TCY-NH2對腦死亡大鼠胰腺炎性反應和細胞凋亡的影響

袁梓博，方紅波，李 濤，馮泉凱，曹勝利，李 捷

0 引 言

胰腺或胰島移植是治療糖尿病的有效方法，可以控制血糖及其相關并發(fā)癥[1-2]。目前，供胰主要源自腦死亡供體的捐獻。然而，研究發(fā)現腦死亡誘導促炎細胞因子和促凝介質大量釋放入血，激活全身炎性反應[3-4]。同樣，腦死亡供胰中炎性介質表達上調，激活炎性反應[5]。促炎介質過早表達可促進移植過程中的炎性反應，加重缺血再灌注損傷，增加移植術后排斥和移植物功能障礙發(fā)生的風險[6]。研究發(fā)現，反-肉桂酰-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-酰胺三氟乙酸鹽(Trans-Cinnamoyl-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-amide trifluoroacetate salt，TCY-NH2)是肽類化合物，能抑制BALB/c小鼠體內中性粒細胞向胸膜腔的遷移，并減少中性粒細胞的滾動和黏附，降低炎性反應[7]。TCY-NH2可減弱血小板及免疫細胞的募集，改善缺血再灌注損傷[8]。TCY-NH2對胰腺炎癥反應及細胞凋亡作用尚不明確，本研究擬通過構建大鼠腦死亡模型，探討TCY-NH2作為干預靶點對腦死亡供胰的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物成年雄性SD大鼠18只，健康SPF級，體重300～350g，購自鄭州華興實驗動物公司[動物許可證號: SCXK(豫)2019-0002]。所有大鼠均飼養(yǎng)在環(huán)境溫度19～23 ℃，相對濕度 50% ～ 60%清潔動物房內，自由進食飲水。

1.2腦死亡模型采用緩慢間斷顱內加壓法誘導大鼠腦死亡，主要方法：戊巴比妥鈉腹腔注射誘導麻醉，顱骨鉆孔，硬腦膜外放置擴張導管球囊以加壓誘導腦死亡，氣管切開插管以備自主呼吸停后連接呼吸機，股動脈置管監(jiān)測血壓，尾靜脈置管補液，膀胱造瘺監(jiān)測尿量。當出現自主呼吸消失、角膜反射消失、深昏迷、腦電圖波形平直時，判定大鼠腦死亡誘導成功。腦死亡期間，持續(xù)呼吸機通氣，靜脈輸入羥乙基淀粉氯化鈉注射液，維持平均動脈壓>80 mmHg。

1.3實驗分組隨機將18只大鼠分為3組：腦死亡組，采用上述方法構建大鼠腦死亡模型，維持腦死亡狀態(tài)6 h；假手術組，除不加壓誘導腦死亡，余操作同腦死亡組；TCY-NH2組，在加壓誘因腦死亡時將TCY-NH2(0.6 mg/kg，溶于等滲鹽水)通過靜脈注入大鼠體內，其余操作同腦死亡組。在腦死亡6 h后留取胰腺標本。

1.4免疫組化染色采用免疫組化染色法檢測胰腺組織中的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，以分析中性粒細胞浸潤情況。石蠟包埋胰腺組織，切片4 μm厚，脫蠟、水化，EDTA(Ph9.0)液進行抗原修復，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，3%胎牛血清進行封閉，孵育MPO抗體(1∶200，武漢賽維爾)，孵育辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB顯色，封片。陽性為棕黃色，每個切片至少選3個視野進行分析。

1.5熒光實時定量PCR采用RNAiso Plus試劑盒(Takara)提取胰腺組織中總RNA，并用Nanodrop 2000測得RNA濃度。按照逆轉錄試劑盒(Takara)操作說明，將RNA逆轉錄成cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus，Takara)試劑盒操作說明配置反應體系，并在ABI7500快速實時PCR儀上進行檢測。每個樣本重復3次，GAPDH作為相對表達的內參基因。PCR中所用的基因引物：GAPDH引物5′- CTTGTGCAGTGCCAGCCTC-3′(上游)和5′-ATGAAGGGGTCGTTGATGGC-3′(下游)，IL-1β引物5-AGGAGAGACAAGCAACGACA-3′(上游)和5′-TTGTTTGGGATCCACACTCTCC-3′(下游)，TNF-α,引物5′- GTGATCGGTCCCAACAAGGA-3′(上游) 和5′- CGCTTGGTGGTTTGCTACG-3′(下游)，VCAM-1引物5′-GGAAATGCCACCCTCACCTT-3′(上游)和5′- AACAGTAAATGGTTTCTCTTGAACA-3′(下游)，ICAM-1引物5′- AAGCTCTTCAAGCTGAGCGA-3′(上游)和5′-CGCTCTGGGAACGAATACAC-3′(下游)。

1.6Western blot分析用磷酸化蛋白提取試劑盒(索萊寶)提取胰腺組織的總蛋白，并用上樣緩沖液煮沸變性。根據目的蛋白分子大小選用12% 或15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉染至PVDF膜。用一抗p-IκBα 抗體(Cell Signaling Technology 公司), p-p65 抗體(Cell Signaling Technology公司)、IκBα 抗體(Proteintech 公司)、Bcl2抗體(Proteintech公司)、Bax抗體(Proteintech公司)、cl-Caspase-3抗體 (Proteintech公司) 和GAPDH抗體 (Proteintech公司)孵育4 ℃過夜，二抗孵育后用ECL化學發(fā)光液進行顯像，用C-DiGit印跡掃描儀進行檢測并用圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。GAPDH為上樣內參蛋白。

1.7細胞凋亡檢測將石蠟包埋胰腺組織切片，厚4 μm，采用原位細胞凋亡檢測試劑盒(賽維爾)檢測胰腺組織的凋亡細胞(呈綠色)，用DAPI對細胞核進行染色(呈藍色)。熒光顯微鏡進行觀察，每個切片至少選3個視野進行分析。

2 結 果

2.1 胰腺組織中性粒細胞浸潤情況與腦死亡組胰腺組織浸潤的中性粒細胞(4.20±2.79)比較，TCY-NH2組、假手術組(0.70±1.00、0.40±0.66)明顯減少(P<0.05)。這表明TCY-NH2可以減輕腦死亡供胰組織的中性粒細胞浸潤情況。見圖1。

a:假手術組; b:腦死亡組; c:TCY-NH2組

2.2胰腺組織中炎癥介質的表達情況與腦死亡組比較，TCY-NH2組、假手術組的胰腺組織中IL-1β、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1的mRNA表達明顯降低(P<0.05)。這表明阻斷TCY-NH2可以降低腦死亡供胰組織中炎性介質的表達。見表1。

2.3胰腺組織中NF-κB通路相關蛋白的變化與腦死亡組比較，TCY-NH2組、假手術組的胰腺組織中p-IκBα和p-p65的蛋白表達明顯降低，IκBα蛋白表達明顯升高(P<0.05)。這表明TCY-NH2可以抑制腦死亡供胰組織中NF-κB通路激活。見圖2。

表 1 熒光實時定量PCR檢測胰腺組織中細胞因子的mRNA相對表達水平

與假手術組比較，*P<0.05;與腦死亡組比較，#P<0.05

2.4胰腺組織中細胞凋亡情況與腦死亡組的胰腺組織中細胞凋亡(2.50±1.96)比較，TCY-NH2組、假手術組(0.60±0.66、0.30±0.46)明顯減少(P<0.05)。這表明TCY-NH2可以減輕腦死亡供胰組織中細胞凋亡。見圖3。

a:假手術組; b:腦死亡組; c:TCY-NH2組

2.5胰腺組織中凋亡相關蛋白的變化與腦死亡組比較，TCY-NH2組、假手術組的胰腺組織中Bax和cl-Caspase3的蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Bcl2蛋白表達明顯升高(P<0.05)。這表明TCY-NH2可以調控腦死亡供胰組織中凋亡相關蛋白的表達。見圖4。

與假手術組比較，*P<0.05;與腦死亡組比較，#P<0.05

3 討 論

全身炎性反應是腦死亡供體的重要特征，影響腦死亡供體器官的質量和移植效果[6]。有文獻報道：腦死亡病人的血清中IL-1和TNF-α濃度明顯升高，胰腺組織TNF-α蛋白表達上調[5]。本研究發(fā)現腦死亡大鼠胰腺組織中炎癥相關基因IL-1β、TNF-α、VCAM-1和ICAM-1表達上調，中性粒細胞浸潤明顯增多，NF-κB通路被激活。這些研究結果顯示腦死亡引起了供體胰腺組織中的炎性反應，進一步驗證腦死亡可以引起全身炎性反應。腦死亡階段激活的炎性反應可以導致胰腺損傷。胰高血糖素樣肽-1受體激動劑Exendin-4預處理腦死亡大鼠，可以下調胰腺組織中IL-1β基因表達，增強胰島細胞的活力及葡萄糖刺激后胰島素分泌能力[9]。IL-1受體拮抗劑預處理腦死亡大鼠，可以下調炎性細胞因子的表達，抑制中性粒細胞的遷移和激活，改善細胞線粒體功能障礙，提高胰島活力及移植效果[10]。然而，目前這些干預方法尚未應用于臨床，仍需探索新的治療方式。

本研究發(fā)現用TCY-NH2處理腦死亡大鼠，可以減輕腦死亡大鼠胰腺組織的炎性反應，主要表現為中性粒細胞浸潤減少、細胞因子(IL-1β、TNF-α、VCAM-1和ICAM-1)表達下調、NF-κB通路被抑制(p-IκBα和p-p65的蛋白表達明顯降低，IκBα蛋白表達明顯升高)。NF-κB信號是炎性反應中的經典通路，炎性信號刺激細胞后，胞內的IκB發(fā)生磷酸化，隨后被蛋白酶降解以釋放NF-κB，促使NF-κB激活并轉至細胞核[11]；p65是NF-κB的重要組分，其磷酸化可增強NF-κB的轉錄活性，調控IL-1β、IL-6、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1等炎性細胞因子的表達，參與機體炎性反應[12]。ICAM-1和VCAM-1是介導白細胞和血管內皮細胞間黏附的重要分子，促進白細胞游走并參與炎性反應[13-14]。我們認為上調的ICAM-1和VCAM-1參與腦死亡供體胰腺組織中的中性粒細胞浸潤。中性粒細胞作為血液中占比最高的白細胞，是急性期炎性反應的參與者，釋放促炎細胞因子以募集白細胞或誘導細胞損傷，參與糖尿病人胰腺及相關靶組織的病理進展過程[15]。綜上，我們認為TCY-NH2通過抑制NF-κB通路，下調炎性因子表達，減少中性粒細胞募集，降低腦死亡供體胰腺組織中的炎性反應。

本研究發(fā)現腦死亡大鼠胰腺組織中細胞凋亡明顯增加、cl-Caspase3蛋白明顯上調，與我們之前在腦死亡供體肝臟中的研究發(fā)現一樣[16]。腦死亡供體胰腺中上調的IL-1β和TNF-α可能引起細胞凋亡的重要誘因。文獻報道：IL-1β在腦死亡供胰獲取、分離、培養(yǎng)、植入過程大量產生，能啟動或放大急性炎性反應，減少胰島β細胞內胰島素的合成和分泌或引起胰島β細胞凋亡，導致移植失敗[17]；TNF-α是經典的細胞凋亡誘導分子，與其受體結合后激活胰腺細胞凋亡[18]。下調或阻斷這些炎性介質可以減輕炎性反應和細胞凋亡，然而目前鮮有臨床干預方法。

本研究發(fā)現用TCY-NH2處理腦死亡大鼠，可以減輕腦死亡大鼠胰腺組織中細胞凋亡，明顯下調Bax和cl-Caspase3的蛋白表達，明顯上調Bcl2蛋白表達。Bax蛋白在線粒體外膜形成低聚體，參與細胞色素C的釋放，促進內源性細胞凋亡；相反Bcl2蛋白通過阻斷Bax蛋白低聚反應，抑制線粒體細胞凋亡途徑；Caspase3在凋亡過程中被降解剪切成活性形式，是細胞凋亡的執(zhí)行蛋白；過表達Bcl2、敲除Bax或抑制Caspase3均可抑制細胞凋亡[19]。有研究表明：TCY-NH2是選擇性PAR4拮抗肽，可抑制小鼠顱腦損傷組織中細胞凋亡[20]；敲除PAR4基因抑制了小鼠心肌缺血再灌注中的細胞凋亡和Caspase3蛋白活性，同時上調Bcl2蛋白表達水平[21]。因此，我們認為TCY-NH2能減輕腦死亡誘導的胰腺細胞凋亡。

綜上所述，本研究表明TCY-NH2可以減輕腦死亡供體胰腺中炎性反應和細胞凋亡，為提高腦死亡供胰質量提供潛在的干預方法。