商丘地區(qū)番茄枯萎病病原菌分離與鑒定

孫景梅 朱曉琴 盛亞楠 裴冬麗

摘要：本試驗以河南省商丘地區(qū)患枯萎病番茄植株為試材，采用組織分離、形態(tài)觀察及ITS序列分析，對引起番茄枯萎病的病原菌進行鑒定。結(jié)果表明，病原菌菌落呈圓形、白色，中心呈淡紫色，分生孢子鐮刀狀或橢圓狀。經(jīng)PCR擴增番茄病原菌ITS序列后得到長度為582bp的片段，對該序列在NCBI中進行比對，顯示與尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）同源性達99%以上。綜合形態(tài)特征和序列比對結(jié)果，確定該病原菌為尖孢鐮刀菌。將該病原菌回接到健康番茄植株上，引起番茄枯萎癥狀與田間一致。

關(guān)鍵詞：商丘市;番茄枯萎病;分離;鑒定;尖孢鐮刀菌

番茄因其營養(yǎng)物質(zhì)豐富，味道鮮美，加工方式多樣，受到世界各國的喜愛。在中國，番茄栽培范圍廣、種植面積大，呈集約化栽培趨勢。但番茄的集約化種植使病害發(fā)生愈加頻繁[1]。番茄枯萎病是由枯萎病菌引起的一種維管束疾病，是一種嚴(yán)重危害番茄品質(zhì)和產(chǎn)量的土傳性病害，從番茄幼苗期到成株期均可侵染[2]。尤其連作及設(shè)施生產(chǎn)中該病害的發(fā)病幾率更高，常在開花期侵染番茄莖基部造成維管束堵塞、植株萎蔫枯死，現(xiàn)已成為影響番茄栽培面積擴大和效益提升的重要病害之一[3]。據(jù)統(tǒng)計，發(fā)病危害嚴(yán)重的大棚減產(chǎn)達30%～50%，已成為設(shè)施番茄安全生產(chǎn)的主要瓶頸[4]。本試驗以河南省商丘市平臺鎮(zhèn)千禧番茄為研究對象，通過對病原菌進行形態(tài)觀察和ITS序列擴增對其進行鑒定[5]，以期為培育抗番茄枯萎病材料提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試植株為河南省商丘市平臺鎮(zhèn)千禧番茄。PDA培養(yǎng)基，在高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20mi

1.2試驗方法

1.2.1番茄枯萎病的田間發(fā)病癥狀 于2019年和2020年的5—6月在河南省商丘市平臺鎮(zhèn)千禧番茄大棚內(nèi)對番茄枯萎病的發(fā)生情況進行調(diào)查，每隔6d觀察一次，直至全株發(fā)病枯死。

1.2.2番茄枯萎病病原菌的分離與純化 病原菌的分離采用植物組織分離法[6，7]。首先將患病組織在75%乙醇中消毒20s，取出后用無菌水沖洗3次，再用5%次氯酸鈉消毒5min，無菌水漂洗5次。使用最后一次漂洗的水進行涂布判斷是否滅菌徹底。在超凈工作臺中用滅菌鑷子將處理過的患病組織塊（約5mm2）平鋪于PDA培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基4塊。于27℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)1周，觀察菌株生長情況。待菌落長出后采用單孢分離法進行純化[8，9]。

1.2.3番茄枯萎病病原菌形態(tài)觀察 在進行單孢分離后，得到菌株的單菌落，觀察和記錄菌落的形態(tài)、分泌物及顏色變化;顯微鏡下觀察孢子形狀大小、有無分隔等。

1.2.4番茄枯萎病病原菌的DNA提取及ITS序列擴增 采用改良的CTAB法[10，11]提取番茄枯萎病病原菌的總DNA，利用通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′擴增菌株ITS基因片段。反應(yīng)體系（20μL）：DNA2μL，ITS11μL，ITS41μL，dNTP1.6μL，10×PCRBuffer2μL，ddH2O11.9μL，Taq酶0.5μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min;94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共35個循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。1.2.5 病原菌的致病性檢測 病原菌在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，制備孢子懸浮液，將孢子濃度調(diào)至106個/mL左右。選取長勢一致的健康植株采用葉片噴灑法[12]接種病原菌，空白對照噴灑清水。25℃培養(yǎng)并注意保濕，觀察植株發(fā)病狀況。

2結(jié)果與分析

2.1番茄枯萎病癥狀

一般在番茄花期開始發(fā)病，發(fā)病初期番茄植株下部接近地面的葉片變黃，隨著發(fā)病時間的延長患病葉片發(fā)黃直至枯萎，少部分植株會出現(xiàn)一側(cè)葉片發(fā)病一側(cè)正常的現(xiàn)象，大多植株都是除了最頂端幾片葉正常外，其余葉片從下往上慢慢發(fā)病并發(fā)黃枯萎、但不會脫落，與曹俊庫[13]的結(jié)果一致。

2.2番茄枯萎病病原菌菌落及孢子特征

本試驗分離到多株病原菌，選取一株有代表性菌株進行后續(xù)試驗，命名為FQ-1。培養(yǎng)8d時，從培養(yǎng)基正面看FQ-1菌落呈白色絮狀，圓形，菌落邊緣為稀疏的白色菌絲，邊緣不整齊，向四周呈放射狀生長（圖1A）。從培養(yǎng)基背面看，菌落四周呈白色，中心則呈淡紫色，邊緣不平整（圖1B）。

病原菌孢子呈不同形狀及大小，大孢子鐮刀狀，內(nèi)部有0～3個橫向隔膜，小孢子呈橢圓形（圖1C、D）

2.3番茄枯萎病病原菌分子鑒定結(jié)果

PCR擴增ITS基因序列總長度為582bp，擴增產(chǎn)物測序后在NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對，結(jié)果表明擴增序列和尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）的序列（登錄號：KP942940.1）相似性達99%、覆蓋率為100%。依據(jù)中國真菌志（第三十八卷）[14]，結(jié)合菌株形態(tài)特征，確定商丘地區(qū)番茄枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌。

2.4番茄枯萎病病原菌的致病性檢測

培養(yǎng)1周時接種后的植株陸續(xù)發(fā)病，且發(fā)病癥狀和田間枯萎病癥狀相同（圖2B～F），而對照生長正常（圖2A）。表明導(dǎo)致番茄枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌。

3討論與結(jié)論

植物真菌性枯萎病是一種毀滅性土傳病害，主要致病菌為尖孢鐮刀菌，其寄主范圍廣泛，可侵染100多種植物[15，16]，有“植物癌癥”之稱[17，18]。該病原菌從植株根部侵入，侵染性極強[19]，是世界范圍內(nèi)許多作物的重要致病菌，因此病原菌的準(zhǔn)確鑒定對防控作物枯萎病意義重大[20]。

本試驗以河南省商丘市平臺鎮(zhèn)采集的發(fā)病番茄植株為試驗材料，采用組織分離法對病原菌進行分離，并通過形態(tài)觀察和分子測序?qū)ζ溥M行鑒定。結(jié)果表明，引起番茄枯萎病的致病菌為尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）。對該致病菌的基因組信息有待進一步研究，另外，本試驗主要在實驗室中進行，為了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，后續(xù)需在大田中作進一步研究，對所分離的病原菌生理生化特性進行分析，并篩選出相應(yīng)拮抗菌，結(jié)合生產(chǎn)過程中棚內(nèi)濕度調(diào)節(jié)、合理通風(fēng)、合理輪作等措施有效預(yù)防番茄枯萎病的發(fā)生。