間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口愈合的研究進(jìn)展

趙 云,李秀英，納 濤，姜金蘭*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 科研中心,吉林 長(zhǎng)春130033;2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京102629)

中國(guó)糖尿病患病率高達(dá)11%以上，糖尿病會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)口不愈合，糖尿病足等，為糖尿病患者帶來(lái)巨大的身體和精神創(chuàng)傷[1]。在糖尿病患者中，延遲創(chuàng)口愈合一直是一個(gè)主要的問(wèn)題，約15%的糖尿病患者常常伴有不愈合潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)[2]，據(jù)估計(jì)，這些難愈合性糖尿病皮膚創(chuàng)口的患者治療成本每年約為100億美元[3]。由此可見(jiàn)，開(kāi)展促進(jìn)糖尿病皮膚損傷愈合的相關(guān)研究，對(duì)提高我國(guó)乃至世界的糖尿病患者生存質(zhì)量、降低致殘率有重要意義。

創(chuàng)口愈合通常經(jīng)歷如下階段：止血、炎癥、增殖、收縮和重塑[4-5]。臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病創(chuàng)口的愈合過(guò)程與正常創(chuàng)口的愈合過(guò)程不同，糖尿病皮膚創(chuàng)口在愈合過(guò)程中會(huì)停滯在任意階段，導(dǎo)致創(chuàng)口難以愈合[6]。在糖尿病狀態(tài)下，由胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，創(chuàng)口附近處于高糖、無(wú)氧的環(huán)境，細(xì)胞進(jìn)行無(wú)氧氧化產(chǎn)生乳酸，創(chuàng)口附近pH降低，處于酸性環(huán)境，增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)，是導(dǎo)致創(chuàng)口慢性長(zhǎng)期炎癥進(jìn)而影響愈合的重要因素[7-8]。同時(shí)，在糖尿病患者創(chuàng)口愈合的整個(gè)階段，創(chuàng)口長(zhǎng)期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，同時(shí)在慢性炎癥及其他因素的作用下，導(dǎo)致創(chuàng)口缺氧、血管新生異常、神經(jīng)受損且表皮神經(jīng)數(shù)量減少[9]、生長(zhǎng)因子分泌減少、細(xì)胞外基質(zhì)成分累積與基質(zhì)金屬蛋白酶重構(gòu)失衡等問(wèn)題，是影響糖尿病創(chuàng)口愈合的重要原因。上述因素相互作用及促進(jìn)，最終導(dǎo)致糖尿病患者創(chuàng)口愈合緩慢甚至不愈合。

臨床中治療糖尿病皮膚創(chuàng)口通過(guò)控制血糖、預(yù)防創(chuàng)口感染、抗炎，當(dāng)糖尿病皮膚創(chuàng)口由于感染變得嚴(yán)重時(shí)，對(duì)患者創(chuàng)口進(jìn)行及時(shí)清創(chuàng)、必要時(shí)進(jìn)行介入甚至截肢等措施。傳統(tǒng)的治療方式對(duì)于全身狀況較差、病變較嚴(yán)重者的療效十分有限[10]。在使用抗生素控制感染時(shí)，還可能存在抗生素的濫用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)各種干細(xì)胞及其衍生物治療難愈合性皮膚創(chuàng)口進(jìn)行了大量的研究，研究表明，多種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及其衍生物可用于治療糖尿病難愈合創(chuàng)口，并且取得了顯著的療效[11]。本文主要對(duì)近5年MSC及外泌體(Exo)治療難愈合性皮膚創(chuàng)口的方式和相關(guān)機(jī)制展開(kāi)綜述。

1 MSC促進(jìn)難愈合糖尿病皮膚創(chuàng)口

在本世紀(jì)初，首次將MSC應(yīng)用于治療糖尿病皮膚創(chuàng)口，取得了優(yōu)異的治療效果。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，MSC促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口愈合的機(jī)制分為以下3點(diǎn)，①可以分泌多種生長(zhǎng)因子，促進(jìn)皮膚創(chuàng)口處的血管形成[12]、促進(jìn)膠原沉積[13]。②MSC可以促進(jìn)機(jī)體各種類型的細(xì)胞增殖和分化。③MSC可以分泌具有組織修復(fù)功能的外泌體。

不同來(lái)源的MSC能夠不同程度促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口的愈合。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[14](BM-MSC)、人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞[15](hMSCs)、脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞[16](AD-MSC)均能夠促進(jìn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型進(jìn)行全皮膚層切除的皮膚創(chuàng)口愈合，以上研究均表明，不同來(lái)源的 MSC都能有效的促進(jìn)糖尿病創(chuàng)口的愈合。

目前研究表明，MSC促進(jìn)糖尿病創(chuàng)口愈合的機(jī)制較為復(fù)雜，可能涉及多個(gè)系統(tǒng)和通路促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口的愈合，其中MSC可能通過(guò)促進(jìn)血管生成，調(diào)節(jié)創(chuàng)口處微環(huán)境，促進(jìn)膠原沉積，調(diào)節(jié)多種因子，最終促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口的愈合。

1.1 MSC通過(guò)分化促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口愈合具有自我更新和修復(fù)能力的MSC是一種多能干細(xì)胞，在組織工程學(xué)、胚胎工程、細(xì)胞工程、基因工程中MSC受到了廣泛的應(yīng)用。MSC被移植到創(chuàng)口后，在一定的條件下，可以促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生各種類型的細(xì)胞，如肌成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等參與創(chuàng)口的愈合[17-18]。

1.2 MSC分泌因子促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口愈合MSC能夠產(chǎn)生多種與促進(jìn)創(chuàng)口愈合相關(guān)的因子，如膠原Ⅰ型、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、生長(zhǎng)分化因子-11(GDF-11)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、上皮生長(zhǎng)因子(EGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等。Mona Saheli等[19]發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞是一種在愈合中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞。將MSC培養(yǎng)基用于治療糖尿病創(chuàng)口時(shí)，可以使成纖維細(xì)胞活力增高，并且bFGF基因表達(dá)明顯提高，以此促進(jìn)創(chuàng)口的愈合。Linhao Wang等[20]通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)包被MSC，增強(qiáng)生長(zhǎng)因子VEGF、PDGF、HGF、GDF-11和EGF的表達(dá)，能夠促進(jìn)創(chuàng)口的愈合。以上研究證明了MSC能夠通過(guò)分泌多種因子有效的促進(jìn)糖尿病創(chuàng)口的愈合。

2 MSC來(lái)源的Exo用于治療糖尿病創(chuàng)口

MSC可以通過(guò)直接分泌和旁分泌的方式釋放Exo等多種活性物質(zhì)，激活損傷部位的細(xì)胞修復(fù)、募集內(nèi)源性干細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)或再生機(jī)制，改善局部缺氧微環(huán)境，還可以通過(guò)增加膠原沉積、促進(jìn)血管生成、減少纖維化和抑制炎癥反應(yīng)等，對(duì)組織進(jìn)行修復(fù)[21]。MSC及其衍生物的移植成為治療難愈合性糖尿病皮膚創(chuàng)口的新希望。因此，MSC及其衍生物通過(guò)改善皮膚創(chuàng)口的血供及微環(huán)境，達(dá)到治療難治性糖尿病皮膚創(chuàng)口的目的[22-23]。

Exo屬于細(xì)胞外囊泡(EVs)的一類，其直徑大小為30-200 nm[24-27]。Exo是通過(guò)胞吐釋放到細(xì)胞外，并且攜帶有蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)，包括脂類、膜蛋白、核蛋白、核酸，這些物質(zhì)可以有效地調(diào)節(jié)長(zhǎng)距離或短距離的細(xì)胞間通訊，提供了與各種生理和病理過(guò)程相關(guān)的重要信息[28]。研究表明MSC分泌的Exo具有相當(dāng)于或大于MSC本身的組織修復(fù)能力。更重要的是與細(xì)胞移植相比，Exo介導(dǎo)的無(wú)細(xì)胞治療提供了更多的安全性，降低了MSC移植導(dǎo)致的異位組織形成的風(fēng)險(xiǎn)和免疫排斥的可能性[29]。Exo有望成為治療糖尿病難愈合創(chuàng)口更安全有效的方法。

Exo用于糖尿病創(chuàng)口的治療是一項(xiàng)較為新穎的研究思路，根據(jù)Exo的來(lái)源和性質(zhì)，通過(guò)與其他材料或者藥物協(xié)同使用，能夠發(fā)揮更好的治療效果。目前的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞來(lái)源的Exo可以增加血管的生成促進(jìn)難愈合性糖尿病皮膚創(chuàng)口的修復(fù)，Exo還可以通過(guò)不同的機(jī)制促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口的愈合。

2.1 促進(jìn)纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移Arsalan Shabbir等[30]使用bMSCs來(lái)源的Exo治療糖尿病創(chuàng)口，研究發(fā)現(xiàn)bMSCs來(lái)源的Exo可以促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口中成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口的愈合。Eun Wook Choi等[31]研究表明人脂肪干細(xì)胞來(lái)源的外泌體(ASC-exo)能刺激人真皮成纖維細(xì)胞(HDFS)的再生。在蛋白質(zhì)水平上，與皮膚再生相關(guān)的基因，如CD34、膠原Ⅰ型、彈性蛋白和角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)的表達(dá)升高。在RNA中，ASC-exo含有可抑制NPM1、PDCD4、CCL5和NUP62等基因的miRNA，刺激真皮成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞的再生。

2.2 促進(jìn)細(xì)胞因子高表達(dá)Jinwen Liu等[32]也發(fā)現(xiàn)hMSCs來(lái)源的Exo含有生成素-2(Ang-2)，作用于糖尿病創(chuàng)口中可以有效的促進(jìn)創(chuàng)口的愈合。Eun Wook Choi[33]等發(fā)現(xiàn)口腔黏膜表現(xiàn)出獨(dú)特的再生特性，有時(shí)被稱為胎兒樣創(chuàng)口愈合。從人口腔上皮細(xì)胞中提取的Exo，可以導(dǎo)致纖維細(xì)胞增殖呈劑量依賴性減少，生長(zhǎng)因子如HGF、VEGFA、FGF2和CTGF基因表達(dá)顯著增加。這些指標(biāo)都顯示口腔黏膜上皮細(xì)胞來(lái)源的Exo可以促進(jìn)創(chuàng)口的愈合。Mengdie Li等[34]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞來(lái)源的Exo可以抑制創(chuàng)口附近的TNF-α和IL-6的分泌，降低糖尿病創(chuàng)口的炎癥反應(yīng)。

2.3 促進(jìn)皮膚再上皮化Exos可通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移來(lái)加速創(chuàng)口愈合過(guò)程，以促進(jìn)糖尿病創(chuàng)口的血管生成，降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管形成和創(chuàng)口的再上皮化，加速糖尿病創(chuàng)口的愈合。Yin Hu等[15]發(fā)現(xiàn)將hMSCs分泌的Exo移植到小鼠的皮膚創(chuàng)口處，可促進(jìn)再上皮化，減少瘢痕，促進(jìn)血管生成。值得注意的是miR-21-3p在Exo中被發(fā)現(xiàn)高度富集，miR-21-3p是抑制磷酸酶、張力素同系物(PTEN)和發(fā)芽同系物1(SPRY1) 的關(guān)鍵介質(zhì)，是創(chuàng)口愈合的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)。Chun-Yuan Chen等[35]發(fā)現(xiàn)由人尿源性干細(xì)胞分泌的外泌體(USC-Exo)，通過(guò)富集促進(jìn)創(chuàng)口愈合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)創(chuàng)口再上皮化，增加膠原蛋白的沉積，從而有效促進(jìn)傷口的愈合。

通過(guò)以上的研究表明，不同細(xì)胞來(lái)源的Exo通過(guò)不同的機(jī)制均可以有效的治療難愈合性糖尿病創(chuàng)口。

3 Exo聯(lián)合藥物和材料更有效的促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)口的愈合

許多研究表明，除了直接使用Exo外，Exo與不同生物材料、納米顆粒、藥物聯(lián)合使用，通過(guò)控釋、物理吸引等方式，有效的提高了Exo治療糖尿病難愈合創(chuàng)口的治療效果。

3.1 Exo聯(lián)合阿托伐他汀(ATV)Muyu Yu等[36]使用阿托伐他汀處理后的bMSCs提取外泌體(ATV-Exos)，在治療糖尿病皮膚創(chuàng)口時(shí)，ATV-Exos促進(jìn)創(chuàng)口再生的能力優(yōu)于Exos，同時(shí)ATV-Exos和Exos在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和濃度上沒(méi)有顯著差異。ATV-Exos通過(guò)激活A(yù)KT/e NOS通路，miR-221-3p顯著上調(diào)，促進(jìn)血管的生成，最終有效的促進(jìn)了糖尿病創(chuàng)口的愈合。

3.2 Exo聯(lián)合高分子材料高分子材料具有良好的生物相容性，可用于Exo緩釋作用。Quan Shi等[1]從牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(GMSCs)中提取的Exo與殼聚糖/絲基水凝膠海綿相混合治療創(chuàng)口。由于水凝膠可以提供封閉無(wú)菌的環(huán)境，有效降低了感染的風(fēng)險(xiǎn)。水凝膠的緩釋功能，能夠有效延長(zhǎng)Exo在創(chuàng)口處的保留時(shí)間，能夠促進(jìn)糖尿病創(chuàng)口的愈合。Min Wang等[37]制備了一種熱敏性、可注射性、自愈性和粘著性的基于多糖的水凝膠支架，具有高效的抗菌活性、快速的止血能力、良好的紫外線屏蔽性能，與Exo相結(jié)合(FEP@exo)可以適應(yīng)糖尿病創(chuàng)口的酸性環(huán)境，達(dá)到控制釋放Exo，可以有效地促進(jìn)瘢痕組織形成和皮膚附件的愈合。Chenggui Wang等[38]開(kāi)發(fā)了一種可注射、自愈和抗菌的基于多肽的水凝膠,能有效控制Exo的釋放，加快血管生成效率，顯著提高了糖尿病全厚度皮膚創(chuàng)口的愈合效率。

3.3 Exo聯(lián)合納米粒子納米粒子通過(guò)不同的修飾或外源引導(dǎo)具有靶向性，Exo聯(lián)合納米粒子可以使Exo更多的聚集在皮膚創(chuàng)口附近，產(chǎn)生更好的治療效果。Xiuying Li等[39]制備了氧化鐵納米粒子標(biāo)記的外泌體(ExoNPs)，在尾靜脈注射ExoNPs后通過(guò)磁鐵誘導(dǎo)其積累在創(chuàng)口部位，這些積累在創(chuàng)口處的ExoNPs通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)血管的形成，增加了促細(xì)胞增殖因子CK19、PCNA和膠原在體內(nèi)的表達(dá)，促進(jìn)了糖尿病創(chuàng)口的愈合。該研究通過(guò)磁鐵吸引Exo所包裹著的納米顆粒，增加了Exo在體內(nèi)的趨向性，使其積累在創(chuàng)口部位，顯著增強(qiáng)療效，促進(jìn)創(chuàng)口的愈合。

4 總結(jié)

糖尿病皮膚創(chuàng)口的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，創(chuàng)口處微環(huán)境長(zhǎng)期處于酸性、缺氧、慢性炎癥等不利于愈合的因素下，傳統(tǒng)治療手段存在較大的局限性，往往不能達(dá)到令人滿意的治療效果。研究表明，MSC作為一種多能細(xì)胞，具有強(qiáng)大修復(fù)作用，同時(shí)Exo作為MSC的一種衍生物，能夠促進(jìn)血管形成、膠原沉積、再上皮化，減少感染、降低炎癥反應(yīng)，改善了糖尿病創(chuàng)口的局部微環(huán)境，促進(jìn)創(chuàng)口的愈合，在治療糖尿病皮膚創(chuàng)口取得良好的治療效果，并且通過(guò)與各種生物材料、納米粒子結(jié)合能夠更好的發(fā)揮治療效果。雖然目前MSC還不能直接用于治療患者，其中安全性和倫理道德存在較大的爭(zhēng)議，但隨著MSC作用機(jī)制不斷明確，Exo提取工藝的不斷進(jìn)步，更好地與各種生物材料、納米顆粒、藥物等相結(jié)合，上述問(wèn)題一定會(huì)逐步改善。MSC及其衍生物在臨床治療上的前景將非常廣闊，這必將給糖尿病難愈合皮膚創(chuàng)口的患者帶來(lái)更有效的治療方式。