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    豬鏈球菌2型分離鑒定及其對小鼠的致病性分析

    2022-04-27 12:59:04劉娜于江李建達(dá)張玉玉楊靈芝任素芳叢雁芳
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:分離鑒定致病性小鼠

    劉娜 于江 李建達(dá) 張玉玉 楊靈芝 任素芳 叢雁芳

    摘要:為了解豬鏈球菌2型菌株對昆明小鼠的致病性,并建立其感染昆明小鼠模型,本試驗(yàn)分別取2頭疑似患鏈球菌病的病死豬腦組織、血液分別涂布于含5%胎牛血清的TSA固體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌分離;并對分離獲得的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)觀察、PCR鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)、小鼠致病性試驗(yàn)及組織病理切片觀察。結(jié)果顯示,分離菌為革蘭氏陽性短鏈球菌,經(jīng)PCR鑒定為豬鏈球菌2型,命名為LY株;藥敏試驗(yàn)證實(shí)LY株對青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感,對四環(huán)素、多粘菌素B、克林霉素不敏感;LY株對小鼠致死劑量為2.2×109cfu/只;組織病理切片觀察發(fā)現(xiàn)小鼠肺臟、脾臟及心肌均出現(xiàn)不同程度的病變。本研究明確了山東省豬鏈球2型毒株的毒力,為疫苗候選菌株的篩選提供了理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:豬鏈球菌2型;分離鑒定;小鼠;致病性

    豬鏈球菌(Streptococcussuis)2型是一種能夠引起人獸共患的病原菌,臨床上主要引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥和突發(fā)死亡等癥狀[1,2]。根據(jù)豬鏈球菌莢膜抗原的多樣性,可將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型(1~34型及1/2型)[3,4],其中主要致病血清型為1、2、7、9型[5,6]。1998年夏季在江蘇省部分豬群暴發(fā)豬鏈球菌2型疾病,對人畜健康造成嚴(yán)重威脅[7]。2005年夏季四川省暴發(fā)豬鏈球菌2型疾病,造成人員傷亡[8]。該菌是一種革蘭氏陽性菌,在自然界分布廣泛,不僅可以引起豬,還可以引起人、馬、牛、羊、禽等多種動(dòng)物感染[9]。人感染豬鏈球菌與職業(yè)有密切關(guān)系,但未見人與人直接傳染的報(bào)道[10]。該病多呈地方性流行,一年均可發(fā)生感染,但多暴發(fā)于4~11周齡的豬群[11,12]。

    本研究于2019年從山東省某豬場送檢的具有后肢跛行劃水樣癥狀的2頭40日齡發(fā)病仔豬中分離并鑒定出豬鏈球菌2型菌株,通過藥物敏感性試驗(yàn)確定其對藥物的敏感性。由于豬體試驗(yàn)周期長、操作不方便、費(fèi)用高、免疫抑制病等在攻毒試驗(yàn)中常常影響結(jié)果[13],而小鼠作為動(dòng)物模型費(fèi)用低、操作簡易,因此本研究采用昆明小鼠建立豬鏈球菌2型LY株感染動(dòng)物模型,以確定臨床分離株豬鏈球菌2型LY株致死劑量及毒力。

    1材料與方法

    1.1病料來源

    病料采集于2019年山東省某豬場送檢的臨床癥狀疑似豬鏈球菌2型的2頭40日齡發(fā)病仔豬,臨床表現(xiàn)后肢跛行,死前有劃水樣癥狀。

    1.2試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

    昆明小鼠,購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司;TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000DNAMarker等,購自寶生物工程(大連)有限公司;TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基,購自美國BD公司;藥敏紙片,購自O(shè)XOID公司;鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管,購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

    1.3細(xì)菌的分離純化

    取病死豬血液、腦組織分別劃線接種于含5%胎牛血清的TSA培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)18h,挑取菌落,進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。繼續(xù)傳至第三代,挑取單菌落接種于7mL含5%胎牛血清的TSB培養(yǎng)基,37℃搖床180r/min培養(yǎng)8h。

    1.4菌液PCR鑒定

    取100μL菌液進(jìn)行PCR鑒定,以CPS2J基因特異性引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增[14],擴(kuò)增目的片段為124bp。菌液PCR反應(yīng)體系(25μL):10×TaqBuffer(含Mg2+)2.5μL,dNTPs2.0μL,10μmol/L的上、下游引物各1μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,無菌水15μL,DNA模板3μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10min;95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸45s,34個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后,取5μLPCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。

    1.5生長曲線及OD600值與其活菌數(shù)相關(guān)性曲線的建立

    挑取單菌落,接種于含5%胎牛血清的TSB培養(yǎng)液中,37℃搖床180r/min培養(yǎng)12h,作為種子液。取種子液1mL,加入99mLTSB培養(yǎng)液中,37℃、180r/min培養(yǎng),分時(shí)取菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和吸光度OD600的測定,建立生長曲線及OD600值與其活菌數(shù)的相關(guān)性曲線。

    1.6藥敏試驗(yàn)

    采用藥敏紙片法檢測該細(xì)菌對臨床常用青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、多粘菌素B、克林霉素共9種藥物的敏感性,具體試驗(yàn)方法按照說明書進(jìn)行操作。

    1.7攻毒菌液制備

    挑取豬鏈球菌2型LY株凍干粉劃線接種于TSA平板(5%胎牛血清),置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~20h,作為F1代。挑取F2代單菌落,密集劃線于TSA平板(5%胎牛血清),37℃培養(yǎng)14h,沖洗菌體后,根據(jù)吸光度OD600與活菌數(shù)的線性關(guān)系,計(jì)算菌液濃度,并稀釋至所需濃度。

    1.8小鼠致病性試驗(yàn)

    將40只昆明小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只,其中3組分別腹腔注射1.1×1010、1.1×109、1.1×108cfu/mL不同梯度菌液0.2mL,另一組作為空白對照,腹腔注射PBS0.2mL,攻毒后連續(xù)觀察7d。

    1.9組織病理切片觀察

    分別將小鼠的心臟、脾臟、肺臟經(jīng)4%甲醛溶液固定后,按照常規(guī)包埋,制備石蠟切片,HE染色,鏡檢觀察。

    2結(jié)果與分析

    2.1發(fā)病仔豬剖檢結(jié)果

    2頭發(fā)病仔豬均表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎,并有纖維素性滲出,心肌內(nèi)膜黏連,關(guān)節(jié)積液,胸腔積液,脾梗死(圖1)。

    2.2細(xì)菌形態(tài)特征

    在含有5%胎牛血清的TSA平板上生長出大量透明、光滑、圓潤的小菌落。挑取疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色,顯微鏡觀察顯示為革蘭氏陽性菌,呈鏈狀(圖2)。

    2.3PCR鑒定

    取100μL菌液進(jìn)行PCR鑒定,擴(kuò)增條帶與目的條帶大小一致(圖3)。

    2.4生長曲線及OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性曲線的建立

    2.4.1生長曲線的建立 如圖4所示,豬鏈球菌2型LY株在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h左右開始進(jìn)入對數(shù)生長期,6~8h達(dá)到高峰,8h后活菌數(shù)逐漸下降,進(jìn)入衰退期。

    2.4.2活菌數(shù)與OD600值相關(guān)關(guān)系的建立 根據(jù)分時(shí)測定的活菌數(shù)和OD600值,在細(xì)菌生長遲緩期和對數(shù)期,活菌數(shù)和OD600值呈線性關(guān)系(圖5),相關(guān)性表示為y=24.6590x-1.0761(R2=0.9967)。

    2.5藥敏試驗(yàn)

    藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示,分離菌株LY株對青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感,對四環(huán)素、多粘菌素B、克林霉素不敏感。

    2.6小鼠致病性試驗(yàn)

    小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡,被毛糙亂。感染劑量為2.2×109cfu/只小鼠在24h內(nèi)全部死亡;2.2×108cfu/只攻毒組在48h死亡4只;2.2×107cfu/只攻毒組在48h死亡1只;對照組小鼠狀態(tài)良好(表3)。將死亡的小鼠剖檢,取肺臟劃線接種于TSA平板(5%胎牛血清),分離的細(xì)菌經(jīng)形態(tài)觀察、PCR鑒定,證明為豬鏈球菌2型菌株。

    2.7組織病理切片觀察

    組織病理切片結(jié)果顯示,肺部血管發(fā)生玻璃樣變,血管壁增厚,肺泡腔中可見淡粉色漿液滲出(圖6A);脾臟紅髓區(qū)域淋巴細(xì)胞大量減少,組織中還可見較多圓形空腔,空腔中有嗜堿性顆粒物(圖6B);心肌纖維間隙增寬,血管擴(kuò)張,充滿紅細(xì)胞(圖6C)。

    3討論與結(jié)論

    豬鏈球菌是一種具有莢膜的革蘭氏陽性菌,其中2型為35個(gè)血清型中最常見且毒力最強(qiáng)的血清型[15]。豬鏈球菌自然感染的部位為豬的上呼吸道,尤其是扁桃體和鼻腔[16]。

    近年來,隨著豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)和豬圓環(huán)病毒病(PCV)等免疫抑制性疾病的流行,導(dǎo)致豬鏈球菌病2型感染率上升,然而對豬鏈球菌2型的生長特性卻鮮有報(bào)道[17]。本研究從發(fā)病仔豬的肺部病灶分離菌株,經(jīng)細(xì)菌形態(tài)學(xué)和PCR鑒定為豬鏈球菌2型。通過液體培養(yǎng)的方法對豬鏈球菌2型LY株的生長曲線及OD600值進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,豬鏈球菌2型LY株在TSB液體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)中37℃培養(yǎng)3h后進(jìn)入對數(shù)生長期,在8h后進(jìn)入衰減期。

    豬鏈球菌2型的毒力、致病性和免疫性一直是研究者十分關(guān)心的問題,目前已有豬鏈球菌2型感染模型的報(bào)道[18-20]。本研究選用昆明小鼠作為動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)P?,用分離的LY株進(jìn)行攻毒,小鼠出現(xiàn)精神抑郁、食欲下降、死亡等癥狀,感染劑量為2.2×109cfu/只時(shí)小鼠死亡率為100%。對死亡小鼠進(jìn)行組織病理切片觀察,分別在肺臟、脾臟和心肌中發(fā)現(xiàn)不同程度的病變。

    豬鏈球菌作為一種典型的革蘭氏陽性菌,對各種抗菌藥的抵抗力并不強(qiáng)。但由于日常生產(chǎn)中抗生素的濫用,導(dǎo)致大量耐藥菌株的出現(xiàn)。通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),本研究分離到的豬鏈球菌2型菌株對多粘菌素B和克林霉素完全耐藥,對四環(huán)素輕度耐藥,而對青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感。本研究結(jié)果與鄧智丹[21]、劉澤文[22]、徐引弟[23]等研究結(jié)果不完全相同,說明抗生素的普遍使用,造成臨床上菌株的耐藥性差異,進(jìn)一步驗(yàn)證了在豬鏈球菌的防治過程中,藥敏試驗(yàn)的重要性與必要性。

    綜上所述,本研究建立了豬鏈球菌2型生長曲線,明確了該菌的生長特性和毒力,為疫苗候選菌株的篩選提供了理論依據(jù)。

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