蒙藥驗(yàn)方《亞日飲湯》提取物對(duì)H37RV感染小鼠血清IFN-γ的影響

布仁特古斯，陸 宇，馬媛媛，照 娜，烏日古瑪拉，圖門(mén)烏力吉*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010；2.北京市胸科醫(yī)院 藥物實(shí)驗(yàn)室；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 蒙醫(yī)科)

結(jié)核病目前仍然是嚴(yán)重威脅人類健康的重大傳染病之一[1]，也是當(dāng)下僅次于新型冠狀病毒肺炎的第二大單一感染源致死原因，對(duì)全人類生命健康造成重大威脅[2-4]。2021年10月14日，世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布了《2021年全球結(jié)核病報(bào)告》，全球因新冠肺炎大流行引起結(jié)核診治服務(wù)供需中斷，導(dǎo)致結(jié)核病死亡人數(shù)增加、發(fā)病率下降趨勢(shì)緩慢。我國(guó)2020年估算的結(jié)核病新發(fā)患者數(shù)為84.2萬(wàn)，在30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中我國(guó)估算結(jié)核病發(fā)病數(shù)排第2位[5]。因此研發(fā)高效、低毒、無(wú)耐藥、廉價(jià)的抗結(jié)核新藥仍是當(dāng)務(wù)之急。從豐富的民族醫(yī)藥資源中尋找有效的抗結(jié)核藥物，已引起越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外研究者的重視[6]。機(jī)體在清除結(jié)核分枝桿菌過(guò)程中CD4+Th1和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫及其分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-12起重要作用[7]，《亞日飲湯》是治療頸部淋巴腺結(jié)核蒙藥驗(yàn)方，其作用機(jī)理至今不清。研究發(fā)現(xiàn)該藥體外并無(wú)抗結(jié)核桿菌作用，其代謝產(chǎn)物亦無(wú)直接抑制結(jié)核桿菌作用[8]。對(duì)于結(jié)核病體液免疫并無(wú)保護(hù)作用[9]，因此，認(rèn)為該藥可能通過(guò)提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能來(lái)發(fā)揮治療結(jié)核病的作用。結(jié)核病的發(fā)病與多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子相關(guān)，資料顯示IFN-γ是與結(jié)核病細(xì)胞免疫關(guān)系最密切的細(xì)胞因子[10]，故本研究通過(guò)氣溶膠建立H37RV感染小鼠模型，給予亞日飲湯治療后，采用ELISA法測(cè)定血清IFN-γ的水平，間接了解該藥對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響，預(yù)期揭示該藥的可能作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試劑去離子水、1×PBS、2N H2SO4、吐溫-20。ELISA檢測(cè)試劑盒：ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse IFN-γ kit購(gòu)于Biolegend公司。包被板：ELISA MAXTMUncoted Plates購(gòu)于Biolegend公司。密封膜、1.5 ml離心管。

1.2 方法

氣溶膠感染制備小鼠急性結(jié)核病模型，BALB/C小鼠，雄性，體重18-20 g，60只，分空白組；模型組；異煙肼組；亞日飲湯低、中、高劑量組，共6組，每組10只。亞日飲湯提取物小鼠灌胃，高劑量組每日每只216 mg一次灌胃，中劑量組每日每只108 mg一次灌胃，低劑量組每日每只54 mg一次灌胃，陽(yáng)性藥物組(異煙肼)20 mg/kg·天，空白組和模型組給予相同體積生理鹽水(不超過(guò)1 ml)每日1次，造模后治療28天。取腹主動(dòng)脈血1 ml，室溫靜置凝血后以離心半徑 3 cm，3 000 r/min離心20 min，取上清，滅活后過(guò)濾除菌保存，采用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中IFN-γ，實(shí)驗(yàn)步驟按照“ ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IFN-γ ”檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品OD450-OD570差值的均值及設(shè)定的濃度值數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，通過(guò)散點(diǎn)圖添加趨勢(shì)線的方法，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品OD450-OD570差值的均值及設(shè)定的濃度值(pg/ml)

圖1 血清IFN-γ

2.2 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度以O(shè)D450—OD570的差值為x值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=866.6x-37.06，y值即為樣品濃度見(jiàn)圖2，模型組、亞日飲湯高、中、低劑量組的水平高于空白組、異煙肼組(P<0.05)，亞日飲湯高、中、低劑量組的水平高于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖2 血清IFN-γ

表2 血清IFN-γ濃度在空白組、模型組、異煙肼組、亞日飲湯組表達(dá)水平比較

3 討論

結(jié)核分支桿菌感染機(jī)體后是否發(fā)病取決于結(jié)核菌的數(shù)量、毒力和機(jī)體的免疫狀態(tài)，細(xì)胞免疫在抗結(jié)核保護(hù)性免疫中起主要作用[6]。IFN-γ可增加感染了結(jié)核分支桿菌的巨噬細(xì)胞活性氧中介物(ROI)和活性氮中介物(RNI)的產(chǎn)量來(lái)殺傷細(xì)菌[11]，IFN-γ還能增加高親和力Fc受體在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面表達(dá)，促進(jìn)這些細(xì)胞參與抗體依賴的細(xì)胞毒反應(yīng)[12]。IFN-γ是機(jī)體發(fā)揮抗結(jié)核保護(hù)性免疫的重要細(xì)胞因子，其在機(jī)體的水平與結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展、病程密切相關(guān)，它可通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，激活巨噬細(xì)胞，參與結(jié)核病的肉芽腫免疫反應(yīng)等多方面發(fā)揮抗結(jié)核免疫作用[13]。IFN-γ在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中存在明顯缺陷，導(dǎo)致個(gè)體肉芽腫形成少且組織壞死嚴(yán)重[14]。研究結(jié)果顯示許多中藥具有提高細(xì)胞免疫功能，從而有間接治療結(jié)核病作用[15]。中草藥免疫治療主要是非特異性調(diào)整人體免疫功能，如黃芪多糖、枸杞子多糖、刺五加多糖等能促進(jìn)IL-2、IL-3、IFN-γ 等細(xì)胞因子的分泌，明顯地提高機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能[16-17]。本研究結(jié)果顯示血清IFN-γ在亞日飲湯高、中、低劑量組的水平均高于空白組、模型組、異煙肼組(P<0.05)，證明亞日飲湯具有提高小鼠血清IFN-γ水平的作用，異煙肼組水平低于空白組，可能與異煙肼屬于一線抗結(jié)核藥物，具有直接殺傷結(jié)核桿菌作用，并非與提高免疫功能有關(guān)，空白組水平低于模型組，因空白組未曾受到H37RV感染，故只表現(xiàn)出固有免疫狀態(tài)，模型組水平高于空白組和異煙肼組，是因模型組受到H37RV感染后，血清IFN-γ水平有所升高，表明小鼠原有免疫狀態(tài)，但其水平升高明顯不及亞日飲湯組。綜上所述，我們認(rèn)為亞日飲湯可以提高H37RV感染小鼠模型血清中的IFN-γ水平，可能是該藥治療結(jié)核病作用機(jī)制之一。