抗雌激素多克隆抗體的制備及效價(jià)鑒定

盧科宇，閆冰潔，田 貞，何鳳琴，范思媛，李曉茹，常亦昆

(1.西安市秦嶺天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與抗癌類創(chuàng)新藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;西安文理學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室;西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，西安710065；2.鄭州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，鄭州 450052)

雌二醇(Estradiol，E2)是一種類固醇激素，通過(guò)卵巢顆粒細(xì)胞中的芳香化酶系統(tǒng)從睪酮中產(chǎn)生[1]，它有助于青春期和月經(jīng)周期的第二性征的發(fā)育[2]．在人類雌二醇水平的增高和降低對(duì)于卵巢等其他疾病有重要的臨床意義；在獸醫(yī)臨床則用于同期發(fā)情，而在動(dòng)物喂養(yǎng)中加入雌二醇，可以促進(jìn)生長(zhǎng)及提高畜禽瘦肉量[3]．但雌二醇在動(dòng)物組織內(nèi)的殘留問(wèn)題所帶來(lái)的危害不容忽視．雌二醇?xì)埩魰?huì)通過(guò)食物鏈危害人類健康，可能會(huì)造成女性幼兒提前發(fā)育，男性兒童乳腺發(fā)育成女性化，男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常與病變[4]．因此肉與肉制品中雌二醇的檢測(cè)成為了人類食品安全的必要措施．

本研究為建立雌二醇在肉及肉制品中的快速檢測(cè)，通過(guò)將半抗原雌二醇合成為雌二醇-3-羧甲基醚(E2-3-CME)，再通過(guò)碳二亞胺(EDC)法與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合，合成完全抗原 ( E2-BSA)．將E2-BSA免疫雌性家兔，制備出抗雌激素的多克隆抗體．通過(guò)用酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)生的多克隆抗體進(jìn)行效價(jià)鑒定．該抗體的成功制備為以后開(kāi)發(fā)動(dòng)物源性食品藥物殘留檢測(cè)新技術(shù)提供了幫助．

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

雌二醇(E2，武漢遠(yuǎn)程科技發(fā)展有限公司)；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)；牛血清白蛋白(BSA，武漢博士德)，二抗IgG (羊抗兔，武漢博士德)、弗式完全/不完全佐劑(武漢博士德)，無(wú)水二甲基亞砜，KOH，溴乙酸，乙酸乙酯，HCl，DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，甲醇，丙酮，0.01 M PBS，3%蔗糖，纖維素透析袋(源葉生物，SP131060).

1.1.1 制備0.01 M PBS

試劑配方：稱取8.0 g NaCl，0.2 g KCL，3.6 g Na2HPO4.12H2O． 0.24 g KH2PO4，加超純水900 mL，調(diào)pH至7.4后加超純水至1000 mL．

1.1.2 制備10 mg/mL BSA溶液

稱取10 mg的BSA溶于1 mL的0.01M PBS．

1.1.3 制備3%蔗糖溶液

稱取3 g蔗糖溶于100 mL的超純水．

1.2 主要儀器設(shè)備

恒溫水浴鍋(Sheldon Manufacturing)，倒置顯微鏡(OLYMPUS)，高壓蒸汽滅菌鍋(ZEALWAY)，離心機(jī)(湘儀)，振蕩器(SI Vortex-Genie)，1 mL、20 mL注射器(博士德生物公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Tek，Winooski).

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雌性家兔3只(體重2～2.5 kg)，購(gòu)自西安交大醫(yī)學(xué)院．

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 雌二醇半抗原(雌二醇-3-羧甲基醚，E2-3-CME)的制備

將300 mg(1.0 mmol)雌二醇攪拌溶于6 mL無(wú)水二甲基亞砜，再加入1 g(18 mmol)KOH粉末，攪拌5 min，上述固體完全溶解后，加入300 mg溴乙酸，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2 h，加入50 mL冰水終止反應(yīng)．加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，除去未反應(yīng)的E2，其中下層水相用2 mol/l HCl酸化，出現(xiàn)白色沉淀物，即為雌二醇-3-羧甲基醚(E2-3-CME)粗品．過(guò)濾，用雙蒸水洗滌，真空干燥2天，最終經(jīng)甲醇-丙酮重結(jié)晶，得到無(wú)色晶體即為E2-3-CME純品．

1.4.2 雌二醇完全抗原的制備

經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)獲得8 mg E2-3-CME，加入4.24 mg NHS，7.08 mg EDC，混合并溶于8 mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，避光震蕩活化反應(yīng)8 h，逐滴加入10 mg/mL BSA溶液，出現(xiàn)絮狀沉淀立即停止，4℃震蕩反應(yīng)過(guò)夜，用0.01M PBS透析三天．此時(shí)，透析袋中即為雌二醇完全抗原(E2-BSA)．雌二醇完全抗原冷凍干燥后，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.4.3 免疫動(dòng)物及免疫血清的采集

將2～2.5 kg 的清潔級(jí)雌性家兔，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，在免疫前對(duì)家兔進(jìn)行耳緣靜脈采血2 mL，并將血液經(jīng)20 000 r/min離心5 min，收集血清作為陰性對(duì)照．第二周(第一次)將0.4 mL E2-BSA，與等量的弗氏完全佐劑混合，將混合物在振蕩器上充分振蕩，使其完全乳化．在家兔背部選取 4～5個(gè)點(diǎn)，在皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射免疫動(dòng)物，第三周(第二次)和第四周(第三次)同上，但用弗氏不完全佐劑替代弗氏完全佐劑，如表1所示．在每次免疫之前先采集血清作為第一次、第二次和第三次免疫后的陽(yáng)性血清，其中第一次、第二次的陽(yáng)性血清通過(guò)耳緣靜脈采血離心后獲得，第三次陽(yáng)性血清通過(guò)心臟采血獲得，共計(jì)采血四次，一次陰性對(duì)照，三次陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)．收集后的血清，-80℃保存，備用．

表1 不同周次抗原和免疫佐劑的免疫劑量

1.4.4 通過(guò)Elisa檢測(cè)抗體血清的效價(jià)

1.4.4.1 包被抗原

抗原E2-BSA用0.01M PBS稀釋，最終濃度為1 μg/mL．稀釋完成后，在酶標(biāo)板上按每加樣孔100/μL加樣包被．加樣完成后，用封閉膜封閉加樣孔，防止蒸發(fā)并放置4℃冰箱過(guò)夜．

1.4.4.2 封閉

取出過(guò)夜處理的酶標(biāo)板，用超純水將加樣孔洗三遍，在干燥的吸水紙上拍打，拍出多余的水分．隨后向加樣孔加入1% BSA溶液，200 μL/孔，同樣用封閉膜封閉加樣孔并放置4℃冰箱過(guò)夜．

1.4.4.3 加一抗

過(guò)夜處理完成后，將酶標(biāo)板加樣孔水分甩干，將具有抗體的血清用0.01M PBS按照1：1 000的比例進(jìn)行稀釋．將稀釋后的血清和0.01 M PBS 100 μL分別加入到酶標(biāo)板的加樣孔中，加入血清的為實(shí)驗(yàn)組，加入PBS的為對(duì)照組，加樣完成后，用封閉膜封閉，放置37℃恒溫水浴鍋，孵育1 h．

1.4.4.4 加二抗

孵育完成后，用超純水洗三遍，在干燥的吸水紙上拍打，拍出多余的水分．隨后向加樣孔中加二抗IgG，每孔50 μL，用封閉膜封閉，放置37℃恒溫水浴鍋，孵育1 h．

1.4.4.5 顯色

孵育后的酶標(biāo)板，用超純水洗3次，在吸水紙上拍打，拍出多余水分．加入顯色液，100 μL/孔，用封閉膜封閉，放置37℃恒溫水浴鍋，孵育15 min．孵育結(jié)束后用50 μL/孔的1 M H2SO4終止顯色反應(yīng)．

1.4.4.6 讀取數(shù)據(jù)

將酶標(biāo)板放在酶標(biāo)儀中，在450 nm處測(cè)定OD值，讀取并記錄各加樣孔OD值．

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示．應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析，以Post Hoc法進(jìn)行組間兩兩比較，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

三只兔子經(jīng)過(guò)三次雌二醇完全抗原的免疫，三只兔子在第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值與免疫前的血清進(jìn)行比較均沒(méi)有明顯的差異(P> 0.05)，且在第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值之間也無(wú)明顯差異(P> 0.05)，但在第三次免疫后血清抗體的OD值比沒(méi)有進(jìn)行免疫和第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值均有極明顯升高(P< 0.01)(表2).

表2 不同周次免疫前后OD值的比較

表2顯示將三只兔子分別在第一次，第二次和第三次免疫后血清抗體的OD平均值分別作為實(shí)驗(yàn)的三個(gè)組，三只兔子免疫前的血清OD平均值，作為對(duì)照組進(jìn)行比較，同樣，三只兔子在第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值與對(duì)照組的血清抗體進(jìn)行比較均沒(méi)有明顯的差異(P> 0.05)，且在第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值之間也無(wú)明顯差異(P> 0.05)，但在第三次免疫后血清抗體的OD值比對(duì)照組和第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值均極明顯升高(P< 0.01)(圖1)．

圖1 三次免疫后血清抗體的OD值注：**： P< 0.01，具有極明顯差異．

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)選用雌二醇作為免疫原，雌二醇的分子量為 (272.38)，屬于小分子物質(zhì)，具有抗原性但不具有免疫原性，必須與大分子蛋白偶聯(lián)，通過(guò)大分子蛋白上的 T 細(xì)胞表位間接誘導(dǎo) B 細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)雌二醇的特異性抗體，常用的載體蛋白有BSA、雞卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HAS)等[1]，本次實(shí)驗(yàn)使用的是BSA．本實(shí)驗(yàn)不足之處是沒(méi)有在制備完完全抗原后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和鑒定．

為了增強(qiáng)免疫原性，在動(dòng)物進(jìn)行免疫之前注入免疫佐劑，簡(jiǎn)稱佐劑[5]．弗氏佐劑是將抗原水溶液與油劑(石蠟油或植物油)等量混合，再加乳化劑(羊毛脂或葉吐溫 80)制成油包水抗原乳劑，稱之為不完全弗氏佐劑．如在不完全佐劑中加入分枝桿菌(如死卡介苗)則稱為完全弗氏佐劑[5]．一般免疫動(dòng)物第一次注射用抗原+完全弗氏佐劑(比例為1∶1)，第二次，第三次等用抗原+不完全弗氏佐劑(比例為1∶1)，從免疫后的動(dòng)物獲得血清后要鑒定抗體的效價(jià)[2]．不管是用于診斷還是用于治療，制備抗體的目的都是要求較高效價(jià)．不同的抗原制備的抗體，要求的效價(jià)不一．鑒定效價(jià)的方法很多，包括有試管凝集反應(yīng)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、Elisa等[6]．Elisa法操作簡(jiǎn)便、廉價(jià)、快速、通量高，又能進(jìn)行定量測(cè)定，在抗生素、雌激素、農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[7]．在本實(shí)驗(yàn)中，注射三次E2-BSA產(chǎn)生的抗體光密度值(OD)最高，且與對(duì)照組，注射第一次和第二次產(chǎn)生的抗體的OD值均具有明顯差異．可能是抗體的產(chǎn)生具有潛伏期、對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期和下降期[8]，注射三周E2-BSA產(chǎn)生的抗體可能處在抗體產(chǎn)生的對(duì)數(shù)期，而注射一周和兩周產(chǎn)生的抗體可能處在對(duì)數(shù)期以外的其他時(shí)期，故而檢測(cè)的抗體OD有所不同．通過(guò)抗原免疫三次的家兔產(chǎn)生的抗體效價(jià)最高，可為后期通過(guò)此方法制備抗體和Elisa試劑盒奠定基礎(chǔ)．

為了保障人類的食品安全和身體健康，快速高效的檢測(cè)技術(shù)是關(guān)鍵．同時(shí)，檢測(cè)技術(shù)的完善能夠促進(jìn)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，推動(dòng)國(guó)內(nèi)的養(yǎng)殖業(yè)迅速與國(guó)際接軌[9-10]．