人多巴胺D2基因啟動子區(qū)—350A/G多態(tài)位點熒光素酶表達載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測

段朝霞　張潔元　陳魁君等

[摘要] 目的 探討人多巴胺D2（DRD2）基因啟動子區(qū)-350 bp位點單核苷酸多態(tài)性（rs1799978）對DRD2基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，為進一步揭示DRD2基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性的功能及其對創(chuàng)傷應(yīng)激障礙綜合征易患性的分子機制奠定基礎(chǔ)。 方法 以人全血基因組DNA為模板，分別擴增DRD2基因啟動子區(qū)-350 bp處分別為A或G的目的片段（-1000 bp～+168 bp），與經(jīng)過改建的報告基因空載體pmirGlo-promoter相連接，構(gòu)建啟動子區(qū)-350 bp處分別為A和G的重組熒光素酶報告基因表達載體，并通過限制性內(nèi)切酶雙酶切及測序進行鑒定，然后將構(gòu)建好并經(jīng)過鑒定的表達載體pmirGlo-promoter-A和pmirGlo-promoter-G分別與pRL-CMV瞬時共轉(zhuǎn)染人胚腎癌細胞株HEK293，48 h后檢測細胞中熒光素酶的相對表達量。 結(jié)果 雙酶切及測序結(jié)果證實，成功構(gòu)建了重組熒光素酶表達載體pmirGlo-promoter-A和pmirGlo-promoter-G；熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，pmirGlo-promoter-G的熒光素酶基因表達量顯著高于pmirGlo-promoter-A，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 成功構(gòu)建了pmirGlo-promoter-A/pmirGlo-promoter-G熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒，DRD2基因啟動子區(qū)-350 bp為G時，基因轉(zhuǎn)錄活性較高，為A時，基因轉(zhuǎn)錄活性較低，說明rs1799978多態(tài)位點由A突變?yōu)镚后，可能增強基因轉(zhuǎn)錄活性，該結(jié)果為進一步深入研究DRD2基因啟動子區(qū)-350 bp單核苷酸多態(tài)性的生物學(xué)功能奠定了實驗基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 多巴胺受體D2；啟動子區(qū)；單核苷酸多態(tài)性；熒光素酶活性

[中圖分類號] R78 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of single nucleotide polymorphism （SNP） in -350 bp （rs1799978） of Dopamine receptor D2 （DRD2） gene on transcription activity and analyze the mechanism of gene regulation. Methods The promoter region sequences of DRD2 gene A or G at site -350 bp （-1000 bp to +168 bp） were amplified using whole blood genomic DNA as template were inserted into the modified pmirGlo-promoter respectively. The recombinant vector and pmirGlo-Basic vector was co-transfected together with pRL-CMV vector containing renila luciferase reporter gene into primarily cultured HEK293. Firefly and Renila luciferase activities were analyzed 48 h later by use of Dual Luciferase reporter assay system. Results Restriction enzyme digestion and sequencing analysis confirmed the correct construction of recombinant expression vector pmirGlo-promoter-A/pmirGlo-promoter-G. The results of luciferase detection showed that the relative luciferase activity of pmirGlo-promoter-G was significantly higher than that of pmirGlo-promoter-A， the difference was statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Luciferase reporter vectors pmirGlo-promoter-A/pmirGlo-promoter-G containing two SNPs homozygotes in DRD2 gene promoter region -350 bp site are successfully constructed. The transcription activity of DRD2 gene is higher with G at site -350 bp， and lower with A at this site. And these results may be the basis to further study the effect on the susceptibility to post-traumatic stress disorder and SNP function of rs1799978.

[Key words] Dopamine receptor D2； Promoter region； Single nucleotide polymorphism； Luciferase activity

近年來，地震、臺風(fēng)、泥石流等自然災(zāi)害越來越常見，交通意外、各種局部戰(zhàn)爭和恐怖襲擊也不斷涌現(xiàn)，經(jīng)歷這些創(chuàng)傷性事件而引起的創(chuàng)傷應(yīng)激障礙綜合征（post-traumatic stress disorder，PTSD）也逐漸成為常見病和多發(fā)病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PTSD具有遺傳易感性，但遺傳機制不清。目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展、人類基因組計劃的不斷深入、各國腦科學(xué)計劃的提出和實施，為揭示PTSD等多基因疾病的遺傳易感性及其分子機制提供了可能。

多巴胺是人體內(nèi)不可缺少的神經(jīng)遞質(zhì)，在調(diào)節(jié)認知、記憶、運動及情緒等多種生物學(xué)功能中起著十分關(guān)鍵的作用，目前認為，多巴胺信號通路相關(guān)分子的基因改變與多種精神類疾病的遺傳易感性相關(guān)。多巴胺受體D2（DRD2）是最常見的一種多巴胺受體，廣泛分布于大腦的多個部位。研究證實，DRD2基因的多個多態(tài)性位點與PTSD、抑郁癥、精神分裂癥等精神類疾病的遺傳易感性相關(guān)[2-6]，是預(yù)測PTSD等精神類疾病遺傳易感性的重要候選基因。本課題組前期通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DRD2基因啟動子區(qū)-350 bp位點的A/G多態(tài)性可能改變與轉(zhuǎn)錄因子SP1的結(jié)合能力，從而可能影響DRD2基因的轉(zhuǎn)錄；且通過Pubmed文獻檢索，目前尚無關(guān)于rs1799978多態(tài)位點對PTSD遺傳易感性及其生物學(xué)功能研究的相關(guān)報道。基于此，本研究通過定基因工程技術(shù)分別構(gòu)建含-350 bp G/A多態(tài)位點的啟動子區(qū)熒光素酶表達載體，并探索該多態(tài)性位點對DRD2基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，為后續(xù)研究該多態(tài)性位點與PTSD易患性的臨床相關(guān)性及相應(yīng)的分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

經(jīng)過改造的pmirGlo-promoter質(zhì)粒（以pmirGlo為母本載體，去掉5094～5609 bp段Human phosphoglycerate kinase promoter，引入源自pAdTrack-CMV的多克隆酶切位點，改造后的pmirGlo-promoter質(zhì)粒具有Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ、Xho Ⅰ、Xba Ⅰ 4個單克隆酶切位點可用），由重慶金麥生物有限公司單佑安博士贈予；海腎熒光素酶表達質(zhì)粒pRL-SV40和雙熒光素酶報告基因試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、全血基因組DNA提取試劑盒為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；高保真DNA聚合酶、膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶購于Takara公司（大連）；限制性內(nèi)切酶Bgl Ⅱ、XhoⅠ購自NEB公司；脂質(zhì)體Lipofectine 2000TM為Invitrogen公司產(chǎn)品；DMEM、胎牛血清等細胞培養(yǎng)試劑購自Gibco；細胞系HEK293由本實驗室保存；感受態(tài)細胞E.coli DH5α由本科室自行保存；本試驗設(shè)計的所有PCR引物均由上海生物工程有限公司合成；PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒測序均由Takara公司（大連）完成。

1.2 方法

1.2.1 熒光素酶報告基因重組表達載體的構(gòu)建及鑒定 提取人全血基因組DNA，然后經(jīng)核酸定量儀定量并調(diào)整濃度至50 ng/μL，分裝后置于-70℃凍存?zhèn)溆谩８鶕?jù)人DRD2基因組序列NC-000011.9設(shè)計并合成4條擴增DRD2啟動子區(qū)序列及-350 bp位點突變的引物。rs1799978-1：5'-GAAGATCTGGGCCTGGTTTTCT TTCTGTGTGTG-3'，下劃線為上游加的Bgl Ⅱ酶切位點及保護堿基；rs1799978-2：5'-CCGCTCGAGCCGG CTGCTTGAGGCTTCC-3'，下劃線為下游加的Xho Ⅰ酶切位點及保護堿基；rs1799978-M1：5'-CACCCAGA GTAACAAGCTGTGATTGCAG-3'；帶下劃線的堿基為 -350 bp處；rs1799978-M2：5'-CTGCAATCACAGCTTGTTACTCTGGGTG-3'，帶下劃線的堿基為-350 bp處。首先以提取的基因組DNA為模板，用rs1799978-1與rs1799978-2為上下游引物，經(jīng)PCR反應(yīng)擴增，25 μL反應(yīng)體系，擴增程序為：98℃退火5 min，98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。DRD2基因啟動子區(qū)序列（-1000～+168 bp），然后將PCR擴增片段經(jīng)1.5%的凝膠電泳，如果擴增片段在1100 bp左右則用膠回收試劑盒回收目的片段，然后用T4 DNA連接酶將回收的目的片段連入至PTA2載體中，送Takara生物技術(shù)有限公司測序鑒定PCR擴增片段的序列是否正確。如果PCR擴增的目的片段序列與GenBank上DRD2基因序列一致，則用限制性內(nèi)切酶Bgl Ⅱ及Xho Ⅰ雙酶切PTA2-rs1799978，并將酶切回收的目的片段經(jīng)T4DNA連接酶連入同樣經(jīng)Bgl Ⅱ及Xho Ⅰ雙酶切回收pmirGlo-promoter空載體中，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α中，挑取陽性克隆震蕩培養(yǎng)過夜、提取重組質(zhì)粒，然后用Bgl Ⅱ及Xho Ⅰ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pmirGlo-promoter-A構(gòu)建是否成功。含突變位點的目的片段擴增則以PTA2-rs1799978質(zhì)粒為模板，以rs1799978-1和rs1799978-M1為上下游引物進行PCR反應(yīng)，擴增663 bp（-1000～ -338 bp）；以rs1799978-2和rs1799978-M2為上下游引物進行PCR反應(yīng)，擴增533 bp（-365～+168 bp）；然后再以這兩次的PCR產(chǎn)物的混合物為模板，以rs1799978-1和rs1799978-2為上下游引物，進行融合PCR反應(yīng)，擴增出-350 bp位點突變?yōu)镚的目的片段（-1000 bp到+168、-350 bp位點處為G），然后將融合PCR反應(yīng)擴增出的目的片段經(jīng)凝膠電泳及膠回收處理后連入至PTA2載體中，送Takara公司測序鑒定-350 bp處的序列突變是否成功。然后重復(fù)pmirGlo-promoter-A載體構(gòu)建及鑒定的步驟，最終得到定點突變的重組質(zhì)粒pmirGlo-promoter-G。

1.2.2 重組熒光素酶表達載體的轉(zhuǎn)染 用常規(guī)細胞培養(yǎng)試劑復(fù)蘇、培養(yǎng)HEK293細胞，經(jīng)過幾次細胞傳代，待細胞處于對數(shù)生長期時將細胞傳入48孔板，置于37℃、5%CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞融合度為80%左右時，按照Lipofectine 2000TM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將海腎熒光素酶報告基因質(zhì)粒pRL-SV40與重組質(zhì)粒pmirGlo-promoter-A和pmirGlo-promoter-G分別共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞，設(shè)3個重復(fù)孔，轉(zhuǎn)然后 48 h后收集細胞，立即采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測熒光強度（相對熒光素酶活性）。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性 從細胞培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)48 h的48孔板，棄去培養(yǎng)基，每孔細胞先用PBS洗2次，然后每孔加入200 μL細胞裂解液（passive lysis buffer，PLB），室溫放置于水平搖床上用120 r/min、搖15 min以使細胞充分裂解。收集細胞裂解液，同時用移液器上下吹打數(shù)次以充分混勻細胞裂解液，將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，冰浴放置10 min。4℃ 15 000 r/min離心5 min以去除細胞碎片，將上清即細胞裂解液再移至一新的1.5 mL EP管中，置于冰上備用。嚴格按照雙熒光報告系統(tǒng)檢測試劑盒說明書在化學(xué)發(fā)光儀上檢測Firefly和Renilla的熒光強度，最后以二者比值（F/R）為校正后的結(jié)果，每個樣品重復(fù)檢測3次，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，用單因素 ANOVA分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DRD2基因-350 bp多態(tài)位點的啟動子區(qū)熒光素酶報告基因表達載體的構(gòu)建及鑒定

以人全血基因組DNA為模板，rs1799978-1與rs1799978-2為上下游引物進行PCR反應(yīng)擴增，取擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠放于凝膠掃描儀中觀察，可見泳道1中對應(yīng)1000 bp的條帶上面有一條非常明顯的DNA條帶，與預(yù)期的1168 bp大小相符，說明該條帶可能為所需的目的片段（圖1A）。將該片段通過T4連接酶連入到PTA2測序載體中，經(jīng)測序鑒定后證實該片段序列與GeneBank上DRD2基因序列一致（圖3）。然后分別以rs1799978-1和rs1799978-M1、rs1799978-2和rs1799978-M2、rs1799978-1和rs1799978-2為上下游引物進行PCR和融合PCR，分別擴增出663、533、1168 bp的目的條帶（圖1B、C）。將經(jīng)膠回收和內(nèi)切酶Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ雙酶切后的含rs1799978 A和rs1799978 G的PCR產(chǎn)物與報告基因空載體pmirGlo-promoter用T4連接酶連接，然后經(jīng)轉(zhuǎn)化、克隆及雙酶切鑒定（圖2）、測序（圖3）等步驟證實重組熒光素酶報告基因載體pmirGlo-promoter-A和pmirGlo-promoter-G構(gòu)建成功。

2.2 熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)錄活性的測定

將重組熒光素酶表達載體pmirGlo-Promoter-A和pmirGlo-promoter-G及pRL-SV40共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，48 h后收集細胞，裂解后在化學(xué)發(fā)光儀進行熒光素酶活性檢測，以F/R比值作為結(jié)果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pmirGlo-promoter-G質(zhì)粒的細胞裂解液的相對熒光素酶活性活性顯著高于轉(zhuǎn)染pmirGlo-promoter-A質(zhì)粒的細胞裂解液[（0.0480±0.0004）比（0.0380±0.0005），P = 0.000]。見圖4。

3 討論

PTSD是指個體由于經(jīng)歷各種突發(fā)性、威脅性或災(zāi)難性事件而出現(xiàn)并長期持續(xù)存在的一類精神障礙，其主要表現(xiàn)為患者極度恐懼、害怕、無助感，且持續(xù)時間超過1個月，給患者、家庭、甚至整個社會都帶來重大的影響。目前，通過家系調(diào)查、雙生子研究、實驗動物模型等多種方法研究證實，PTSD具有遺傳易患性，也通過大量的臨床關(guān)聯(lián)研究，篩選出了不同種系人群中，可能與PTSD易患性相關(guān)的候選基因及其多態(tài)性位點，主要是神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝相關(guān)的基因，如5-羥色胺轉(zhuǎn)運體、5-羥色胺受體、多巴胺受體等。

DRD2是腦內(nèi)主要神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺信號通路的重要成員，DRD2基因位于11號染色體上，長度65.8 kb，由8個外顯子與7個內(nèi)含子組成，編碼含415個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族[7]。目前臨床上所用的多種抗精神類藥物都屬于DRD2拮抗劑類，說明DRD2在多種精神疾病的發(fā)生發(fā)展過程中有非常重要的作用。大量的研究結(jié)果證實，PTSD的遺傳易感性與DRD2基因多態(tài)性有關(guān)。研究最多、最早發(fā)現(xiàn)的基因多態(tài)性是3'端非翻譯區(qū)中的 Taq限制性片段長度多態(tài)性（rs1800497）。Comings等[8]研究后發(fā)現(xiàn)DRD2 Taq1A1多態(tài)性位點與PTSD的發(fā)生具有臨床相關(guān)性。另一個經(jīng)常報道的多態(tài)性位點是位于啟動子區(qū)-141位點的胞嘧啶的缺失/插入突變（-141C del/ins）基因多態(tài)性（rs1799732）。研究發(fā)現(xiàn)，該多態(tài)性位點可使DRD2蛋白表達水平下降[9]；且-141C插入突變頻率在日本及北歐人群中的PTSD患者較高，但在英國PTSD患者及對照組中卻無顯著性差異[10]，這種互相矛盾的結(jié)果可能是由于人群的種族不同所致，另外PTSD患者選擇方法以及對照人群不同等都可能出現(xiàn)有爭議的結(jié)果。位于DRD2基因編碼區(qū)第7外顯子的兩種同義突變 His313及Pro319多態(tài)性也常見報道。研究發(fā)現(xiàn)，編碼Pro319基因的單核苷酶多態(tài)時可降低mRNA的穩(wěn)定性而導(dǎo)致其后續(xù)的翻譯效率下降，并證實該多態(tài)性位點影響PTSD的遺傳易感性[11]；此外，最新研究顯示，DRD2基因957C/T的多態(tài)性與PTSD相關(guān)[12]。目前，雖然證實了DRD2受體的多個多態(tài)性位點與包括PTSD在內(nèi)的精神類疾病的遺傳易感性有關(guān)，但其具體的分子機制還不是特別清楚，可能與多態(tài)性位點改變了DRD2基因的mRNA穩(wěn)定性、蛋白合成，受體密度及其與多巴胺的結(jié)合能力等，從而對疾病的易感性改變。

真核生物基因表達受體內(nèi)的調(diào)控元件精細調(diào)控?；虮磉_調(diào)控決定著真核生物的細胞分化、生長和發(fā)育的全過程，根據(jù)基因表達調(diào)控發(fā)生的先后順序，可將其分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控、翻譯水平的調(diào)控以及蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控。隨著測序技術(shù)的日益發(fā)展，越來越多的基因表達調(diào)控元件被發(fā)現(xiàn)。真核生物的基因轉(zhuǎn)錄受到啟動子及增強子等多個因素的調(diào)控。啟動子區(qū)的多態(tài)位點由于它可以通過改變啟動子區(qū)與不同轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，改變基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達[13]，而影響對疾病的遺傳易感性。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)是將螢火蟲熒光素酶和海洋腸腔熒光素酶在同一管中完成檢測，通常一個報告基因作為內(nèi)對照，使另外一個報告基因的檢測均一化。檢測基因表達時，將偶聯(lián)有調(diào)控啟動子的有實驗報告基因基因的載體與內(nèi)參載體共同瞬時轉(zhuǎn)染，這樣報告基因表達活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄活性的改變相關(guān)，以快速、靈敏、簡便、穩(wěn)定地測出轉(zhuǎn)錄活性；且雙熒光素酶表達載體轉(zhuǎn)染細胞后可在熒光顯微鏡下直接觀察轉(zhuǎn)染是否成功，具有直觀性。因而是目前基因表達調(diào)控研究中最常用的一種分子生物學(xué)工具，通過測定兩種熒光素酶的相對轉(zhuǎn)錄活性，直接推測出該DNA片段在基因表達調(diào)控中的作用[14-16]。本研究采用常規(guī)PCR及定點突變的融合PCR法從人全血基因組DNA中擴增出了1168 bp的-350 bp處分別含A和G的DRD2基因啟動子序列，并將其分別克隆到pmirGlo-promoter空載體的多克隆位點中（見實驗試劑），成功構(gòu)建了-350 bp處分別含A和G多態(tài)位點的pmirGlo-promoter-G和pmirGlo-promoter-A重組熒光素酶表達載體，并用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證實，DRD2基因-350 bp處由A突變?yōu)镚后，可以顯著增強熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄活性。

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（收稿日期：2015-06-23 本文編輯：蘇 暢）