HPLC 法測定藥用輔料L（+）- 酒石酸中的D（-）-酒石酸含量

賈玉榮， 尤昆

（江蘇正大清江制藥有限公司，江蘇南京 210046）

1 引言

酒石酸有兩個相同的手性碳原子，有三種立體異物體（左旋體（L-酒石酸）、右旋體（D-酒石酸）、 內(nèi)消旋體）。 左旋酒石酸與右旋酒石酸為對映異構(gòu)體。 天然存在的酒石酸都是右旋體。 右旋型酒石酸以游離的鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽的形態(tài)廣泛分布于高等植物中，特別是多存在于果實和葉中。 在制造葡萄酒時，會沉積大量酒石（氫鉀鹽）。 另外，在霉菌和地衣類中也常見到它的存在。 等量左旋體和右旋體的混合物，其旋光性相互抵消，組成外消旋體。 外消旋型酒石酸又稱為葡萄酸。 葡萄汁或其他漿果汁在發(fā)酵制酒過程中，析出不溶于乙醇和水的右旋酒石酸的酸式鉀鹽沉積于酒桶壁上，稱為酒石，酒石酸的名稱就是由此而來。 左旋酒石酸可由外消旋體拆分獲得，也存在于馬里的羊蹄甲的果實和樹葉中。

L(+)-酒石酸廣泛用作飲料和其他食品的酸味劑，用于葡萄酒、軟飲料、糖果、面包、某些膠狀甜食。 利用其光學活性，作為化學拆分劑，用于制造抗結(jié)核病藥物中間體DL-氨基丁醇的拆分；還可以作為手性原料用于酒石酸衍生物的合成；利用其酸性， 作為滌綸織物樹脂整理的催化劑，谷維素生產(chǎn)的pH 調(diào)節(jié)劑。

L（+）-酒石酸同時為藥用輔料，是DL-酒石酸拆分獲得的。 其為注射劑中常用的pH 調(diào)節(jié)劑。中國藥典2020 版[1]收錄了L（+）-酒石酸的質(zhì)量標準，目前文獻報道的酒石酸含量測定方法有毛細管電泳法[2]、單柱陰離子色譜法[3]、電位滴定法[4]、高效液相色譜法[5,6]、原子吸收光譜法法[7]、分光光度法[8,9]，其中高效液相色譜法具有簡便快速、靈敏度高的優(yōu)點，為目前測定有機酸類化合物最有效的手段[10,11]。但均未見文獻對其異構(gòu)體D（-）-酒石酸的含量測定進行報道。 本文采用HPLC 法測定L（+）-酒石酸中的D（-）-酒石酸，為提高該藥用輔料的質(zhì)量標準提供參考。

2 材料與方法

2.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司，UltiMate 3000），XS205DU 型電子分析天平（感量為0.01mg， 瑞 士METTER TOLEDO 公 司），KH7200B 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；乙醇（色譜純，默克公司）；正己烷（色譜純，默克公司）；三氟乙酸（色譜純，阿拉?。?；純化水（杭州娃哈哈有限公司）；標準品D（-）-酒石酸（廠家：阿拉丁，含量99.5%）；標準品L（+）-酒石酸（廠家：阿拉丁，含量99.1%）；藥用輔料L（+）-酒石酸（貴州欣紫鴻藥用輔料有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準品儲備溶液的制備

分別精密稱取D（-）-酒石酸對照品10.27mg、L（+）-酒石酸對照品10.33mg，置不同100mL 量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，分別作為D（-）-酒石酸和L（+）-酒石酸標準品儲備液。

2.2.2 標準曲線溶液的制備

精密吸取D（-）-酒石酸和L（+）-酒石酸標準品各0.4mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL， 分別置10mL 量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 樣品前處理

精密稱取本品25mg，置25mL 量瓶中，加適量乙醇，超聲處理（功率300W，頻率50kHz）5min，放冷，加乙醇至刻度，搖勻，用0.45μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 液相色譜條件

色 譜 柱：CHIRALPAK IC （250mm ×4.6mm，5μm）； 柱溫：25℃； 流速0.5 mL·min-1； 進樣量：10μL；檢測波長：210nm；以乙醇-正己烷-三氟乙酸（200∶800∶1）為流動相進行等度洗脫，運行時間為30min。 典型色譜圖見圖1。

圖1 A-空白溶劑；B-混合標準品溶液

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系

取配制好的標準曲線溶液， 分別進樣10μL，按 “2.2.4” 色譜條件下測定峰面積。 以峰面積Y 為縱坐標，以標準曲線溶液濃度X 為橫坐標進行線性回歸，各組分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。 可見該方法再實驗范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各組分線性關(guān)系測定結(jié)果

3.2 檢測限、定量限

以信噪比為3 計算檢出限，信噪比為10 計算定量限，測得D（-）-酒石酸、L（+）-酒石酸的檢測限 分 別 為27.626ng、26.694ng， 定 量 限 分 別 為41.094ng、41.302ng。 該方法靈敏度高。

3.3 精密度

取標準曲線溶液（濃度水平3）， 連續(xù)進樣6次，結(jié)果測得D（-）-酒石酸、L（+）-酒石酸峰面積的RSD 分別為0.35%和0.28%，精密度結(jié)果見表2。

表2 精密度測定結(jié)果

3.4 重復性試驗

取樣品，平行試驗6 份，結(jié)果D（-）-酒石酸的檢出量為0.02%，RSD 為0.87%。 表明本方法重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表3。

表3 重復性測定結(jié)果

3.5 中間精密度試驗

取樣品，由不同人員、在不同時間、采用不同儀器，平行試驗6 份，結(jié)果D（-）-酒石酸的檢出量為0.02%，與重復性6 份樣品測定結(jié)果基本一致，12 份樣品D（-）-酒石酸含量的RSD 為1.03%，方法的中間精密度良好，結(jié)果見表4。

表4 重復性測定結(jié)果

3.6 干擾試驗

取空白溶劑-乙醇，按 “2.2.4” 色譜條件進樣，空白溶劑在D（-）-酒石酸和L（+）-酒石酸相同保留時間附近無雜質(zhì)峰干擾。

3.7 方法回收率

取9 份同批號樣品約10mg（批號：Y20081001），精密稱定，置10mL 量瓶中，每3 份分別精密加入L（+）- 酒石酸標準品儲備溶液0.50mL、1.00mL、1.50mL，依法測定，結(jié)果D（-）-酒石酸回收率范圍為99.6%～100.4%，RSD 為0.27%，回收率結(jié)果見表5。

表5 回收率測定結(jié)果

3.8 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液， 分別于0h、2h、4h、8h、12h、24h 進樣，依法測定，結(jié)果表明該供試品溶液室溫放置24h 內(nèi)，D（-）-酒石酸含量基本一致，峰面積的RSD 為1.47%，且無新雜質(zhì)生成，說明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定。 結(jié)果見表6。

表6 溶液穩(wěn)定性結(jié)果結(jié)果

3.9 耐用性

適當改變流速（0.5±0.1mL/min）、柱溫（25±2℃）、流動相比例（205∶795，195∶805），考察系統(tǒng)適用性溶液中D(-)-酒石酸與L(+)-酒石酸之間的分離情況。L(+)-酒石酸與其異構(gòu)體峰的分離度均大于1.5，符合要求，表明該分析方法的耐用性良好。 結(jié)果見表7。

表7 耐用性試驗結(jié)果

3.10 樣品測定

取3 批樣品，每批樣品平行測定2 份，結(jié)果D（-）-酒石酸含量分別為0.015%、0.021%、0.027%。

4 討論

4.1 流動相的選擇

D（-）-酒石酸和L（+）-酒石酸為構(gòu)型異構(gòu)體，需采用手性柱進行分離。 選用正相體系通用的流動相正己烷-乙醇進行流動相篩選， 通過添加不同種類的酸性調(diào)節(jié)劑改善峰型， 主要考察了甲酸、乙酸及三氟乙酸。 結(jié)果以正己烷-乙醇-三氟乙酸為流動相時，峰形好，分離度大于5.0，且空白溶劑及其他雜質(zhì)無干擾。

4.2 波長的選擇

對D（-）-酒石酸進行了紫外全波長掃描，結(jié)果顯示該成分無最大吸收波長， 僅有末端吸收，因此選擇210nm 作為檢測波長。 在該檢測波長下，D（-）-酒石酸的檢測限較低，靈敏度好。

4.3 流速的選擇

采用手性柱進行分離， 對流速進行了篩選。結(jié)果表明當流速為0.5mL·min-1時，D（-）-酒石酸和L（+）-酒石酸的分離度合適，柱壓較低。流速越低，消耗的流動相越少，柱壓也越低，可以節(jié)約試驗成本，同時減少對儀器的損耗。

4.4 柱溫的選擇

柱溫過低會導致出峰時間延長，柱壓力增大；柱溫過高會導致柱流失。 常規(guī)采用25℃或者30℃進行液相色譜分析。 考慮到實驗室的環(huán)境控制一般都在25℃左右，因此選擇25℃作為柱溫。 結(jié)果表明該柱溫條件下，出峰時間及分離度均較適宜。