巴戟天薄層色譜鑒別用對照提取物的研制與應(yīng)用

林錦鋒　楊志業(yè)　李曼莎等

[摘要] 目的 研制薄層色譜鑒別用巴戟天對照提取物，以解決對照藥材的局限性。 方法 從原料選定、制備工藝研究、穩(wěn)定性影響因素考察等方面探討薄層色譜鑒別用巴戟天對照提取物的研究思路，并比較巴戟天對照藥材與對照提取物在薄層鑒別中的應(yīng)用結(jié)果。 結(jié)果 巴戟天薄層鑒別用對照提取物的提取條件：巴戟天粗粉加20倍70%乙醇，加熱回流提取，提取2次，每次1 h。該對照提取物替代對照藥材應(yīng)用于巴戟天及其成方制劑中的薄層鑒別效果一致。 結(jié)論 本研究制備的巴戟天薄層鑒別用對照提取物，可以替代巴戟天對照藥材用于巴戟天及其成方制劑的質(zhì)量控制分析。

[關(guān)鍵詞] 巴戟天；薄層色譜鑒別；對照提取物；質(zhì)量控制

[中圖分類號] R927.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（c）-0022-05

[Abstract] Objective To develop Morinda officinalis How reference extract for TLC to solve the limitation of reference crude herb. Methods The research strategy of Morinda officinalis How reference extract for TLC was discussed from raw material selected， preparation technology and stability influence factors. Practical results between Morinda officinalis How reference crude drug and reference extract in TLC were compared. Results The extract condition of reference extract used for TLC of Morinda officinalis How was as follows： Morindae officinalis How thick powder was heating reflux extracted with 20 flods of 70% ethanol for two times， 1 hour each time. The reference extract instead of reference crude drug used for TLC of Morindae officinalis How and its historical preparations gained the same effect. Conclusion The reference extract of Morindae officinalis How for TLC prepared by this study can replace Morindae officinalis How reference crude herb to be used for quality control analysis of Morindae officinalis How and its historical preparation.

[Key words] Morindae officinalis How； TLC identification； Reference extract； Quality control

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，為較常用的中藥，有補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用，可用于陽痿遺精、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)、小腹冷痛、風(fēng)濕痹痛、筋骨痿軟[1-5]。其以肉質(zhì)根入藥，是我國著名的四大南藥之一，在中醫(yī)藥處方中應(yīng)用廣泛，在我國南方地區(qū)以及港澳臺地區(qū)還作為常用的食療補(bǔ)品，為我國主要出口藥材之一[6]。

目前，在《中國藥典》及國家、地方的其他藥材和成藥標(biāo)準(zhǔn)中，主要采用對照藥材和中藥單體成分對照品作為薄層色譜鑒別項(xiàng)的對照物質(zhì)，這種模式存在如下局限性：①對照藥材品種有的黏度大難以粉碎均勻，粉碎后的穩(wěn)定性降低，使用量過大，前處理麻煩或提取得到的供試品溶液含多種成分黏稠而難以點(diǎn)樣等；②單體成分對照品較難獲得，價(jià)格高昂且所能控制的成分單一。中藥對照提取物價(jià)格低廉、多成分、專屬性高、穩(wěn)定性好、制備難度低，更符合中藥的自身特點(diǎn)和質(zhì)量控制要求，已經(jīng)逐步成為近年來中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究的新方向，黃芪、大黃、肉豆蔻、苦杏仁、龍膽、當(dāng)歸、川芎、七葉皂苷等中藥對照提取物得到了研制應(yīng)用[7-14]。

巴戟天屬于含糖較多，不易粉碎均勻，且按《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)提取得到的供試品溶液黏稠不易點(diǎn)樣的品種。為克服上述局限，需要研究制備巴戟天薄層鑒別用對照提取物，并使之可在巴戟天藥材及含巴戟天中成藥的薄層鑒別項(xiàng)檢測中替代巴戟天對照藥材使用。

1 儀器與試藥

樣品：巴戟天藥材樣品5批（經(jīng)廣東省食品藥品檢驗(yàn)所林錦鋒副主任中藥師鑒定均為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根），樣品信息見表1；巴戟天對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121163-201004）；喘可治注射液（廣州萬正藥業(yè)有限公司，批號：12071801）。

儀器設(shè)備：數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-300DE型）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph，LABOROTA 4003）、薄層自動點(diǎn)樣儀（Camag，ATS4）、薄層色譜成像儀（Camag，REPROSTAR 3）、電子天平（Sartorius，CP225D）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（Binder KBF115）、藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠，WD-1）。

試劑：純水、試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 原料選定

因選取的原料用途是提取薄層色譜鑒別用對照提取物，故有針對性地對收集到的5批樣品進(jìn)行性狀和薄層色譜鑒別項(xiàng)目的檢測，比較檢測結(jié)果，3號樣品綜合質(zhì)量最優(yōu)，故選取3號樣品作為研制用原料。

2.2 工藝研究

巴戟天主要含蒽醌類化合物、環(huán)烯醚萜類化合物、多糖及低聚糖類、有機(jī)酸類等成分[15-17]，研究表明，巴戟天中的蒽醌類化合物具有防治糖尿病、骨質(zhì)疏松等作用[18]，巴戟天多糖及低聚糖類具有增強(qiáng)免疫活性、抗抑郁、防治骨質(zhì)疏松和促進(jìn)雄性小鼠生精等作用[19-21]。本試驗(yàn)的工藝研究主要以蒽醌類化合物和糖類成分為考察指標(biāo)。

2.2.1 不同提取溶劑考察 采用乙酸乙酯、乙醇和水3種溶劑進(jìn)行提取試驗(yàn)，提取方法：取樣品2 g，分別以乙酸乙酯、乙醇和水3種溶劑各20 mL加熱回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)眉状? mL溶解后作為供試品溶液。將提取所得的供試品溶液分別按《中國藥典》（2010年版）一部“巴戟天”藥材標(biāo)準(zhǔn)[1]項(xiàng)下的鑒別（2）和原國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的“喘可治注射液”標(biāo)準(zhǔn)[22]項(xiàng)下鑒別（2）分別進(jìn)行蒽醌類成分薄層色譜檢測[以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.1）為展開劑，展開，晾干，置254 nm紫外光下檢視]和糖類成分薄層色譜檢測[以正丁醇-無水乙醇-水（5∶4∶1）為展開劑，展開，晾干，噴以α-萘酚試液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰]，結(jié)果表明，乙醇提取可以兼顧兩種成分類別的提取，乙酸乙酯對蒽醌類成分提取較佳，但對糖類成分提取不佳；水則對糖類成分提取較佳，而對蒽醌類成分提取不佳。因此，初步選定乙醇為巴戟天薄層色譜鑒別用對照提取溶劑。

2.2.2 不同濃度乙醇考察 取樣品5份，每份約5 g，分別以50%、60%、70%、80%、95%共5種不同濃度乙醇為溶劑各50 mL加熱回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)Q重計(jì)算提取效率，并用甲醇5 mL溶解后作為供試品溶液進(jìn)行蒽醌類成分薄層色譜檢測和糖類成分薄層色譜檢測（色譜方法均同“2.2.1”）。結(jié)果70%乙醇提取得率最高（表2），且薄層色譜效果最佳，故確定最佳提取溶劑為70%乙醇。

2.2.3 不同提取方法考察 取樣品2份，每份約5 g，各加70%乙醇50 mL，分別進(jìn)行加熱回流1 h和超聲提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)Q重計(jì)算提取得率，并用甲醇5 mL溶解后作為供試品溶液進(jìn)行蒽醌類成分薄層色譜檢測和糖類成分薄層色譜檢測（色譜方法均同“2.2.1”）。對加熱回流和超聲提取這兩種常用的提取方式進(jìn)行考察，結(jié)果加熱回流提取的得率高于超聲提?。ㄒ姳?），故采用加熱回流的提取方式。

2.2.4 正交試驗(yàn)考察優(yōu)化提取時(shí)間、次數(shù)及溶劑用量 為全面考察提取工藝條件，取樣品6份，每份5 g，以70%乙醇加熱回流提取，選擇溶劑用量（A）、提取時(shí)間（B）和提取次數(shù)（C）為考察因素，因素A的水平依次為10、15、20倍，因素B的水平依次為0.5、1、2 h，因素C的水平依次為1、2次，選用L6（32×2）正交表安排試驗(yàn)，以提取得率為考察指標(biāo)，將結(jié)果填入正交試驗(yàn)表中的結(jié)果欄內(nèi)，并進(jìn)行直觀分析和方差分析。由表4可知，RC>RA>RB，表明對提取得率的影響從大到小的順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)>溶劑用量>提取時(shí)間，最佳的試驗(yàn)方案為：20倍提取溶劑，回流提取2次，每次提取2 h。提取時(shí)間的影響最小，故結(jié)合直觀分析和實(shí)際生產(chǎn)，適當(dāng)減少提取時(shí)間為1 h，即最終確定的提取方案是巴戟天粗粉加20倍70%乙醇，加熱回流提取，提取2次，每次1 h，減壓回收溶劑至干。

2.3 批量制備

取巴戟天藥材10 kg，按確定的提取方案制備，得對照提取物4.48 kg，得率為44.8%。每克提取物相當(dāng)于2.23 g藥材。

2.4 穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn)與包裝條件確定

2.4.1 高溫、高濕和強(qiáng)光照射試驗(yàn) 取樣品按《中國藥典》（2010年版）二部附錄方法[23]進(jìn)行高溫、高濕和強(qiáng)光照射等穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn)，10 d后，從性狀看高溫條件下無明顯變化，高濕條件下樣品吸潮成稠膏狀，強(qiáng)光照射下樣品結(jié)塊且顏色變深，而薄層色譜鑒別結(jié)果均符合規(guī)定，與0 d無明顯差異。

2.4.2 氧化破壞試驗(yàn) 取本品2份，分別用5%、30%過氧化氫溶液進(jìn)行氧化破壞試驗(yàn)。在性狀方面經(jīng)氧化破壞后，2份樣品顏色均發(fā)生了明顯變化，薄層色譜鑒別結(jié)果顯示，5%過氧化氫溶液破壞后的樣品與0 d樣品無明顯差異，但30%過氧化氫溶液破壞后的樣品則與0 d樣品不一致，說明樣品在強(qiáng)氧化環(huán)境下不穩(wěn)定。

2.4.3 包裝條件的確定 上述穩(wěn)定性影響因素考察結(jié)果表明，影響巴戟天薄層鑒別用對照提取物穩(wěn)定性的主要因素有光照、濕度和氧化，包裝應(yīng)避光、密封，避免氧化和吸濕，故擬定該提取物包裝條件為棕色玻璃安瓿瓶密封包裝。

2.5 巴戟天薄層鑒別用對照提取物的應(yīng)用

2.5.1 代替《中國藥典》巴戟天藥材標(biāo)準(zhǔn)中的對照藥材 取巴戟天藥材粉末2.5 g，加水1 mL使?jié)櫇?，再加乙酸乙?0 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使之溶解后作為供試品溶液。另取巴戟天薄層鑒別用對照提取物1 g、巴戟天對照藥材2.5 g，同法分別制成對照提取物溶液和對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一塊硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果巴戟天藥材樣品、對照提取物和對照藥材色譜結(jié)果基本一致（圖1），表明對照提取物可以代替對照藥材在該鑒別中使用。

2.5.2 代替喘可治注射液標(biāo)準(zhǔn)中的對照藥材 取喘可治注射液2 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取巴戟天薄層鑒別用對照提取物0.1 g，加甲醇10 mL超聲處理30 min，濾過，濾液作為對照溶液。再取巴戟天對照藥材0.25 g，加70%乙醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL使溶解，作為對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，以正丁醇-無水乙醇-水（5∶4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以α-萘酚試液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果對照提取物和對照藥材色譜結(jié)果基本一致，喘可治注射液色譜中，在與上述兩種色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)（圖2），表明巴戟天對照提取物可以代替對照藥材在該鑒別中使用。

3 討論

3.1 巴戟天對照提取物與巴戟天對照藥材的優(yōu)劣比較

巴戟天對照藥材的制備相對簡單，但是使用時(shí)因其含糖分高而不易粉碎均勻，每次使用時(shí)的前處理較麻煩，提取得到的對照藥材溶液較黏稠、不易點(diǎn)樣。巴戟天對照提取物雖制備相對復(fù)雜，但均勻性較好，使用時(shí)前處理簡單，薄層色譜結(jié)果與對照藥材一致，既可以解決單體對照品難以獲得且價(jià)格昂貴的問題，又可以達(dá)到多指標(biāo)成分控制的目的，對巴戟天藥材或處方中含巴戟天制劑的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行都具有十分重要的意義。

3.2 巴戟天對照提取物的穩(wěn)定性

本研究已經(jīng)考察了巴戟天對照提取物的穩(wěn)定性影響因素，并據(jù)此給出了包裝條件，但對照提取物分裝后的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步進(jìn)行加速穩(wěn)定性考察或一般穩(wěn)定性考察，從而確定其合理的使用期限。

3.3 更進(jìn)一步的研究

本研究所制得的對照提取物可作為定性鑒別用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，后續(xù)擬進(jìn)一步將對照提取物的指標(biāo)性成分（如耐斯糖）的含量進(jìn)行標(biāo)定定值，并考察確定使其均勻性、穩(wěn)定性能夠滿足要求，將其制成既可用于定性又可用于定量的對照提取物，可替代高成本對照品的使用，降低標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取和純化制備的成本，從而顯著降低巴戟天藥材及其制劑的質(zhì)量控制成本。

3.4 中藥對照提取物統(tǒng)一的技術(shù)規(guī)范

目前，《中國藥典》收載的中藥對照提取物的品種數(shù)量有限，其研制工作也沒有統(tǒng)一的技術(shù)規(guī)范可依。作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的中藥對照提取物，必須具備相對穩(wěn)定的物質(zhì)組成，保證在相同條件下色譜行為的穩(wěn)定性和可重現(xiàn)性。因此，為了達(dá)到這一基本的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，必須由權(quán)威部門制訂發(fā)布相應(yīng)的指導(dǎo)原則與技術(shù)要求來指導(dǎo)和規(guī)范中藥對照提取物的研制。

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（收稿日期：2015-05-22 本文編輯：李亞聰）