不同品系昆蟲病原線蟲抗逆性分析

馬 娟，郭笑笑，李秀花，王容燕，高 波，陳書龍

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071000）

昆蟲病原線蟲（entomopathogenic nematodes，EPNs）可以寄生昆蟲，其中的斯氏屬Steinernema和異小桿屬Heterorhabditis線蟲對(duì)地下害蟲[1,2]和一些鉆蛀性害蟲[3]都具有較好的防治效果，是一類新型高效生物殺蟲劑。昆蟲病原線蟲可以主動(dòng)搜尋寄主，具有殺蟲范圍廣、易于人工培養(yǎng)、使用安全等優(yōu)點(diǎn)[4]。昆蟲病原線蟲還可以與化學(xué)農(nóng)藥混用，在一些區(qū)域是可替代化學(xué)殺蟲劑的環(huán)境友好型生防因子，已在世界上很多地區(qū)進(jìn)行了商業(yè)化生產(chǎn)和銷售[5,6]。昆蟲病原線蟲成功地侵染寄主昆蟲需要適宜的外界條件，如合適的溫度、濕度和紫外輻射等。能否克服不良外界環(huán)境、成功在田間持續(xù)生存決定了昆蟲病原線蟲對(duì)害蟲的防控效果。近年來隨著抗干燥劑和抗輻射劑等保護(hù)性助劑的應(yīng)用，昆蟲病原線蟲防治效果不斷提高，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大[7]。然而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，土壤環(huán)境復(fù)雜，極端高溫、低溫或者干燥的條件都不利于昆蟲病原線蟲的實(shí)際應(yīng)用。因此，對(duì)不良環(huán)境具備較強(qiáng)耐受能力的昆蟲病原線蟲品系具有更廣泛應(yīng)用的價(jià)值。

當(dāng)前已報(bào)道的斯氏屬昆蟲病原線蟲有100個(gè)種，異小桿屬昆蟲病原線蟲有21個(gè)種[8]，它們對(duì)不良環(huán)境的抵御能力存在較大差異。吳霞等[9]對(duì)S.feltiae0619HT、S.bicornutum631PG、S.affine0619M、S.kraussei0657L、S.karii0663YC、H.megidis0627M、H.brevicaudis0641TY、H.marelatu0639G 八種昆蟲病原線蟲進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)S.kraussei抗低濕脅迫能力最強(qiáng)，異小桿線蟲抗低濕脅迫能力較斯氏線蟲弱；低濕脅迫對(duì)昆蟲病原線蟲致病力無顯著影響，且對(duì)S.felitiae和H.megidis的生殖力無顯著影響。Patel 等[10]研究后發(fā)現(xiàn)小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsae對(duì)快速干燥的耐性比S.feltiae、S.glasseri和S.riobrave更強(qiáng)。同一種類的昆蟲病原線蟲的不同地理種群之間，經(jīng)過適應(yīng)不同的生存環(huán)境，其抗逆能力也會(huì)發(fā)生較大變化。SteinernemafeltiaeIS-6 和IS-15品系（以色列）比S.feltiaeN8品系（德國(guó)）更耐干燥[11]。Somasekhar等[12]報(bào)道來自美國(guó)不同地理種群的S.carpocapsae線蟲對(duì)高滲和缺氧脅迫的耐受能力差異顯著。

為拓寬昆蟲病原線蟲防治害蟲的范圍和更有效地防治害蟲，需要不斷挖掘線蟲資源，系統(tǒng)研究其生物學(xué)、生理生化等特性，為昆蟲病原線蟲的田間應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)室多年來在我國(guó)不同地域采樣，陸續(xù)分離到大量昆蟲病原線蟲種群。本文中對(duì) 17個(gè)不同種類的EPN品系進(jìn)行了耐低溫、高溫和干燥等生物學(xué)測(cè)定，以期為生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的昆蟲病原線蟲種群，為不同種類的昆蟲病原線蟲的田間應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲

SteinernemacarpocapsaeAll為本實(shí)驗(yàn)室保存，HeterorhabditismegidisXY-4和S.litoraleB13由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所饋贈(zèng)。其他線蟲品系均由本實(shí)驗(yàn)室在不同地區(qū)土壤中采集獲得（表1）。不同種群的昆蟲病原線蟲均在 25 ℃用大蠟螟末齡幼蟲活體培養(yǎng)，采用 White trap法收集侵染期幼蟲（Infective juveniles，IJs），用滅菌水洗凈后備用，試驗(yàn)用線蟲保存時(shí)間不超過2周。

1.2 昆蟲病原線蟲耐熱性測(cè)定

將1 mL線蟲懸浮液（1000 IJs/mL）轉(zhuǎn)移至24孔板孔中，封口膜封口后置于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，分別于1、2、3、4、6、18 h后從每孔中取出100 μL線蟲液，加蒸餾水800 μL后，置于25 ℃恒溫箱內(nèi)。24 h后顯微鏡下檢查線蟲死亡數(shù)，物理刺激后不動(dòng)的線蟲判定為死亡。每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。以放置于25 ℃處理的線蟲為對(duì)照。分別統(tǒng)計(jì)各處理線蟲死亡率。

1.3 昆蟲病原線蟲耐低溫能力測(cè)定

取1 mL線蟲懸浮液（1000 IJs/mL）于24孔板中，用封口膜密封置于（-5±1）℃培養(yǎng)箱，分別于6、12、24、36、48、72 h后取出100 μL線蟲懸浮液，加蒸餾水800 μL后置于25 ℃培養(yǎng)箱中，24 h后鏡檢線蟲死亡數(shù)，判別線蟲死活方法同上。以放置于25 ℃處理的線蟲為對(duì)照，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

1.4 昆蟲病原線蟲耐干燥能力測(cè)定

取各品系侵染期線蟲，分別滴加1 mL含有1000條線蟲的甘油懸浮液（甘油濃度為25%）于24孔板中，封口后置于（25±1）℃培養(yǎng)箱中，分別于24、39、48、60、72 h后取出100 μL線蟲懸浮液，加蒸餾水2 mL后置于25 ℃培養(yǎng)箱中，24 h后鏡檢線蟲死亡數(shù)。以未添加甘油的線蟲液作為對(duì)照，每處理6個(gè)重復(fù)[13,14]。

1.5 昆蟲病原線蟲對(duì)大蠟螟的致死率

取不同品系昆蟲病原線蟲懸浮液，調(diào)整線蟲液濃度使其一致。24孔板中每孔放入2 g滅菌沙土，加入200 μL線蟲懸浮液（含50條線蟲），放入1頭大蠟螟末齡幼蟲，置于25 ℃培養(yǎng)箱中，24 h后檢查死亡率。每個(gè)處理8頭大蠟螟幼蟲，重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

百分?jǐn)?shù)值經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后運(yùn)用SPSS 16.0進(jìn)行方差分析，Tukey法檢驗(yàn)不同處理之間的差異顯著性，概率水平設(shè)P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲病原線蟲耐高溫測(cè)定

不同品系的昆蟲病原線蟲在25 ℃放置18 h后線蟲個(gè)體死亡率均低于3%。將不同種類的線蟲在40 ℃高溫處理不同時(shí)間后取出置于25 ℃，線蟲開始復(fù)蘇并恢復(fù)運(yùn)動(dòng)能力。在40 ℃處理18 h后所有線蟲幾乎全部死亡。不同種群的昆蟲病原線蟲耐熱能力不同，S.xinbinenseLFS48和S.sp ZLS3 耐熱能力顯著低于其他種群，經(jīng)40 ℃處理1 h 后就有90%以上線蟲個(gè)體死亡；S.hebeienseG6、S.feltiaeJY-90 和LFS67耐熱力亦較低，40 ℃處理1 h后，雖然三個(gè)種群線蟲個(gè)體死亡率低于6%，但是經(jīng)40 ℃處理2 h后線蟲幾乎全部死亡。高溫處理3 h后，所有參試的異小桿線蟲品系的死亡率均在15%以下，而參試的斯氏線蟲除S.tielingenseLFS65、S.ceratophorumHQA87 和S.carpocapsaeAll外，其余的幾乎全部死亡。HeterorhabditisbacteriophoraHQ-4和H.beicherrianaNCWZ1經(jīng)高溫處理4 h后線蟲個(gè)體死亡率低于10%，抗高溫能力相對(duì)較強(qiáng)。SteinernematielingenseLFS65、S.ceratophorumHQA87 和S.carpocapsaeAll線蟲對(duì)高溫的抗性強(qiáng)，連續(xù)高溫處理6 h后，線蟲個(gè)體死亡率仍低于10%；而其他種類的昆蟲病原線蟲幾乎全部死亡（表2）。

表2 不同品系昆蟲病原線蟲在高溫下（40 ℃）的死亡率Table 2 Mortality of different entomopathogenic nematode strains exposed to 40 ℃ stress

2.2 昆蟲病原線蟲耐低溫能力差異

不同品系的昆蟲病原線蟲在25 ℃放置72 h后線蟲個(gè)體死亡率均低于5%。Steinenemasp.ZLS3、S.carpocapsaeAll對(duì)低溫耐受性最好，-5 ℃處理72 h后線蟲個(gè)體死亡率分別為1.14%和1.93%；其次是S.feltiaeLFS67、S.feltiaeJY90和H.beicherrianaNCWZ1，-5 ℃處理72 h后線蟲個(gè)體死亡率低于40%。H.indicaHNPY2和S.litoraleB13線蟲的低溫耐受性差，-5 ℃處理24 h后線蟲死亡率分別是100%和81.72%，均顯著高于其他線蟲種群。經(jīng)過低溫處理72 h后，H.beicherriana種內(nèi)采集地不同的CD-11、LJ-24和NCWZ1三個(gè)品系線蟲死亡率分別為100%、84.14%和23.65%，差異顯著；S.feltiae種內(nèi)4個(gè)品系線蟲死亡率最低的為15.87%，最高的死亡率達(dá)到93%（表3）。

表3 不同品系昆蟲病原線蟲在低溫（-5 ℃）下的死亡率Table 3 Mortality of different strains of entomopathogenic nematode exposed to -5 ℃ stress

2.3 昆蟲病原線蟲耐干燥能力差異

不同昆蟲病原線蟲種類與品系耐干燥能力測(cè)試結(jié)果參見表 4。所測(cè)試的各昆蟲病原線蟲在 25 ℃放置72 h后線蟲個(gè)體死亡率均低于5%。經(jīng)25%甘油水溶液處理72 h后，Steinernemasp ZLS3、S.ceratophorumHQA87、S.carpocapsaeAll和S.hebeienseG6線蟲個(gè)體死亡率較低，分別為9.05%、7.25%、1.34%和15.86%，顯著低于其他品系線蟲的死亡率（P＜0.05）。所測(cè)試的異小桿線蟲H.bacteriophora、H.beicherriana、H.indica和H.megidis耐干燥性都較差，干燥處理24 h后線蟲死亡率均在85%以上。

表4 不同品系昆蟲病原線蟲經(jīng)25%甘油水溶液處理后在干燥條件下的死亡率Table 4 Mortality of different strains of entomopathogenic nematodes exposure to 25% glycerol

2.4 昆蟲病原線蟲對(duì)大蠟螟致病力測(cè)定

通過上述試驗(yàn)篩選出9種在高溫、低溫或干燥的環(huán)境條件下有較強(qiáng)抗性的線蟲品系，并測(cè)試其對(duì)大蠟螟末齡幼蟲的致病力（圖1）。在處理36 h后，S.ceratophorumHQA87、S.tielingenseLFS65、S.feltiaeJY-90和S.carpocapsaeAll對(duì)大蠟螟致死率達(dá)到100%。處理48 h后，H.beicherrianaLJ-24、S.feltiaeJY20-1對(duì)大蠟螟致死率也達(dá)到了 100%；對(duì)照大蠟螟無死亡。所測(cè)試的異小桿線蟲H.bacteriophoraHQ-4、H.beicherrianaNCWZ1對(duì)大蠟螟致死時(shí)間比所測(cè)試的斯氏線蟲稍長(zhǎng)，24 h時(shí)大蠟螟無死亡，48 h時(shí)大蠟螟死亡率分別為73%和92%。

圖1 不同品系昆蟲病原線蟲對(duì)大蠟螟末齡幼蟲致死率Fig.1 Infectivity of infective juveniles from different EPN strains to last instars of G.mellonella

3 討論

隨著我國(guó)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展，今后昆蟲病原線蟲在農(nóng)業(yè)害蟲防治中必將發(fā)揮重要的作用。當(dāng)前昆蟲病原線蟲已成功地應(yīng)用于很多農(nóng)業(yè)害蟲的防治[15,16]，但在實(shí)際生產(chǎn)中昆蟲病原線蟲的防治效果會(huì)受到線蟲種類及品系、環(huán)境條件和施用技術(shù)等制約。不良的環(huán)境條件影響昆蟲病原線蟲的存活、侵入、致病和繁殖，發(fā)掘環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的線蟲種群是拓展昆蟲病原線蟲在不同區(qū)域商業(yè)化應(yīng)用的保障。

土壤溫度是決定昆蟲病原線蟲防效的重要因素，較高或較低的溫度對(duì)線蟲的遷移、侵染寄主、繁殖和存活等都有不利的影響。已有報(bào)道不同種類EPN或不同來源的EPN品系對(duì)溫度的抗性存在差異[17,18]。由甘肅省采集的H.megidis在25 ℃時(shí)對(duì)大蠟螟致死率最高，而S.feltiae在15 ℃、25 ℃和30 ℃下對(duì)大蠟螟致死率無顯著差異[19]。Ali和Wharton[20]報(bào)道S.feltiae和H.bacteriophora對(duì)低溫具有中等抗性，線蟲經(jīng)-13 ℃低溫處理后對(duì)大蠟螟致病力未受影響。李星月等[21]發(fā)現(xiàn)線蟲H.beicherrianaCherry品系在38 ℃放置44 h后線蟲全部死亡，在40 ℃放置220 min后線蟲全部死亡。在本試驗(yàn)中H.beicherrianaNCWZ1和H.beicherrianaLJ24在40 ℃放置4 h后死亡率僅為7.96%和0.69%。存在差異的原因可能是由于三者采集地不同。在本試驗(yàn)中，除了S.tielingenseLFS65、S.ceratophorumHQA87 和S.carpocapsaeAll外，所測(cè)試的異小桿線蟲H.bacteriophora、H.beicherriana、H.indica、H.megidis耐熱性均高于所測(cè)試的斯氏線蟲（S.hebeiense、S.feltiae、S.litorale）；Heterorhabditisbacteriophora和S.feltiae同一種內(nèi)不同品系間耐低溫能力差異顯著。SteinernematielingenseLFS65和S.xinbinenseLFS48 是本團(tuán)隊(duì)在遼寧省采集到的斯氏線蟲新種類[22,23]；在其他地區(qū)尚未有這兩種線蟲的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)S.tielingenseLFS65具有很強(qiáng)的耐熱性，不耐干燥；而S.xinbinenseLFS48耐干燥能力較強(qiáng)，但不耐高溫。

昆蟲病原線蟲對(duì)水分具有很強(qiáng)的依賴性，干燥的環(huán)境條件限制了昆蟲病原線蟲在葉部和土壤害蟲中的應(yīng)用。濕度過大或者干燥都不利于昆蟲病原線蟲的侵染和長(zhǎng)期存活，不同種類的EPN侵染昆蟲的最適濕度不同[24]。Shapiro-Ilan等[25]報(bào)道S.carpocapsae抗干燥能力最強(qiáng)，其次是S.feltiae，異小桿線蟲抗干燥能力較弱。邢玉芳等[26]報(bào)道經(jīng)過低濕條件處理后甘肅省采集的斯氏屬線蟲S.feltiae、S.affine和S.kraussei等存活率高于H.megidis,H.brevicaudis和H.marelatu。甘油溶液可以使線蟲進(jìn)行滲透脫水[27]。在本試驗(yàn)中，利用甘油水溶液測(cè)試了不同EPN品系經(jīng)過滲透壓脫水后的存活狀態(tài)。已商業(yè)化生產(chǎn)的S.carpocapsaeAll品系存活率最高，耐干燥能力強(qiáng)，與已有報(bào)道一致；Steinernemasp ZLS3及S.ceratophorumHQA87線蟲的抗干燥能力高于其他測(cè)試線蟲，與S.carpocapsaeAll無顯著差異，可以作為干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上線蟲應(yīng)用資源。

本文分別研究了溫度和干燥條件對(duì)不同昆蟲病原線蟲存活的影響，測(cè)試了近幾年在我國(guó)分離到的昆蟲病原線蟲新種類（S.tielingense、S.xinbinense、H.beicherriana、S.sp.ZLS3）的抗逆性等特征，根據(jù)不同條件篩選出了S.ceratophorumHQA87及S.tielingenseLFS65等優(yōu)良線蟲品系。在不同地域環(huán)境中有針對(duì)性地應(yīng)用不同抗性的EPN品系可提高其殺蟲效果，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。本研究可對(duì)昆蟲病原線蟲更好地推廣和應(yīng)用提供支撐。