血管新生因子bFGF和miR-210與腦微出血的相關(guān)性

劉美玉 郭 霞 吳麗娥 武俊平 賈 璐 張 佳 雍 雯 于文龍 白茹玉 禹延雪

內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010

腦微出血（cerebral microbleeds，CMBs）是腦小血管病變導(dǎo)致血管周圍含鐵血紅素沉積的顯微病理結(jié)果［1］，其影像表現(xiàn)主要是由于病理性鐵蓄積導(dǎo)致局部磁化率的改變，在T2加權(quán)或磁敏感加權(quán)（SWI）成像上表現(xiàn)為直徑2～5 mm 的圓形低信號病灶［2］。

CMBs無明顯的臨床表現(xiàn)，但其不斷進(jìn)展會引發(fā)相關(guān)不良后果。至今已有大量研究發(fā)現(xiàn)，CMBs是導(dǎo)致血管認(rèn)知功能下降、精神障礙、步態(tài)異常等臨床損害以及反復(fù)出血性或缺血性腦卒中、腦淀粉樣血管病、阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)科多種疾病的重要危險(xiǎn)因素［1，3-5］。由于CMBs病理、影像檢查的局限性，使其在早期診斷、檢測疾病進(jìn)展方面受到很大限制，也促使更多研究者把研究重點(diǎn)放在與CMBs相關(guān)的生物標(biāo)記物上。本文重點(diǎn)關(guān)注血清堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和微小RNA-210（microRNA-210，miR-210）等血管新生因子與CMBs間的相關(guān)性，期望為預(yù)測、治療CMBs提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2018-12—2021-06 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科非急性腦血管病住院患者，行頭顱磁共振磁敏感成像（MRI-SWI）并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥40歲；（2）經(jīng)頭顱MRI檢查確診CMBs，符合中國腦小血管病診治專家共識2021中CMBs的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）發(fā)病時(shí)間＞4周。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性腦梗死、腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血患者；（2）動靜脈畸形、海綿狀血管瘤、毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、腦淀粉樣血管病、多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病等患者；（3）合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎衰竭者；（4）不能配合完善頭顱MRI 檢查者。

CMBs 影像診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］：（1）圓形或卵圓形、邊界清楚、均質(zhì)性、信號缺失灶；（2）直徑2～5 mm，最大不超過10 mm，周圍無水腫；（3）病灶被非腦溝區(qū)腦實(shí)質(zhì)圍繞；（4）T2*GRE 序列上顯示高光溢出效應(yīng)；（5）微出血灶在相應(yīng)部位的T1、T2序列上未顯示出高信號；（6）排除鈣化、鐵沉積、骨頭、海綿狀血管瘤、小血管流空影等其他原因；（7）影像學(xué)上除外彌漫性軸索損傷。

1.2 研究方法 記錄患者基本信息，包括年齡、性別、既往史、個人史，采用西門子3.0T 磁共振成像儀進(jìn)行頭顱MRI檢查，由經(jīng)驗(yàn)豐富的2名影像科醫(yī)師及2 名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師讀片明確是否腦微出血并做好記錄。抽取所有入組患者空腹靜脈血7 mL，4 mL用于實(shí)驗(yàn)室檢測，2 mL用于血清bFGF濃度檢測。采用人bFGF Quantikine ELISA 試劑盒檢測，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格參照產(chǎn)品說明書。1 mL用于miR-210相對表達(dá)量檢測，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)測定：①總RNA 提?。篢RNzol法提取總RNA；②反轉(zhuǎn)錄：將8 μL總RNA樣本與10 μ L 2×miRNA RT Reaction Buffer、2 μ L miRNA RT Enzyme Mix 混合制成反應(yīng)體系20 μL 的混合液，將混合液置于以下培育條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：42 ℃×60 min，95 ℃×3 min，將得到的cDNA反應(yīng)液用RNase-Free ddH2O 稀釋至200 倍置于冰上備用。③RT-PCR：取miRNA第一鏈cDNA 2 μL于冰上混合2 × miRcute Plus miRNA PreMix 10 μ L、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 0.4 μL，并用7.2 μL ddH2O 補(bǔ)足反應(yīng)體系為20 μ L 的混合液。將Real-Time PCR 儀設(shè)置擴(kuò)增條件：95 ℃×15 min、94 ℃×20 s、60℃×34 s過程共進(jìn)行40個循環(huán)，記錄各組標(biāo)本擴(kuò)增曲線、溶解曲線、CT 值。④從miRNA 數(shù)據(jù) 庫（http：//www.mirbase.org）查 找 所 要 研 究 的miRNA的序列。miR-210：5?-TTAATGCTAATCGTGA CT-3?；U6：5?-CTCGCTTCGGCAGCACA-3?。所有引物均由北京天根生化科技有限公司提供。⑤2-△△CT進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析：△CT=CT 目的基因—CT 內(nèi)參基因；△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)組—△CT對照組；待測樣品相對濃度=2-△△CT。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，以M（P25，P75）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，用率（%）表示。危險(xiǎn)因素分析采用多因素Logistic 回歸分析。應(yīng)用ROC曲線下面積評價(jià)bFGF、miR-210 對CMBs 的預(yù)測價(jià)值。所有統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組一般資料比較 共納入患者335 例，根據(jù)SWI 檢查結(jié)果分為CMBs 組176 例，非CMBs 組159例。2 組性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、糖尿病、缺血性心臟病、房顫史等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CMBs組高血壓、缺血性腦卒中患病率及腔隙性梗死（LI）灶、白質(zhì)病變（WMLs）評分高于非CMBs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 CMBs組與非CMBs組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between CMBs group and non-CMBS group

2.2 2組bFGF、miR-210水平比較 CMBs組bFGF、miR-210 水平均較非CMBs 高，2 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 2組bFGF、miR-210水平比較Table 2 Comparison of bFGF and miR-210 levels between two groups

2.3 CMBs 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 Logistic 回歸分析顯示，校正高血壓、缺血性腦卒中、LI 灶、WMLs 評分的影 響，bFGF（OR=1.313，95% CI：1.208～1.427）、miR-210（OR=2.110，95% CI：1.555～2.862）是CMBs的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表3。

表3 CMBs組和非CMBs組患者危險(xiǎn)因素多因素Logistic回歸分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of risk factors of patients in CMBs group and non-CMBS group

2.4 bFGF、miR-210對CMBs的預(yù)測價(jià)值 ROC曲線分析顯示，bFGF 濃度預(yù)測CMBs 的AUC 為0.937（95% CI 0.910～0.965），約登指數(shù)為79.4%，最佳截?cái)嘀禐?8.95 pg/mL，敏感度92.6%，特異度為86.8%。miR-210 相對表達(dá)量預(yù)測CMBs 的AUC 為0.873（95% CI 0.833～0.913），約登指數(shù)為68.7%，最佳截?cái)嘀禐?.72，敏感度92.0%，特異度為76.7%（P＜0.05）。見圖1。

圖1 bFGF、miR-210對CMBs的預(yù)測價(jià)值Figure 1 Prediction value of bFGF and miR-210 on CMBs

3 討論

CMBs 危險(xiǎn)因素及發(fā)病機(jī)制目前尚不能完全明確，既往研究認(rèn)為可能與年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥等眾多因素有關(guān)［7］，血-腦屏障損傷、內(nèi)皮功能障礙、β淀粉樣物質(zhì)沉積、炎性反應(yīng)、基因多態(tài)性等均可能參與CMBs 的發(fā)生［8-9］。本研究顯示，高血壓、腔隙性梗死灶數(shù)量、白質(zhì)病變評分、血管新生因子bFGF 及miR-210 是CMBs 的危險(xiǎn)因素。既往研究證實(shí)，血管新生可能作為不同病因引起CMBs的共同病理生理機(jī)制參與CMBs 的發(fā)生［10］。血管新生是在缺氧或炎癥細(xì)胞募集、血管生成促進(jìn)因子產(chǎn)生的環(huán)境下，基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和分化以及在血管支持細(xì)胞的調(diào)節(jié)下形成新血管的過程［11］。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一種重要的促進(jìn)血管生成因子，主要對內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用，產(chǎn)生細(xì)胞存活、運(yùn)動和增殖的信號，導(dǎo)致血管生成［12-13］，還可誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的纖維蛋白溶酶原激活劑，促使內(nèi)皮細(xì)胞形成新的毛細(xì)血管芽［14］。在腫瘤［15］及大腦低氧低灌注［16］中均發(fā)現(xiàn)，bFGF增高可促進(jìn)新生血管形成。視網(wǎng)膜和大腦中的微血管系統(tǒng)在胚胎學(xué)起源、解剖學(xué)特征、代謝活動以及血管化模式上有共同之處［17］，其病變一定程度上可以反映腦小血管改變。CMBs作為一種腦小血管病，其發(fā)病機(jī)制與糖尿病視網(wǎng)膜病變相似。有研究發(fā)現(xiàn)，bFGF作為極強(qiáng)的促血管生成因子，幾乎作用于新生血管形成的全過程，在糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期發(fā)揮了重要作用［18］。本研究顯示，CMBs 組bFGF 水平較非CMBs 組高，與CMBs 具有相關(guān)性，與以往研究結(jié)果相符；Logistic 回歸分析排除高血壓等干擾因素后，證實(shí)bFGF水平升高增加CMBs發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，是CMBs的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且ROC曲線顯示bFGF濃度預(yù)測CMBs的AUC為0.937，對CMBs有較高預(yù)測價(jià)值，因此，推測bFGF可能參與CMBs發(fā)生過程，可作為CMBs的預(yù)測指標(biāo)。

miR-210是一種低氧特異性miRNA，在缺氧環(huán)境下表達(dá)較為穩(wěn)定，在缺血后血管新生過程中發(fā)揮重要 作 用［19］。GONZALEZ-KING 等［20-21］研 究 發(fā) 現(xiàn)，miR-210 可通過缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的調(diào)控作用促進(jìn)組織血管生成。CHEN 等［22］發(fā)現(xiàn)miR-210 可靶向作用于成纖維細(xì)胞生長因子受體1（recombinant fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1），而bFGF與其受體結(jié)合后參與毛細(xì)血管基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移增生、膠原合成、小血管腔形成等過程。新生血管由于結(jié)構(gòu)尚不完整，有容易發(fā)生破裂、出血的特點(diǎn)［23］；另外，血管新生早期血-腦屏障通透性增加，造成血液成分外滲等一系列相關(guān)反應(yīng)［24］。已有研究證實(shí)，血管新生、血-腦屏障損害及內(nèi)皮功能障礙是CMBs 發(fā)生的重要機(jī)制［8］。本研究顯示，血管新生因子miR-210 在CMB 組水平較非CMBs 組高，與CMBs存在顯著關(guān)聯(lián)，是CMBs的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-210作為血管新生因子可能是CMBs發(fā)生的潛在機(jī)制之一，與上述結(jié)論一致。

眾多研究表明，隨著年齡的增長，CMBs 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加［25］，男性CMBs 的發(fā)病率較女性高［26］。本研究未發(fā)現(xiàn)年齡、性別對CMBs 的影響，但其現(xiàn)實(shí)意義仍不可忽略，尤其在現(xiàn)今社會，過度肥胖、男性吸煙、飲酒嗜好均是心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素，還需要更多的樣本分析其與CMBs發(fā)病的關(guān)系。

血清bFGF、外周血miR-210 與CMBs 相關(guān)，可預(yù)測CMBs 的發(fā)生。本研究尚存在不足之處，未進(jìn)行CMBs 部位及數(shù)量分型研究，有待分析bFGF、miR-210在不同數(shù)量、部位CMBs中表達(dá)量，期望從研究分子致病機(jī)制出發(fā)進(jìn)一步探究miR-210、bFGF 致CMBs的具體機(jī)制。