RNF4在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進展

高于婷 張如意 蔡 飛

1）湖北科技學院醫(yī)學部藥學院，湖北 咸寧 437100 2）湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北 咸寧 437100

研究表明，神經(jīng)疾病如脊髓小腦共濟失調(diào)（spinocerebellar ataxia，SCA）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、帕金森綜合征（Parkinson’s disease，PD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、腦缺血/再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，I/R）等發(fā)病率逐年升高，給患者帶來嚴重的經(jīng)濟和精神負擔。研究發(fā)現(xiàn)，適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)是細胞能夠應(yīng)對外在和內(nèi)在危險的關(guān)鍵細胞機制［1］，然而，蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激會導致蛋白質(zhì)錯誤折疊，末端錯誤折疊蛋白的積累可以觸發(fā)與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)有毒蛋白聚集體的形成。RNF4 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種可以參與錯誤折疊蛋白質(zhì)降解的泛素連接酶，其主要在小鼠胚胎發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中表達，在背根神經(jīng)節(jié)和發(fā)育中的性腺也有較強的表達［2］。以上研究表明RNF4 在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，提示RNF4這一降解錯誤折疊蛋白質(zhì)的泛素連接酶可能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用。本文就RNF4在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進展進行綜述，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制及防治提供新的思路。

1 RNF4的生物學特征及生理功能

1.1 RNF4 的生物學特征 RNF4 發(fā)現(xiàn)于20 世紀90年代末，由RNF4 基因編碼，位于人類染色體4p16.3上，由190個氨基酸組成［3-4］。RNF4家族包括釀酒酵母Slx5、裂殖酵母Rfp1、裂殖酵母Rfp2、網(wǎng)柄菌屬MIP1、果蠅屬CG10981和人類的RNF4和RNF111［5］。從結(jié)構(gòu)上看，RNF4同源物包含有4個N末端SIMs和1個C末端RING指狀域，其中SIMs可以識別SUMO修飾的蛋白，并通過環(huán)結(jié)構(gòu)域催化其泛素化，從而物理連接泛素和SUMO通路，潛在地調(diào)節(jié)真核基因組的穩(wěn)定性［6］。定點誘變試驗結(jié)果表明，SIM2 和SIM3 在結(jié)合SUMO-2鏈中起主要作用，是底物高效泛素化的關(guān)鍵，而SIM1和SIM4起次要作用［7］。RNF4的C端環(huán)狀結(jié)構(gòu)域則主要促進同源二聚體化以及與E2結(jié)合酶的相互作用［8］。

RNF4 作為一種SUMO 靶向泛素連接酶，在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，同時也是一種環(huán)蛋白，在發(fā)育中的神經(jīng)和生殖系統(tǒng)中表達，尤其在睪丸中的表達水平非常高，在小鼠胚胎發(fā)育中的背根神經(jīng)節(jié)中表達次之，而在脾臟、腎臟、結(jié)腸、心臟等組織中表達水平則相對較低，這表明RNF4可能在發(fā)育和細胞生長程序的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。另外，有研究顯示，RNF4 可調(diào)節(jié)類固醇受體依賴性轉(zhuǎn)錄和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄，并與多種參與細胞生長控制的核蛋白相互作用。

1.2 RNF4 的生理功能 RNF4 可通過直接控制自身SUMO 化的E2 結(jié)合酶Ubc9 和自身SUMO 化的E3連接酶來維持SUMO 信號的動態(tài)平衡［10］。在RNF4家族成員中，RNF4 和RNF111 被證明具有SUMO 靶向泛素連接酶的功能［11］。有研究證明在siRNA清除RNF4 表達的人類細胞中，積累了高分子量的SUMO形式，表明RNF4參與了體內(nèi)SUMO鏈修飾蛋白的降解。此外，在26S 蛋白酶體抑制劑［12］存在的情況下，高分子量的SUMO 偶聯(lián)物也會大量增加，進一步表明SUMO 修飾在泛素介導的蛋白水解中起作用［13］。總的來說，RNF4具有SUMO E3 連接酶活性、泛素連接酶活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能［14-16］。

研究表明，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)主要通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome system，UPS）和自噬系統(tǒng)進行降解。而神經(jīng)退行性疾病的形成與錯誤折疊蛋白的積累密切相關(guān)，細胞中RNF4和STUbL系統(tǒng)共同參與錯誤折疊蛋白質(zhì)的降解。然而，RNF4的調(diào)節(jié)功能不僅僅是標記細胞蛋白以實現(xiàn)泛素介導的降解，RNF4的修飾還可以改變底物的亞細胞定位和功能動力學［17］。RNF4 作為SUMO 靶向的泛素連接酶介導了SUMO 化和泛素修飾融合，作為重要的細胞機制，涉及多種病理過程，包括癌癥、心血管疾病、免疫疾病、神經(jīng)疾病以及衰老［18］。因此，RNF4 在體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生理作用，其本身、受體、信號通路的研究是眾多潛在疾病的治療靶點。

2 RNF4與神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間的關(guān)系

2.1 RNF4與脊髓小腦共濟失調(diào)之間的關(guān)系 脊髓小腦共濟失調(diào)7型（spinocerebellar ataxia 7，SCA7）是一種遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特征是小腦及其相關(guān)結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)元嚴重喪失，以及黃斑變性［19-20］。突變的、錯誤折疊的共濟失調(diào)蛋白7（polyQ-ATXN7）在細胞核內(nèi)積累，RNF4 則有助于ATXN7 突變體的清除。研究表明，RNF4 和SUMO2 的過表達顯著降低了polyQ-ATXN7 的水平，且在蛋白酶體抑制后，polyQ-ATXN7 的多聚泛素化顯著增加，這表明RNF4能夠泛素化并降解SUMO2 修飾的polyQ-ATXN7，減少錯誤折疊的polyQ-ATXN7。此外，有文獻證明，蛋白酶體的活性會隨著衰老過程而下降，在幼年小鼠中，SUMO 化通過活躍的蛋白酶體有助于突變的ATXN7 的降解，但在老年小鼠中，這種降解會受到影響，因此，ATXN7 的包涵物會隨著時間的推移而增加［21］，并且研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體功能障礙通常與晚發(fā)性疾病有關(guān)，如阿爾茨海默癥、帕金森癥或亨廷頓?。?2］。RNF4可識別和泛素化錯誤折疊蛋白，使這些錯誤折疊的蛋白成為蛋白酶體降解的靶標。除SCA7 外，RNF4 在脊髓小腦性共濟失調(diào)1 型（spinocerebellar ataxia type 1，SCA1）中也發(fā)揮類似作用。突變體ataxin-1 被SUMO2 修飾，并通過RNF4靶向進行降解。另外，有研究發(fā)現(xiàn)RNF4消除錯誤折疊的蛋白質(zhì)的功能依賴于SUMO2/3，因為這種能力在缺乏SUMO2/3 的細胞中受到損害，但在缺乏SUMO1 的細胞中沒有。以上研究揭示了RNF4 通過SUMO修飾及泛素化去除錯誤折疊蛋白，并在對抗錯誤折疊蛋白類疾病中發(fā)揮作用［23］。

2.2 RNF4與肌萎縮側(cè)索硬化癥之間的關(guān)系 肌萎縮側(cè)索硬化癥是一種罕見的累及上、下運動神經(jīng)元的神經(jīng)退行性疾病，臨床研究發(fā)現(xiàn)ALS 患者存在認知和行為功能的損害［24］，其發(fā)病機制復雜，至今仍無定論，目前認為ALS 的發(fā)病機制與免疫紊亂和異常蛋白質(zhì)積累有關(guān)。在ALS 發(fā)生和發(fā)展過程中，神經(jīng)元內(nèi)蛋白質(zhì)的降解受到明顯抑制，異常蛋白質(zhì)在神經(jīng)元內(nèi)過度積聚，形成具有不同特征表現(xiàn)的包涵體，并發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，造成神經(jīng)元的變性、壞死［25］。為了避免有毒的蛋白質(zhì)聚集，細胞進化出了細胞核和細胞質(zhì)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)，有人提出RNF4是哺乳動物PQC 系統(tǒng)的一部分，該系統(tǒng)通過SUMO 化和泛素化去除細胞核中錯誤折疊的蛋白質(zhì)［21，23，26］。RNF4 還可調(diào)節(jié)應(yīng)激顆粒（stress granule，SGs）中ALS相關(guān)FUS突變體的區(qū)域化［22］。作為對蛋白毒性應(yīng)激的響應(yīng)，細胞通過觸發(fā)mRNAs 和RNA 結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）在胞漿SGs 中的瞬時儲存來限制毒性蛋白質(zhì)的合成，有研究證明，細胞核STUbL 通路與SG 動力學的調(diào)節(jié)有關(guān)。在壓力情況下，許多RBPs和SG成分被SUMO啟動的泛素化所靶向。此外，有證據(jù)表明，SUMO2和RNF4是正確清除熱或亞砷酸鹽誘導的SGs 所必需的。通常ALS 蛋白的致病突變，如FusP525L，也會導致SG 動力學的改變。目前的概念是，突變體積累在細胞質(zhì)中，它們誘導SGs從液體到固體的異常轉(zhuǎn)變，最終可能導致病理性包涵體的形成，這一過程在STUbL 途徑缺陷時會加劇，如在SUMO2/3或RNF4耗盡時FusP525L與SGs的結(jié)合增強，那么RNF4泛素化突變蛋白的程度就會有所下降［27］。因此通常認為，通過SUMO-RNF4途徑靶向RBPs 可以清除這些蛋白在細胞核中錯誤折疊的亞組分。然而，由于蛋白質(zhì)的錯誤折疊是不可避免的，而且往往不能因突變、生物遺傳錯誤或不可修復的損傷而逆轉(zhuǎn)，細胞最終依賴降解系統(tǒng)維持蛋白質(zhì)質(zhì)量。但目前對這些系統(tǒng)仍知之甚少，盡管泛素-蛋白酶體途徑以及自噬一定是這些系統(tǒng)的重要組成部分，但它們?nèi)绾芜x擇性地識別錯誤折疊的蛋白質(zhì)并將其靶向降解的關(guān)鍵問題仍難以捉摸。

2.3 RNF4與亨廷頓舞蹈癥之間的關(guān)系 亨廷頓舞蹈癥（Huntington’s disease，HD）是一種遲發(fā)性的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為運動、認知以及記憶功能的喪失，患者發(fā)病后15～20 a 死亡。該病具有高度的腦區(qū)選擇性，主要侵害基底神經(jīng)節(jié)和大腦皮質(zhì)，表現(xiàn)為紋狀體投射性GABA神經(jīng)元和大腦運動皮層錐體神經(jīng)元死亡［28］。至今為止，HD發(fā)病分子機制尚不清楚，但是越來越多的證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常與HD 發(fā)生密切相關(guān)［29］。突變的亨廷頓蛋白（HTT）是HD的病原體，該蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)過度聚集會形成大的分子團，從而影響神經(jīng)細胞的正常功能導致HD的發(fā)生。在亨廷頓病細胞模型中，細胞活力和基因表達譜會發(fā)生改變。利用酵母模型系統(tǒng)，研究者證明了SUMO靶向泛素連接酶SLX5降低了HD病原體亨廷頓蛋白的突變、易于聚集的片段HTT 相關(guān)的毒性和異常轉(zhuǎn)錄活性。在功能上還發(fā)現(xiàn)SLX5 的額外拷貝特異性地減少了胞漿中的HTT聚集體以及細胞核中與染色質(zhì)相關(guān)的HTT 聚集體。那么，RNF4 作為SLX5的同源基因，可能也具有抑制人類細胞系中易于聚集的HTT 的異常轉(zhuǎn)錄活性。最后，通過基因分析發(fā)現(xiàn)SLX5和RNF4分別降低了HTT在酵母和人類細胞中的轉(zhuǎn)錄活性［30］。以上研究提示STUbL作為一種保守的機制，可以防止HTT 等聚集蛋白在染色質(zhì)上積累，并抑制其在酵母和哺乳動物細胞中的錯配轉(zhuǎn)錄活性，這一機制為未來HD的治療提供了一個新的研究思路。

2.4 RNF4 與多巴反應(yīng)性肌張力障礙之間的關(guān)系多巴反應(yīng)性肌張力障礙（dopa-responsive dystonia，DRD）是由生物胺神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常導致的與遺傳相關(guān)的運動障礙性疾?。?1-32］，大多由編碼多巴胺和四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）生物合成過程中酶的基因突變引起，如三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶Ⅰ（guanosine triphosphate cyclohydrolase Ⅰ，GCH1）基因、酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）基因和墨蝶呤還原酶（sepiapterin reductase，SPR）基因［33］。研究發(fā)現(xiàn)，RNF4作為共激活因子參與了GCH基因的表達，GCH 近端啟動子上的RNF4 反應(yīng)元件定義為CCAAT 盒；RNF4 對該CCAAT 盒無特異的DNA 結(jié)合活性，提示RNF4可能是CCAAT和結(jié)合蛋白核因子Y（nuclear factor Y，NF-Y）的共激活因子；另外，將RNF4 導入神經(jīng)母細胞瘤細胞系，觀察到內(nèi)源性GCH mRNA 水平的升高，以及RNF4 與內(nèi)源性GCH啟動子在染色質(zhì)免疫沉淀中的相互作用［34］。以上發(fā)現(xiàn)不僅為GCH 的調(diào)控提供了分子基礎(chǔ)，而且擴展了RNF4介導的基因激活機制的認識。蛋白質(zhì)生成、穩(wěn)定性和降解性之間的平衡是至關(guān)重要的。研究發(fā)現(xiàn)女性患者更容易受到HPD/DRD 的影響［35］，而RNF4可與雄激素受體和雌激素受體等類固醇受體相互作用［36-37］，通過與雄激素受體（androgen receptor，AR）的DNA結(jié)合域相互作用，作為AR反應(yīng)啟動子的輔助激活因子。因此，了解RNF4 是否與HPD/DRD 中GCH基因表達的性別差異具有非常重要的意義。

2.5 RNF4與多形性膠質(zhì)母細胞瘤之間的關(guān)系 多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）作為顱內(nèi)惡性程度最高的惡性腫瘤，患者多于確診2 a 內(nèi)死亡，具有血供豐富、高度浸潤以及逃逸攻擊等機制［38］。膠質(zhì)瘤中存在一種具有干細胞樣特征的腫瘤細胞亞群，稱為膠質(zhì)瘤起始細胞（glioma initiating cell，GICs）。GIC 表現(xiàn)出持續(xù)的自我更新，并驅(qū)動腫瘤的啟動、增殖和放射/化療耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，在人腦膠質(zhì)瘤中，Hey1表達上調(diào)與USP11和PML下調(diào)以及惡性程度高相關(guān)。早幼粒細胞白血?。╬romyelocytic leukemia，PML）蛋白可控制多種腫瘤抑制功能，并通過不完全特征化的翻譯后修飾機制在不同類型的人類癌癥中下調(diào)。有證據(jù)表明，泛素介導的蛋白酶體降解是導致腫瘤中PML下調(diào)的關(guān)鍵機制［39］。而RNF4可介導SUMO化的PML降解，這一過程可能在GBM的發(fā)展中起作用，因此，科學家們找到RNF4 的一個功能相互作用因子USP11，USP11 是一種泛素蛋白酶，在正常生長條件下具有中和RNF4的能力。USP11 的耗盡導致核體數(shù)量的減少，而RNF4的耗盡則導致相反的結(jié)果，證明了USP11可以去泛素化和穩(wěn)定PML［40］。因此研究者們確定了一條PML 降解途徑，其中Notch 效應(yīng)子Hey1 抑制PML 特異性去泛素化酶USP11，以增強PML泛素化和降解，這種途徑在膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)出來，在GBM中高度激活，并與GBM和GICs的惡性特征有關(guān)，阻斷此通路可能是治療侵襲性GBM的一種治療策略［41］。

3 結(jié)語及展望

RNF4 是一種SUMO 靶向的泛素連接酶，通過泛素蛋白酶體途徑和細胞信號調(diào)控參與多種病理生理過程，其中泛素并且靶向降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)在研究神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。此外，其可通過參與轉(zhuǎn)錄過程以及作為核因子的共激活因子在某些神經(jīng)疾病中發(fā)揮作用。但是以上研究都是在動物體內(nèi)進行的，在人類是否會產(chǎn)生同樣的作用有待進一步研究。另外，RNF4對神經(jīng)退行性疾病是否還有其他通路共同作用尚不明確；RNF4對錯誤折疊蛋白的調(diào)節(jié)作用是通過單一通路還是多個通路共同作用尚不明確；如能設(shè)計出RNF4小分子類似物或其激動劑將有助于以RNF4為靶點治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。