5′- CATGCGTAGCAAGCT-CGCGACTA -3′;HLA-DQA2：正向引物5′-CTTGGGATGCTACCAGCCGTCAG-3′，反向引物5′- CTTGGGATGCTACCAGCCGTCAA-3′。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，危險(xiǎn)因素分析采用logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床基本資料比較

2020年1～8月來(lái)杭州市兒童醫(yī)院門診就診的兒童中，共有166例CMPA疑似病例，經(jīng)過(guò)干擾排除和口服牛奶激發(fā)試驗(yàn)后，確診CMPA患兒104例，經(jīng)患兒家屬知情同意，愿意抽血并納入CMPA病例組的共80例，同時(shí)選取80名既往無(wú)過(guò)敏史且身體健康體檢的兒童作為對(duì)照組。通過(guò)比較CMPA組和對(duì)照組兒童發(fā)現(xiàn)，兩組兒童的性別、年齡、是否早產(chǎn)、是否低出生體重、出生方式比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;但兩組兒童的純母乳喂養(yǎng)時(shí)間和家族過(guò)敏史比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 CMPA組與對(duì)照組HLA-DQ基因分型比較

HLA-DQ是目前人類發(fā)現(xiàn)最富多態(tài)性的基因群，因此，本研究選擇兩種最具代表性的兩個(gè)基因型HLA-DQA1和HLA-DQA2。通過(guò)比較CMPA組和對(duì)照組兒童發(fā)現(xiàn)，兩組兒童基因型HLA-DQA2比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但兩組兒童在基因型HLA-DQA1比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 兒童發(fā)生CMPA影響因素的logistic回歸分析

以是否發(fā)生CMPA為因變量，以單因素分析有意義的變量為自變量（否=0，是=1）進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示純母乳喂養(yǎng)時(shí)間≥4個(gè)月是兒童發(fā)生CMPA的保護(hù)因素，有家族過(guò)敏史和有HLA-DQA1基因型是兒童發(fā)生CMPA的危險(xiǎn)因素。見表3。

3 討論

食物過(guò)敏是一個(gè)日益嚴(yán)重的世界性健康問題，因?yàn)槠浒l(fā)病率越來(lái)越高和潛在的生命威脅，且缺乏有效的預(yù)防治療。嬰兒和學(xué)齡前兒童食物過(guò)敏的患病率在日本為5%～10%，在英國(guó)為4.4%～5.3%，在美國(guó)為7.6%[10]。食物過(guò)敏對(duì)許多受試者來(lái)說(shuō)是終生負(fù)擔(dān)，目前尚無(wú)有效的治療方法[11]。大多數(shù)食物過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏源包括相對(duì)食用較少的食物，如牛奶、雞蛋、花生、堅(jiān)果、海鮮、貝類、大豆和小麥等[12]。食物過(guò)敏被認(rèn)為是由遺傳和環(huán)境因素引起[13]。目前對(duì)食物過(guò)敏的基因研究主要都集中在花生過(guò)敏方向，據(jù)報(bào)道，HLA區(qū)域內(nèi)的變異與花生過(guò)敏和自我報(bào)告的對(duì)蝦和桃子的過(guò)敏反應(yīng)有關(guān)[14]。牛奶是世界上消費(fèi)最廣泛的食品之一，牛奶中的牛奶蛋白被發(fā)現(xiàn)與各種疾病有關(guān)，如牛奶蛋白過(guò)敏等[15]。然而，目前的研究中很少進(jìn)行牛奶過(guò)敏的遺傳學(xué)研究，導(dǎo)致牛奶過(guò)敏性疾病的發(fā)病機(jī)制還不清楚，增加預(yù)防難度和臨床治療的風(fēng)險(xiǎn)。本研究將從基因多態(tài)性的角度，分析相關(guān)過(guò)敏基因與牛奶蛋白過(guò)敏發(fā)生的相關(guān)性，為牛奶蛋白過(guò)敏的防控提供參考。

多數(shù)過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生是由于機(jī)體在接觸過(guò)敏源后，體內(nèi)過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)造成的。輔助性T細(xì)胞1（Th1）與輔助性T細(xì)胞2（Th2）免疫功能的不平衡是導(dǎo)致發(fā)生CMPA的主要原因之一[16]。由于外在因素的影響，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)Th2細(xì)胞數(shù)量大量增殖，從而導(dǎo)致具有免疫應(yīng)答抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量減少，同時(shí)功能受損[17]。Th2細(xì)胞因子大量分泌，使IgE抗體合成增加，因而加劇機(jī)體過(guò)敏炎癥反應(yīng)，最終引起多器官、多臟器的過(guò)敏反應(yīng)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)CMPA組兒童的家族過(guò)敏史比例顯著高于對(duì)照組，這在一定程度上也可以反映CMPA的發(fā)病具有遺傳特性，表明遺傳因素可能會(huì)導(dǎo)致兒童發(fā)生CMPA的風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究分析了兩組兒童純母乳喂養(yǎng)的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)CMPA組純母乳喂養(yǎng)時(shí)間小于4個(gè)月的比例顯著高于對(duì)照組，表明母乳喂養(yǎng)在嬰幼兒生長(zhǎng)過(guò)程中的重要性，持續(xù)一定時(shí)間的母乳喂養(yǎng)，可有效減少兒童發(fā)生過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn)。

HLA基因位于人類染色體6P21上，其編碼的蛋白多達(dá)132種，已被證實(shí)與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，同時(shí)在參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。HLA-DQ是HLA基因的一個(gè)基因區(qū)，由于其與過(guò)敏性疾病發(fā)生相關(guān)而受到廣泛的關(guān)注。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DQ與機(jī)體免疫性疾病有顯著的相關(guān)性，同時(shí)與機(jī)體因過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)關(guān)系密切[19]。HLA-DQA1和HLA-DQA2是HLA家族中明確確定的與機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)的基因，有研究發(fā)現(xiàn)，由于HLA-DQA1分子在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，導(dǎo)致其在感染性疾病當(dāng)中HLA-DQA1頻率更高，導(dǎo)致機(jī)體更加易感，使得感染更加常見[20]。本研究探討HLA-DQA1和HLA-DQA2基因在CMPA和健康兒童中的分布情況，與對(duì)照組比較，CMPA組兒童HLA-DQA1基因頻率更高，而兩組HLA-DQA2基因頻率無(wú)差異。在納入單因素分析有意義的變量即純母乳喂養(yǎng)、家族過(guò)敏史和HLA-DQA1基因頻率后，進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)家族過(guò)敏史和HLA-DQA1基因是CMPA發(fā)病的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明HLA-DQA1基因可能是CMPA的易感基因。而HLA-DQA2基因頻率在兩組間無(wú)差異，表示HLA-DQA2基因可能不是CMPA的易感基因，但是后續(xù)還需要加大樣本量來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)然，本研究也存在一定的局限性和不足，比如基因的作用通常是相互作用的，應(yīng)了解HLA-DQ基因的相關(guān)作用機(jī)制及通路，進(jìn)行系統(tǒng)性研究，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性;同時(shí)應(yīng)對(duì)兒童的生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行分析，分析基因與環(huán)境的交互作用。因此在后續(xù)的進(jìn)一步研究中，將綜合考慮患兒的生活環(huán)境及體內(nèi)相關(guān)免疫因子的表達(dá)水平，為牛奶蛋白過(guò)敏的防控提供更準(zhǔn)確的建議。但本研究的結(jié)果對(duì)CMPA的遺傳因素的分析具有一定的價(jià)值，同時(shí)有助于篩查CMPA高風(fēng)險(xiǎn)兒童。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HLA-DQ可能是CMPA的易感基因型，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，同時(shí)對(duì)現(xiàn)已診斷CMPA的患兒進(jìn)行隨訪，以進(jìn)一步確定HLA-DQ是否為CMPA的易感基因型。

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（收稿日期：2021-04-01）