鐵電極輔助餐廚垃圾高溫厭氧消化及微生物的耐鹽機(jī)理

曲藝源，張景新，何義亮

（上海交通大學(xué)中英國(guó)際低碳學(xué)院，上海 201306）

在厭氧消化過(guò)程中，溫度是影響厭氧消化性能的重要因素之一。一般而言，厭氧消化主要分為中溫（35～37℃）厭氧消化和高溫（55～60℃）厭氧消化。在高溫厭氧消化過(guò)程中，有機(jī)物的水解速率、揮發(fā)性固體的去除率和產(chǎn)甲烷量比中溫厭氧消化高。并且在高溫條件下，消化底物中的病原體更少。但是，高溫菌比中溫菌對(duì)環(huán)境的變化更為敏感。當(dāng)環(huán)境中的NaCl 濃度發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞的活性會(huì)受到影響，參與厭氧消化的酶活性下降，同時(shí)，高鹽度會(huì)使細(xì)胞滲透壓增加，導(dǎo)致微生物發(fā)生細(xì)胞的質(zhì)壁分離進(jìn)而導(dǎo)致微生物細(xì)胞的死亡。因此，緩解高鹽度對(duì)微生物的不良影響對(duì)高溫厭氧消化性能的提升具有重要意義。

近年來(lái)很多研究表明，添加零價(jià)鐵（ZVI）能夠提高厭氧消化的穩(wěn)定性、微生物的耐鹽能力和細(xì)胞活性。大量研究表明，鐵-碳微生物電解池（MEC）在有機(jī)污染物降解、工業(yè)廢水和有機(jī)廢水處理過(guò)程中具有強(qiáng)化厭氧消化的作用。并且已有研究表明，ZVI與MEC耦合之后能夠促進(jìn)微生物的直接種間電子傳遞（DIET），提高系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷能力。但是在高溫、高鹽度條件下，ZVI 耦合MEC的厭氧消化系統(tǒng)能否提高微生物的耐鹽能力、提高甲烷產(chǎn)量以及在電化學(xué)系統(tǒng)中鐵作為陽(yáng)極形成的生物膜的微生物結(jié)構(gòu)和強(qiáng)化機(jī)制尚不清楚。

本文研究了不同Na濃度的條件下MEC在高溫厭氧消化過(guò)程的強(qiáng)化效果，對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)變化和代謝通路進(jìn)行了分析評(píng)估并解釋其耐鹽機(jī)理。本研究對(duì)強(qiáng)化厭氧消化過(guò)程實(shí)現(xiàn)能源回收以及含鹽廢棄物處理具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

接種污泥取自嘉興某生物處理廠的大型厭氧消化罐，餐廚垃圾取自上海市宜浩歐景人才公寓的食堂，主要由大米、面條、肉和蔬菜組成。將餐廚垃圾攪碎并通過(guò)混合器均勻混合，接種污泥和餐廚垃圾的特性如表1所示。

表1 接種污泥和餐廚垃圾的元素組成、總固體（TS）和揮發(fā)性固體（VS）

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置和操作

采用300mL 厭氧玻璃瓶構(gòu)建單室電發(fā)酵反應(yīng)器。陰極為石墨電極、陽(yáng)極為鐵電極制成鐵-碳微生物電解池（R1），陰極、陽(yáng)極均為石墨電極的碳-碳微生物電解池（R2），對(duì)照組（C）不使用微生物電解池，并設(shè)置三組平行組。加入由厭氧消化池采集的240mL 接種污泥，恒電位設(shè)置為0.6V。添加餐廚垃圾的有機(jī)負(fù)荷為4g VS/L，每次改變鹽度添加一次餐廚垃圾，并用NaCl 分別調(diào)節(jié)Na濃度分別為0、5g/L、10g/L、15g/L 和20g/L，每6 天添加一次餐廚垃圾并改變鹽度，在Na濃度為20g/L 時(shí)實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次，以驗(yàn)證耐鹽效果。為了保持嚴(yán)格的厭氧消化，用氮?dú)鉀_洗100 次，脫去氧氣后，用鋁箔集氣袋密封連接，保持厭氧狀態(tài)。pH 調(diào)整為6.97，反應(yīng)器在(55±1)℃的水浴條件下運(yùn)行，測(cè)定Fe、pH、產(chǎn)甲烷量、COD 和揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）。

1.3 分析方法

（1）VFAs測(cè)定 上清液中VFAs測(cè)定采用氣相色譜法。樣品預(yù)處理：采用3%的磷酸酸化上清液至pH 到4.00 以下，確保上清液中小分子酸處于解離狀態(tài)，盛裝于2mL 分析瓶中。采用島津氣相色譜儀（GC-2030），色譜柱溫度60℃，氫火焰離子化檢測(cè)儀（flame ionization detector，F(xiàn)ID） 溫度250℃。乙酸、丙酸、丁酸（異丁酸）和戊酸（異戊酸）對(duì)應(yīng)COD 的轉(zhuǎn)換系數(shù)分別為1.07、1.51、1.82、2.04。

（2）宏基因組學(xué)分析 取鐵片電極上的生物膜和R1 和C 反應(yīng)器中實(shí)驗(yàn)后的底泥，向其中加入同體積無(wú)水乙醇進(jìn)行固定，隨后置于-20℃的冰箱中保存。將樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行DNA提取和測(cè)序，并進(jìn)行宏基因組分析。使用引物（TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC）和（TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC） 分別對(duì)古菌和細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA的擴(kuò)增。采用高通量測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序，得到基因序列通過(guò)軟件被分成各種OTU。最后利用GreenGenes 和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的OTUs 進(jìn)行分類(lèi)，并且進(jìn)行代謝通路分析。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有測(cè)序微生物基因組的基因功能構(gòu)成和測(cè)序獲得的物種構(gòu)成推測(cè)樣本中的功能基因構(gòu)成。

（3）其他相關(guān)測(cè)定指標(biāo)及方法 pH，玻璃電極法；TS，重量法；VS，灼燒減量法；COD，快速消解分光光度法；氣體成分，氣相色譜法；Fe濃度，鄰菲啰啉分光光度法。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)甲烷量對(duì)比分析

不同NaCl 濃度下體系的累積甲烷量如圖1 所示。在未添加NaCl 的情況下，R1的強(qiáng)化效果比較明顯。將Na濃度提高時(shí)，R1 產(chǎn)甲烷能力開(kāi)始下降。添加5g/L Na時(shí)，R1反應(yīng)更快，最高甲烷產(chǎn)量為92mL/g VS，是R2 和C 的1.91 倍和1.84 倍。當(dāng)Na的含量分別進(jìn)一步增加到10g/L 和15g/L 時(shí)，各反應(yīng)器的產(chǎn)甲烷能力都不同程度地受到了抑制，這說(shuō)明NaCl的存在能夠抑制甲烷的產(chǎn)生。但是R1反應(yīng)器依舊擁有最高的甲烷產(chǎn)量90～120mL/g VS，并且累積產(chǎn)甲烷量最多，在第24 天的時(shí)候達(dá)到了928.71mL。當(dāng)Na濃度達(dá)到20g/L 的時(shí)候，R1 的比甲烷產(chǎn)量以及累積甲烷產(chǎn)量均最高，比甲烷產(chǎn)量為41.71mL/g VS，分別是R2 和C 反應(yīng)器的1.52 倍和1.58 倍。對(duì)照組（C）的比甲烷產(chǎn)量并不是在每個(gè)鹽度的第一天達(dá)到最大，相對(duì)于R1 出現(xiàn)了滯后現(xiàn)象，說(shuō)明鹽度對(duì)高溫產(chǎn)甲烷過(guò)程產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制作用。就累積產(chǎn)甲烷量而言，在R1反應(yīng)器中，Na投加量從5g/L 增加到20g/L，對(duì)應(yīng)累積產(chǎn)甲烷量最高達(dá)到了1110.67mL，相對(duì)于R2 和C 反應(yīng)器的789.31mL 和660.32mL，分 別 提 高 了40.68% 和68.18%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鐵-碳微生物電解池能夠提高微生物耐鹽能力，促進(jìn)厭氧消化產(chǎn)甲烷。

圖1 不同反應(yīng)器中的甲烷產(chǎn)量對(duì)比

2.2 不同鹽度下的COD、pH和Fe含量的變化

厭氧消化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)照反應(yīng)器內(nèi)的COD濃度為(11500±165)mg/L，如圖2 所示。R2 和R1 反應(yīng)器內(nèi)消化污泥的COD 濃度分別為(9120±75)mg/L和(8574±83)mg/L。從圖2 中可以看出，當(dāng)Na濃度為0 的時(shí)候，微生物還處于適應(yīng)階段，COD 較高，隨著鹽度的增加，COD 的去除效果從10g/L Na之后開(kāi)始下降。對(duì)比不同反應(yīng)器可以看出，C反應(yīng)器的COD去除效果最差，Na濃度為10g/L，各反應(yīng)器的去除效果最好，而Na濃度＞10g/L 的時(shí)候，各反應(yīng)器開(kāi)始出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象，但是R1、R2能夠克服鹽度帶來(lái)的不利影響。由此可以看出，鐵-碳微生物電解池在高鹽度條件下具有促進(jìn)COD 去除和維持高溫系統(tǒng)穩(wěn)定性的作用。應(yīng)當(dāng)指出的是，Na濃度20g/L時(shí)，COD 去除效果最差，鹽度的提高對(duì)于COD 的去除具有不利影響，這一結(jié)果與之前報(bào)道的相一致。相應(yīng)地，pH 隨著Na濃度的增加開(kāi)始下降，當(dāng)Na濃度為20g/L 的時(shí)候，R1 穩(wěn)定在7 的水平，但是R2 低于7，而C 的pH 接近6 并且出現(xiàn)酸化的問(wèn)題，說(shuō)明鹽度對(duì)于高溫厭氧消化具有很強(qiáng)的抑制作用，而鐵-碳微生物電解池在高鹽度條件下對(duì)于維持厭氧反應(yīng)器的系統(tǒng)穩(wěn)定和緩解反應(yīng)器酸化具有重要作用。

圖2 不同反應(yīng)器中COD的含量和pH變化

Fe在厭氧消化過(guò)程中的濃度變化情況如圖3所示?？梢钥闯?，F(xiàn)e在溶液中的濃度隨著鹽濃度的上升在Na為10g/L的時(shí)候達(dá)到最大值4～5mg/L，然后隨著鹽度的不斷提高逐漸達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，維持在2～3mg/L。對(duì)比固體中鐵含量來(lái)看，固體中的鐵含量同樣在Na為10g/L 的時(shí)候達(dá)到峰值，而產(chǎn)甲烷量同樣在此段時(shí)間到達(dá)最大值，這可能是因?yàn)殍F能夠增強(qiáng)微生物的活性。研究表明鐵對(duì)于微生物的厭氧消化過(guò)程至關(guān)重要，它能夠參與到關(guān)鍵酶的合成中，并在氧化還原反應(yīng)中起到電子載體的作用，從而有助于產(chǎn)生更多甲烷。而固體中的鐵含量隨著鹽濃度的升高而降低，可能是因?yàn)殍F被產(chǎn)甲烷菌利用以提高微生物的產(chǎn)甲烷能力。

圖3 Fe含量的變化

2.3 不同鹽度下VFAs的變化

VFAs 是厭氧消化的重要中間產(chǎn)物，是產(chǎn)生甲烷的消化底物。如圖4所示，將NaCl添加到消化反應(yīng)器中時(shí)，VFAs的產(chǎn)生受到很大影響。當(dāng)Na濃度從0增加到15g/L時(shí)，有機(jī)酸降解效率呈下降趨勢(shì)，Na含量為20g/L 時(shí)，有機(jī)酸的降解效率最差。鐵-碳微生物電解池對(duì)VFAs 的降解效果最好，四種酸的總濃度維持在6000mg COD/L 以下。圖4 顯示了NaCl 對(duì)丁酸降解效率的影響。當(dāng)NaCl 濃度較高的時(shí)候，丁酸降解效率降低。隨著鹽度的增加，對(duì)照組的丁酸和丙酸的含量升高，證明鹽度升高抑制了揮發(fā)性有機(jī)酸的乙酸化過(guò)程。與對(duì)照組相比，R1和R2 反應(yīng)器能夠促進(jìn)丁酸轉(zhuǎn)乙酸。這些數(shù)據(jù)表明NaCl 的存在抑制了丙酸和丁酸轉(zhuǎn)化為乙酸，從而抑制了甲烷的產(chǎn)生，而吸附在陽(yáng)極表面的微生物可以在電的驅(qū)動(dòng)下將有機(jī)物氧化為CO。有研究表明，高濃度的Na會(huì)導(dǎo)致高滲透壓，這可能導(dǎo)致產(chǎn)甲烷菌的細(xì)胞內(nèi)水分流失并降低微生物中關(guān)鍵酶的活性（如脫氫酶）。而通過(guò)對(duì)比R1和R2可以發(fā)現(xiàn)，R2中丙酸的含量是R1的3倍，說(shuō)明R1能夠很好地將丙酸轉(zhuǎn)化為乙酸，這說(shuō)明鐵-碳微生物電解池在促進(jìn)有機(jī)酸的降解、抵抗鹽度方面具有更好的效果。并且鐵的存在能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，維持細(xì)胞活性，參與關(guān)鍵酶的合成，從而促進(jìn)產(chǎn)甲烷。這一結(jié)果與Feijoo 等報(bào)道的利用丙酸的微生物比利用其他有機(jī)酸的微生物（如乙酸和丁酸）對(duì)高鹽環(huán)境的適應(yīng)能力更小一致。

圖4 不同厭氧消化系統(tǒng)的有機(jī)酸含量對(duì)比

2.4 微生物群落分析

2.4.1 鹽度對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

厭氧消化系統(tǒng)中屬水平群落豐度如圖5 所示。在高鹽度條件下反應(yīng)器中出現(xiàn)了一些可降解有機(jī)物的耐鹽菌。芽孢桿菌（）是能夠在高鹽條件下生存的細(xì)菌，在R1的電極（HFCE）和反應(yīng)器中的污泥（HFCS）中具有較高的含量，而對(duì)照組幾乎沒(méi)有，由此可以看出鐵-碳微生物電解能夠富集耐鹽微生物?；I(yíng)桿菌屬（）是一類(lèi)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌，在R1的電極（HFCE）的占比大約是對(duì)照組中占比的3 倍，有研究報(bào)道了能夠促進(jìn)丙酸轉(zhuǎn)乙酸過(guò)程，從而促進(jìn)產(chǎn)甲烷，在有機(jī)物降解過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。鐵-碳微生物電解池對(duì)于耐鹽菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，并且在高鹽度條件下能夠促進(jìn)有機(jī)物的水解酸化過(guò)程。

2.4.2 鹽度對(duì)古菌群落結(jié)構(gòu)的影響

從古菌群落結(jié)構(gòu)分析[圖5(b)]可知，鐵電極（HFCE）上最占優(yōu)勢(shì)的菌屬是甲基型產(chǎn)甲烷菌屬（），該菌屬于嗜乙酸型產(chǎn)甲烷菌，是一種耐鹽產(chǎn)甲烷菌，可在產(chǎn)甲烷過(guò)程受到限制的時(shí)候通過(guò)甲基還原產(chǎn)生甲烷。R1反應(yīng)器中，甲 烷 鬃 毛 菌 屬 （， 又 被 稱 為）是一種產(chǎn)甲烷菌，其在HC、HFCE和HFCS 中的占比分別為5%、10%和20%。相比之下，在HC、HFCE 和HFCS 中的占比分別為47%、22%和43%。這一變化可能與接受電子的方式有關(guān)，被證明通過(guò)DIET將二氧化碳還原為CH。從電極表面接受電子，使用CO還原產(chǎn)甲烷，通過(guò)用乙酸脫羧途徑產(chǎn)生甲烷。這些結(jié)果表明，R1中DIET的刺激增強(qiáng)了二氧化碳產(chǎn)甲烷的轉(zhuǎn)化過(guò)程，促進(jìn)了乙酸型甲烷的生成，而對(duì)照組的甲烷生成途徑主要是耗氫產(chǎn)甲烷過(guò)程。甲烷桿菌屬（）是一種以甲酸和H/CO生成甲烷為主要原料的微生物，這可能與鐵-碳微生物電解池緩解鹽度抑制有關(guān)。結(jié)果表明，鐵-碳微生物電解池可以有效地增強(qiáng)耐鹽古菌的富集。在高鹽度條件下，這兩個(gè)微生物群落之間的有利相互作用促進(jìn)了有機(jī)物的降解。

圖5 厭氧體系中微生物群落分析

2.4.3 微生物的代謝通路預(yù)測(cè)

分析微生物群落的代謝通路，可以闡明鐵-碳微生物電解池對(duì)微生物代謝的影響。將樣品所測(cè)得的編碼基因根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類(lèi)比對(duì)，樣品中二級(jí)和三級(jí)分類(lèi)的主要相關(guān)編碼基因豐度如表2所示。與對(duì)照組相比，HFCE 中的細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、運(yùn)輸和分解代謝以及碳水化合物的代謝相關(guān)編碼基因分別增加了15.4%、43.4%和31.5%，HFCS細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、運(yùn)輸和分解代謝以及碳水化合物代謝相關(guān)編碼基因分別增加了17.9%、23.1%和31.5%。這進(jìn)一步證實(shí)了鐵-碳微生物電解池有助于增強(qiáng)細(xì)胞和酶的代謝、提高微生物的耐鹽能力并且促進(jìn)餐廚垃圾的水解酸化。通過(guò)添加鐵-碳電極的形式，負(fù)責(zé)能量代謝的氧化磷酸化相關(guān)編碼基因Ko00190 已 從376250 增 加 到HFCE 和HFCS 的491036和458464。Ko00260的基因負(fù)責(zé)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，從183250 增加到346599 和220412，這些基因是參與酶和細(xì)胞的合成和代謝過(guò)程的必需基因。與產(chǎn)甲烷過(guò)程有關(guān)的相對(duì)豐度的差異最顯著的是Ko02024，主要負(fù)責(zé)甲烷的代謝。HFCE 和HFCS 中的Ko02024 基因數(shù)分別為768776和537022，而對(duì)照組中僅為486743。Ko02024的增強(qiáng)表明鐵-碳微生物電解池有助于促進(jìn)甲烷化過(guò)程。輔酶及維生素的代謝相關(guān)編碼基因基因豐度從對(duì)照組的1111371 增加到HFCE 和HFCS 中的1435909 和1312539，支持了這種相關(guān)性。氨基酸代謝相關(guān)編碼基因豐度從200962 增加到HFCE 和HFCS的240707和242947。從這些基因的變化可以看出，鐵在促進(jìn)微生物的細(xì)胞增殖和代謝中起著重要作用，鐵能夠參與關(guān)鍵酶的合成，能夠強(qiáng)化甲烷化過(guò)程并且提高微生物的耐鹽能力。

表2 KEGG中二級(jí)和三級(jí)功能分類(lèi)

2.4.4 甲烷代謝的宏基因組分析

表3 列出了與關(guān)鍵產(chǎn)甲烷途徑有關(guān)的酶基因。乙酸脫羧和二氧化碳還原是甲烷代謝的基本途徑。鐵-碳微生物電解池中參與乙酸脫羧過(guò)程的乙酸激酶（ackA）和乙酰輔酶A 合成酶（acs）的基因豐度高于對(duì)照組，F(xiàn)e 的存在能夠提高乙酸激酶（ackA）的活性，乙酰輔酶A 合成酶通常和脫氫酶以[ACS/CODH]的形式存在，其中含有[4Fe-4S]簇和Ni-Ni-[4Fe-4S]位點(diǎn)，說(shuō)明鐵-碳微生電解池強(qiáng)化了乙酸產(chǎn)甲烷的過(guò)程。此外，氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌參與了完整的CO還原途徑的所有通路。涉及這些通路的重要酶包括：次甲基甲酰四氫甲烷蝶呤環(huán)化水解酶（mch）、亞甲基四氫甲烷蝶呤脫氫酶（mtd） 以及5,10-亞甲基四氫甲烷蝶呤還原酶（mer）等。鐵-碳微生物電解池中相關(guān)編碼的基因豐度均高于對(duì)照組，說(shuō)明該系統(tǒng)的CO還原為CH的產(chǎn)甲烷途徑很活躍。同時(shí)鐵-碳微生物電解池對(duì)于利用甲醇、甲酸等甲基類(lèi)化合物的產(chǎn)甲烷過(guò)程中酶的合成也起到了一定的強(qiáng)化作用。因此，通過(guò)鐵-碳微生物電解池可以提高酶基因的表達(dá)和酶活性，從而促進(jìn)乙酸脫羧和二氧化碳還原，最終有利于甲烷的產(chǎn)生。

表3 基于KEEG參與甲烷代謝的典型基因豐度

3 結(jié)論

（1）隨著體系鹽度的不斷提高，鐵-碳微生物電解池中的產(chǎn)甲烷效果最好，而對(duì)照組的產(chǎn)甲烷能力明顯受到抑制。

（2）在適當(dāng)?shù)碾妷合?，鐵-碳微生物電解池能夠維持pH 穩(wěn)定，增強(qiáng)丙酸轉(zhuǎn)乙酸過(guò)程，促進(jìn)有機(jī)物的水解酸化過(guò)程。

（3）鐵-碳微生物電解池富集了大量耐鹽微生物，微生物細(xì)胞通常具有更高的酶活性和耐鹽能力。

（4）鐵-碳微生物電解池通過(guò)在鐵電極表面富集、和-能夠促進(jìn)甲酸和H/CO產(chǎn)甲烷、甲基途徑產(chǎn)甲烷及DIET，提高餐廚垃圾厭氧消化的產(chǎn)甲烷性能。

COD—— 化學(xué)需氧量，mg/L

TS—— 總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

VS—— 揮發(fā)性固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

VFAs—— 揮發(fā)性脂肪酸，mgCOD/L