長鏈非編碼RNA01139靶向調(diào)控微小RNA-300對口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

鄧 琳, 謝陸莉, 李 鯤

(四川省成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院 口腔科, 四川 成都, 610100)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)約占所有頭頸部腫瘤的90%, 是全球重要的公共衛(wèi)生問題[1]。盡管包括外科手術(shù)、放化療在內(nèi)的治療策略大大優(yōu)化，但OSCC患者總體5年生存率仍低于60%[2]。順鉑(DDP)化療是晚期OSCC患者局部治療的重要組成部分，可顯著提高生存率，但70%～80%的復(fù)發(fā)患者表現(xiàn)出對DDP的耐藥性[3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA, 通過在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達多種細(xì)胞過程中發(fā)揮作用。目前，多種lncRNA已被證實可通過抑制細(xì)胞增殖和遷移、促進細(xì)胞凋亡增加DDP耐藥細(xì)胞系對DDP的敏感性[4-5]。長鏈非編碼RNA01139(LINC01139)是一種腫瘤相關(guān)lncRNA, 肝癌中LINC01139表達上調(diào)，敲減LINC01139可抑制肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[6]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), LINC01139可能與微小RNA-300(miR-300)存在相互作用。研究[7]證實, miR-300-5p高表達可降低卵巢癌細(xì)胞的DDP耐藥性，但LINC01139是否通過靶向調(diào)控miR-300表達影響OSCC細(xì)胞的DDP耐藥性尚未可知。本研究探討LINC01139、miR-300對DDP耐藥OSCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響以及分子機制，以期為OSCC化療提供有效靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CAL-27細(xì)胞購于美國模式培養(yǎng)物保藏中心; DDP(純度≥99.9%)、噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司; LINC01139小干擾RNA(si-LINC01139)及其陰性對照(si-NC)、LINC01139過表達載體(pcDNA-LINC01139)、質(zhì)?？蛰d體(pcDNA)、miR-300模擬物(miR-300 mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miR-300抑制物(anti-miR-300)及其陰性對照(anti-miR-NC)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物均由上海吉瑪制藥公司提供; LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司; Transwell小室、基質(zhì)膠購于美國BD公司; 兔源細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體以及山羊抗兔二抗購于上海艾博抗公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理

參照文獻[8]建立口腔鱗癌DDP耐藥細(xì)胞株(CAL-27/DDP)。將對數(shù)期CAL-27細(xì)胞、CAL-27/DDP分別接種96孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/mL的DDP并干預(yù)處理48 h, 采用MTT實驗檢測細(xì)胞增殖抑制率。

1.3 實驗分組

將對數(shù)期CAL-27/DDP分為DDP+si-NC(轉(zhuǎn)染si-NC)組、DDP+si-LINC01139(轉(zhuǎn)染si-LINC01139)組、DDP+miR-NC(轉(zhuǎn)染miR-NC)組、DDP+miR-300(轉(zhuǎn)染miR-300 mimics)組、DDP+ si-LINC01139+anti-miR-NC(轉(zhuǎn)染si-LINC01139和anti-miR-NC)組、DDP+si-LINC01139+anti-miR-300組(轉(zhuǎn)染si-LINC01139和anti-miR-300)。以上各組在轉(zhuǎn)染后均采用0.25 μg/mL的DDP干預(yù)處理48 h。將pcDNA-LINC01139、pcDNA、si-LINC01139、si-NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，記為pcDNA-LINC01139組、pcDNA組、si-LINC01139組、si-NC組，使用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-300表達情況。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說明書進行。

1.4 qRT-PCR檢測LINC01139和miR-300表達

收集CAL-27細(xì)胞和各組CAL-27/DDP, 以Trizol法提取細(xì)胞總RNA, 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA, 采用SYBR Green Mix試劑進行qRT-PCR反應(yīng)[9]。采用2-△△Ct法檢測LINC01139和miR-300表達水平。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率

收集各組CAL-27/DDP細(xì)胞，按照1×104個/孔接種到96孔板, 24 h后每孔加入20 μL的MTT試劑，培養(yǎng)箱孵育4 h, 棄去上清液，加入150 μL的DMSO, 振蕩10 min溶解后，酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的光密度(OD)值[10-11]。

1.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲

細(xì)胞遷移: 收集各組CAL-27/DDP細(xì)胞，采用無血清DMEM將培養(yǎng)基調(diào)整為5×104個/mL的單細(xì)胞懸液。取200 μL細(xì)胞懸液、500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別加入Transwell上室、24孔板下室。細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h, 棉拭子擦去上室內(nèi)未穿膜細(xì)胞，甲醇固定20 min, 結(jié)晶紫染色10 min, 倒置隨機選擇5個視野計數(shù)、拍照，取均值[12-13]。細(xì)胞侵襲: 采用均勻包被基質(zhì)膠的Transwell小室，實驗前30 min水化后備用。

1.7 Western blot檢測CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白表達

細(xì)胞裂解緩沖液提取各組CAL-27/DDP總蛋白, Nanodrop 2000測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。將膜置于5%的脫脂牛奶中封閉后，稀釋的一抗溶液室溫孵育膜2 h, 稀釋的二抗溶液室溫孵育膜2 h, 增強型化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒暗室顯色。目的蛋白表達水平采用灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

將野生型/突變型(WT/MUT)LINC01139序列連接到PmirGLO雙熒光素酶表達載體以構(gòu)建WT/MUT-LINC01139, 該步驟由北京華大基因公司完成。利用Lipofectamine 2000將WT-LINC01139、MUT-LINC01139分別與miR-300(miR-300 mimics)、miR-NC共轉(zhuǎn)染至CAL-27/DDP, 轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒進行熒光素酶活性測定。同時將pcDNA、pcDNA-LINC01139、si-NC、si-LINC01139分別轉(zhuǎn)染CAL-27/DDP, 48 h后測定各組細(xì)胞miR-300表達水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

每組設(shè)置3個平行實驗，重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析, 2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DDP對CAL-27細(xì)胞和CAL-27/DDP增殖抑制率的影響

與CAL-27比較，同一DDP濃度對CAL-27/DDP的抑制率較低, CAL-27/DDP的IC50值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 順鉑對CAL-27細(xì)胞和CAL-27/DDP增殖抑制率的影響

2.2 CAL-27、CAL-27/DDP中LINC01139和miR-300的表達

與CAL-27比較, CAL-27/DDP中LINC01139的表達升高, miR-300的表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

表2 LINC01139和miR-300在CAL-27細(xì)胞和CAL-27/DDP細(xì)胞中的表達

2.3 抑制LINC01139表達聯(lián)合DDP(0.25 μg/mL)對CAL-27/DDP細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與DDP+si-NC組比較, DDP+si-LINC01139組CAL-27/DDP中LINC01139表達降低，增殖抑制率和p21蛋白表達升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表3、圖1。

圖1 增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達

表3 抑制LINC01139表達聯(lián)合DDP對CAL-27/DDP細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 miR-300過表達聯(lián)合DDP(0.25 μg/mL)對CAL-27/DDP細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與DDP+miR-NC組比較, DDP+miR-300組CAL-27/DDP中miR-300表達顯著升高，增殖抑制率和p21蛋白表達升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表4和圖2。

表4 miR-300過表達聯(lián)合DDP對CAL-27/DDP細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達

2.5 LINC01139靶向調(diào)控miR-300的表達

靶基因預(yù)測工具LncBase Predicted v.2分析顯示, LINC01139與miR-300存在特異性結(jié)合的核苷酸序列，見圖3。miR-300 mimics和WT-LINC01139共轉(zhuǎn)染CAL-27/DDP細(xì)胞熒光素酶活性較miR-NC和WT-LINC01139共轉(zhuǎn)染細(xì)胞降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); miR-300 mimics和MUT-LINC01139共轉(zhuǎn)染CAL-27/DDP細(xì)胞熒光素酶活性與miR-NC和MUT-LINC01139共轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表5。pcDNA-LINC01139組CAL-27/DDP細(xì)胞miR-300表達較pcDNA組降低, si-LINC01139組CAL-27/DDP細(xì)胞miR-300表達較si-NC組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表6。

圖3 LINC01139序列中含有與miR-300互補的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 LINC01139調(diào)控miR-300的表達

2.6 干擾miR-300表達逆轉(zhuǎn)了抑制LINC01139表達對CAL-27/DDP細(xì)胞DDP耐藥性的作用

與DDP+si-NC組比較, DDP+si-LINC01139組CAL-27/DDP中miR-300表達顯著升高，增殖抑制率、p21蛋白表達顯著升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著降低; 與DDP+si-LINC01139+anti-miR-NC組比較, DDP+si-LINC01139 +anti-miR-300組CAL-27/DDP中miR-300表達顯著降低，增殖抑制率、p21蛋白表達顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表7和圖4。

圖4 4組增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達

表7 干擾miR-300表達逆轉(zhuǎn)了抑制LINC01139表達對CAL-27/DDP細(xì)胞DDP耐藥性的作用

3 討 論

近年來研究[15]發(fā)現(xiàn), lncRNA在OSCC耐藥過程中起著重要的作用。lncRNA漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1(PVT1)在DDP耐藥組織和細(xì)胞系中經(jīng)常被上調(diào)，并且與較差的總體生存密切相關(guān)。在DDP耐藥OSCC細(xì)胞中同源框基因11反義RNA(HOXA11-AS)亦表達上調(diào)，敲減HOXA11-AS能夠降低DDP耐藥OSCC細(xì)胞的增殖，增加DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，抑制小鼠移植瘤的生長，為改善OSCC化療提供了潛在靶點[16]。干擾HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)表達可抑制OSCC細(xì)胞自噬，促進細(xì)胞凋亡，增加對DDP的敏感性[17]。本研究發(fā)現(xiàn), OSCC的DDP耐藥細(xì)胞株CAL-27/DDP中LINC01139表達升高，提示LINC01139異常表達可能與OSCC DDP耐藥有關(guān)。功能分析發(fā)現(xiàn)，抑制LINC01139表達可降低CAL-27/DDP的增殖、遷移和侵襲能力。p21是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，通過與CyclinD1、細(xì)胞周期依賴性激酶(CDKs)、CyclinD1/CDKs復(fù)合物結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，阻斷細(xì)胞增殖過程[18]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的重要成員，幾乎能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中所有蛋白成分，改變細(xì)胞間黏附，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的組織學(xué)屏障[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制LINC01139表達后CAL-27/DDP中CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達水平降低, p21表達水平升高，提示LINC01139在CAL-27/DDP增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮促進作用。

lncRNA與miRNA的相互作用是調(diào)控腫瘤生物學(xué)功能的重要機制[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-300為LINC01139下游候選靶點。miR-300的異常表達已被報道參與OSCC的發(fā)生和發(fā)展, OSCC患者miR-300水平降低，過表達miR-300可抑制OSCC細(xì)胞的增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[22]。miR-300通過靶向淋巴樣增強子結(jié)合因子1調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的生長和轉(zhuǎn)移[23]。lncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)通過負(fù)調(diào)控miR-300促進膽囊癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[24]。本研究顯示, miR-300在CAL-27/DDP中表達降低，過表達miR-300可促進CAL-27/DDP的增殖、遷移和侵襲，促進p21表達，抑制CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達水平。進一步實驗顯示, LINC01139對miR-300表達具有靶向負(fù)調(diào)控作用，且干擾miR-300表達能夠逆轉(zhuǎn)抑制LINC01139表達對CAL-27/DDP細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲抑制作用。因此, LINC01139/miR-300分子軸在OSCC 的DDP耐藥中發(fā)揮重要作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)LINC01139能夠促進OSCC的DDP耐藥性，抑制LINC01139可通過上調(diào)miR-300達到抑制CAL-27/DDP細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的目的，為改善OSCC化療提供了潛在靶點。