木薯炭疽病拮抗木霉菌篩選與室內(nèi)防效研究

張靜雅，李欣雨，張 成，王偉偉，張 鵬，侯巨梅，劉 銅,?

（1.海南大學(xué)植物保護學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點實驗室，?？?570228；2.海南省綠色農(nóng)用生物制劑創(chuàng)制工程研究中心（海南大學(xué)），?？?570228）

木薯ManihotesculentaCrantz為大戟科木薯屬植物，是非洲、亞洲、美洲和拉丁美洲、熱帶和亞熱帶地區(qū)數(shù)百萬人的主要糧食作物[1]。隨著經(jīng)濟的增長和能源缺口的不斷加大，木薯作為一種糧食作物和能源材料，其種植面積在不斷地擴大[2]。然而，在我國廣西、廣東、海南等木薯主產(chǎn)區(qū)，炭疽病發(fā)生普遍[3]，成為木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素之一。木薯炭疽病由Colletotrichumgloeosporioidesf.sp.manihotisHenn（Penz）Sacc侵染引起[4]，主要危害木薯莖部、葉片和果實，常在多雨季節(jié)發(fā)生[5]，嚴重影響木薯產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，對木薯炭疽病的防治主要以化學(xué)防治為主[6]，然而長期使用化學(xué)農(nóng)藥會導(dǎo)致病原菌出現(xiàn)抗藥性以及農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題。因此，篩選和使用高效、無殘留的生物菌劑進行防治尤為重要。

木霉菌Trichodermaspp.適應(yīng)性廣、生長繁殖能力強，在自然界各種生態(tài)環(huán)境中廣泛分布[7]。它可以產(chǎn)生多種拮抗病原物物質(zhì)、細胞壁降解酶類和促生因子。因此，木霉菌作為重要的生防菌，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[8]。木霉菌對炭疽病的防治已有較多報道。如棘孢木霉GYSW-6m1對草莓炭疽菌LC0220具有較強的競爭、抗生和重寄生作用，同時對草莓幼苗也表現(xiàn)出較好的促生作用[9]；長枝木霉SMF2孢子懸浮液噴施和灌根處理葫蘆，可以顯著降低葫蘆炭疽病的發(fā)生[10]，利用哈茨木霉GZ-5可以有效地防治菩提樹炭疽病[11]，但目前應(yīng)用于防治木薯炭疽病的木霉菌鮮有報道。因此，本研究擬從木薯根際土壤分離獲得的木霉菌中，篩選出對木薯炭疽病菌具有較強拮抗作用的菌株，進行室內(nèi)防效測定，以期開發(fā)為防治該病害的生防菌劑。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)基

木薯炭疽病病葉從海南省儋州木薯種質(zhì)資源圃采集；15株木霉菌分離自木薯根際土壤樣品，由海南省綠色農(nóng)用生物制劑創(chuàng)制工程研究中心提供；用于室內(nèi)致病性檢測和防效的木薯葉片為華南9號品種。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L；PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L；CMA培養(yǎng)基：玉米粉25 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L；OA培養(yǎng)基：燕麥粉60 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L；CMD培養(yǎng)基：玉米粉50 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L；SNA培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，KCl 0.5 g，KNO31.0 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L。

1.2 病原菌的分離、致病性分析及鑒定

從海南儋州木薯種質(zhì)資源圃選擇新鮮、病斑清晰的木薯病葉，利用手術(shù)剪刀在病健交界處剪取約0.5 cm×0.5 cm病葉組織，采用組織分離法[12]進行病原菌分離。待病斑周圍長出菌絲后，挑取菌絲轉(zhuǎn)接于新鮮的 PDA平板上，采用單孢分離法[13]對病原菌進行純化。將純化的菌株接種于新鮮木薯葉片進行致病性檢測，根據(jù)柯赫氏法則，等葉片發(fā)病后與自然發(fā)病葉片癥狀進行比較，重新分離病原菌，與原接種菌進行比較分析。病原菌的鑒定采用形態(tài)學(xué)和分子鑒定的方法相結(jié)合進行。將病原菌接于 PSA、PDA、CMA和OA培養(yǎng)基上進行菌落形態(tài)和顏色特征觀察，收集在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的分生孢子，進行分生孢子形態(tài)觀察。采用CTAB法[14]提取病原菌DNA，參考林春花[15]報道的引物序列，分別擴增rDNA-ITS、GAPDH、ACT、CHS-1和TUB2基因序列，將PCR產(chǎn)物回收后克隆進行測序，序列提交GenBank中進行比對，手動修正錯誤序列后，下載相似性高的菌株及模式菌的相關(guān)序列，用ClustalX軟件進行比對后，將不同序列拼接在一起，利用MEGA 7.0進行多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，通過自展法（Bootstrap）進行檢驗，設(shè)置1000次重復(fù)，進行病原菌的分子鑒定。

1.3 對峙培養(yǎng)

拮抗木薯炭疽病菌的木霉菌篩選參照趙玳琳等[9]方法。分別將15株木霉菌與木薯炭疽菌進行平板對峙培養(yǎng)，即取5 mm菌餅接種于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿兩端，兩菌餅相距5 cm。以只接木薯炭疽病菌的平板作為對照，每個處理3次重復(fù)。放置于28 ℃培養(yǎng)，并于接種后3、5、7 d測量菌落半徑，計算抑制率。抑制率（%）=（對照組半徑－處理組半徑）/對照組半徑×100。

1.4 木霉菌揮發(fā)性物質(zhì)對炭疽病菌的抑制作用

將木霉菌LG004-52、ZJB3-12和LS073-23的菌餅（5mm）接種于PDA培養(yǎng)基中間，于28 ℃培養(yǎng)2 d后，將木薯炭疽病菌接種于另一個 PDA培養(yǎng)基中間，然后將與接種木霉菌株的培養(yǎng)皿對扣以滅菌玻璃紙隔開，避免菌絲和孢子干擾。以空白培養(yǎng)基與炭疽病菌對扣為對照，每個處理設(shè)置3次重復(fù)，培養(yǎng)3、5、7 d后測量病原菌菌落直徑，計算抑制率。抑制率（%）＝（對照組直徑－處理組直徑）/對照組直徑×100。

1.5 木霉菌發(fā)酵液對炭疽病菌的抑制作用

將木霉菌LG004-52、ZJB3-12和LS073-23菌餅（5 mm）轉(zhuǎn)接含150 mL PD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d后用滅菌濾紙過濾，將濾液用0.22 μm過濾膜除菌2次后即為無菌發(fā)酵液。取無菌發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基按1:1比例混合倒平板，待其冷卻后，將木薯炭疽病菌轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基中央，分別于3、5和7 d測量菌落直徑，計算抑制率。

1.6 木霉菌的鑒定

1.6.1 木霉菌形態(tài)學(xué)鑒定 將木霉菌分別轉(zhuǎn)接于PDA、SNA和CMD培養(yǎng)基上，參考木霉菌種群分類系統(tǒng)以及《真菌鑒定手冊》[16-19]，根據(jù)菌株在SNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h時菌落形態(tài)、分生孢子梗、瓶梗以及分生孢子的特征對木霉菌進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.6.2 木霉菌分子鑒定 采用CTAB法提取木霉菌基因組DNA[20]，利用引物rpb2-5f（5′-GAYGAYMGW GATCAYTTYGG-3′）和 rpb2-7cr（5′-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3′），擴增rpb2 基因序列。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×GreenTaqMix 12.5 μL、10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性1 min，59 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用DNA純化回收試劑盒（天根生化科技）回收PCR產(chǎn)物，連接到pBM16A載體（北京博邁德基因技術(shù)有限公司），挑選陽性克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將序列提交 NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，下載相似性高的菌株序列，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行木霉菌分子鑒定。

1.7 室內(nèi)防效試驗

制備木霉菌孢子懸浮液（5×106孢子/mL），將孢子懸浮液均勻噴施在大小一致的木薯葉片上，以噴施無菌水為對照，每個處理20片葉片。待葉片晾干后，用無菌針刺傷葉片并在傷口上放置一個直徑為5 mm的木薯炭疽病菌菌塊，每片葉子中央接種1個菌塊，保濕培養(yǎng)4 d后，將發(fā)病木薯葉片和標尺一起拍照，使用軟件IMAGE J（Wayne Rasband，National Institute of Health，USA）按照圖片中標尺大小設(shè)定尺度，測量病斑面積，計算抑制率。抑制率（%）=（對照組面積－處理組面積）/對照組面積×100。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，SPSS 25對抑菌率數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯炭疽病菌分離與鑒定

通過組織分離法和致病性檢測，獲得3株疑似炭疽病菌的分離物（DZT-1，DZT-2和DZT-3）（圖1A，B），將其中菌株DZT-1轉(zhuǎn)接于PSA、PDA、CMA和OA培養(yǎng)基上進行形態(tài)學(xué)觀察，其菌落為圓形，邊緣齊整（圖1C）；病菌在PDA和PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲旺盛，產(chǎn)孢時呈現(xiàn)黑褐色，但產(chǎn)孢時間不規(guī)律（圖1C）；分生孢子呈圓柱形，有1個隔，無色；附著孢無色，圓柱形（圖1D、E）；其形態(tài)特征與蔡吉苗[21]描述的膠孢炭疽菌形態(tài)一致，因此推測可能為膠孢炭疽菌。

圖1 菌株DZT-1致病性檢測與形態(tài)學(xué)鑒定Fig.1 Pathogenicity test and morphological identification of strain DZT-1

通過擴增克隆獲得該菌rDNA-ITS（登錄號：MZ373236）、基因GAPDH（登錄號：MZ403777）、ACT（登錄號：MZ403778）、CHS-1（登錄號：MZ403779）和TUB2（登錄號：MZ403780）片段序列，將序列按ITS-GAPDH-ACT-CHS-1-TUB2的順序分別首尾相連，以NJ法構(gòu)建菌株的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）結(jié)果顯示，菌株DZT-1與膠孢炭疽菌C.gloeosporioidesCORCG4和IMI356878聚類同一支，表明DZT-1可能為膠孢炭疽菌。因此，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定，該病原菌被鑒定為膠孢炭疽菌。

圖2 基于ITS、GAPDH、ACT、CHS-1和TUB2基因序列聯(lián)合構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 A polygenic phylogenetic tree was constructed based on ITS, GAPDH, ACT, CHS-1 and TUB2 gene sequences

2.2 對峙培養(yǎng)

通過平板對峙試驗，15株供試木霉菌株對木薯炭疽病菌DZT-1均表現(xiàn)一定抑制作用（表1，圖3），其中菌株LG004-52、ZJB3-12和LS073-23培養(yǎng)7 d時，對膠孢炭疽病菌DZT-1的抑制率分別為82.69%、82.69%和83.45%，均高于其他菌株（P＜0.05），表明這3株木霉具有對木薯膠孢炭疽菌具有較強的拮抗作用，并進一步開展抑菌和室內(nèi)防效試驗。

圖3 不同木霉菌株與木薯膠孢炭疽菌DZT-1的對峙培養(yǎng)Fig.3 Confrontation culture of different Trichoderma strains against C.gloeosporioides DZT-1

表1 15株木霉菌對木薯膠孢炭疽菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of 15 Trichoderma strains isolates against C.gloeosporioides

2.3 木霉菌揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌作用

通過揮發(fā)性物質(zhì)的拮抗試驗，木霉菌株LG004-52對炭疽菌DZT-1的抑制率顯著高于菌株LS073-23和ZJB3-12；但隨著培養(yǎng)時間延長，3株木霉菌株的抑制率差異不顯著（表2，圖4）。木霉菌株ZJB3-12產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物在前期抑制炭疽菌氣生菌絲生長，DZT-1菌餅周圍出現(xiàn)圓形空洞（圖4）。

圖4 3株木霉菌揮發(fā)性物質(zhì)對木薯膠孢炭疽菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of volatile substances of 3 Trichoderma strains against C.gloeosporioides

表2 3株木霉菌揮發(fā)性物質(zhì)對木薯膠孢炭疽菌的抑制作用Table 2 Inhibitiory of volatile substances of 3 Trichoderma strains against C.gloeosporioides

2.4 木霉菌株發(fā)酵液抑菌作用

通過發(fā)酵液的抑菌試驗，在 3株木霉菌中，菌株 ZJB3-12的發(fā)酵液呈金黃色，對膠孢炭疽菌 DZT-1抑菌作用最強，可完全抑制炭疽菌菌絲的生長，抑制率為100%；其次是菌株LS073-23的發(fā)酵液，抑制率為83.70%；菌株LG004-52發(fā)酵液對病原菌菌絲半徑無影響，但菌絲生長稀疏。因此，木霉菌ZJB3-12發(fā)酵液中可能產(chǎn)生了較強的抑菌活性物質(zhì)，抑制了膠孢炭疽病菌的生長（表3，圖5）。

圖5 3株木霉菌的發(fā)酵液對木薯膠孢炭疽菌的抑制作用Fig.5 Growth inhibition of 3 Trichoderma strains against C.gloeosporioides

表3 3株木霉菌發(fā)酵液對木薯膠孢炭疽菌的抑制作用Table 3 Inhibitory of metabolites of 3 Trichoderma strains against C.gloeosporioides

2.5 木霉菌株的鑒定

2.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株LG004-52在PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲茂盛，長而呈絨毛狀，接種點中心具有環(huán)狀的不育區(qū)域；在SNA培養(yǎng)基上，其氣生菌絲稀疏，在接種點周圍有少量淡綠色孢子堆；在CMD培養(yǎng)基上，氣生菌絲茂盛，可見淺綠色的孢子堆。分生孢子梗側(cè)枝短，不分枝，壺腹型或瓶狀，單生，成對或3個輪生，分生孢子綠色，平滑，球形（圖6A1-A6）。

菌株LS073-23在PDA培養(yǎng)基上，氣生菌絲茂盛，分生孢子形成明顯的深綠色同心環(huán)；在SNA培養(yǎng)基上，幾乎沒有氣生菌絲，分生孢子初期白色，后期變綠；在CMD培養(yǎng)基上氣生菌絲不明顯，淺綠色孢子堆離散分布于接種點對面。分生孢子梗金字塔型，具有輪生或經(jīng)常明顯配對的側(cè)枝，分支與主枝呈近直角，分生孢子近球形、粗糙、墨綠色（圖6B1-B6）。

圖6 3株木霉菌的形態(tài)圖Fig.6 Morphology of 3 Trichoderma strains

菌株ZJB3-12在PDA上培養(yǎng)基上，氣生菌絲茂盛，分生孢子豐富，分散均勻，呈同心環(huán)狀，產(chǎn)生黃色色素；在SNA培養(yǎng)基上，氣生菌絲稀疏，分生孢子豐富，淺綠色；在CMD培養(yǎng)基上，幾乎沒有氣生菌絲，分生孢子堆離散型分布。分生孢子梗長梗草型，可育枝通常由幾個層次的分枝組成，頂端附近的枝條上有單一的瓶梗，不再分枝；分生孢子圓柱狀，通常頂生于直的、鉤狀的或者彎曲單個瓶梗內(nèi)（圖6C1-C6）。2.5.2 分子生物學(xué)鑒定 通過PCR擴增，分別從菌株LG004-52、LS073-23和ZJB3-12獲得1294、1343和1291 bprpb2基因片段；經(jīng)過裁剪后利用MEGA7.0的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株LG004-52（登錄號：MZ361837）、LS073-23（登錄號：MZ361838）和ZJB3-12（登錄號：MZ361839）分別與短密木霉T.breve、棘孢木霉T.asperellum和長枝木霉T.longibrachiatum聚為同一分支。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定結(jié)果，將3株木霉菌分別鑒定為短密木霉、棘孢木霉和長枝木霉。

圖7 3株木霉菌基于rpb2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of 3 Trichoderma strains based on rpb2 sequence

2.6 木霉菌對炭疽病的室內(nèi)防效

通過室內(nèi)保濕培養(yǎng)4 d后，木霉菌株LG004-52、LS073-23、ZJB3-12孢子懸浮液處理過的葉片的平均病斑面積分別為3.84、3.79和1.51 cm2，對照組平均病斑面積為6.13 cm2，3株木霉對炭疽病的抑制率分別為37.36%、38.17%和75.37%，其中木霉ZJB3-12對木薯葉片炭疽病的發(fā)生抑制作用最強（表4，圖8）。因此，該菌株可以作為木薯炭疽病生物防治的候選菌株。

表4 3株木霉菌對木薯葉片炭疽病的防效Table 4 Control effect of 3 Trichoderma strains on cassava leaves of C.gloeosporioides

圖8 3株木霉菌孢子懸浮液對木薯炭疽病的離體葉片防效Fig.8 The control effect of conidia suspension of 3 Trichoderma strains isolates to C.gloeosporioides on isolated leaves

3 討論

木薯炭疽病是木薯生產(chǎn)中危害非常嚴重的一種世界性病害[21]。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所在對中國廣西、廣東、海南等木薯主產(chǎn)區(qū)的病害普查中，發(fā)現(xiàn)該病發(fā)生普遍[4]。1993年蔣冬榮[22]在廣西桂林木薯優(yōu)良品種“南植188”發(fā)現(xiàn)木薯炭疽病菌，初步鑒定該病病原是黑盤孢目的刺盤孢菌。2008年蔡吉苗等[23]在海南儋州發(fā)現(xiàn)木薯炭疽病，經(jīng)致病性測定，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合ITS序列分析確定其為膠孢炭疽菌。然而，單一的ITS序列只能鑒定少部分炭疽菌種，越來越多的研究采用多基因進行炭疽菌的鑒定與遺傳多樣性分析。本研究除了對炭疽菌DZT-1進行柯赫氏法驗證、形態(tài)學(xué)觀察以外，并采用ITS-GAPDH-ACTCHS-1-TUB2多基因聯(lián)合建樹分析，將該病原菌鑒定為膠孢炭疽菌。

目前，對木薯炭疽病的防治主要是采用化學(xué)防治，對于利用木霉制劑來生物防治木薯炭疽病國內(nèi)外未見報道。但是利用木霉菌防治其他作物的炭疽病已有較多的報道。如張曉夢等[24]利用綠色木霉和棘孢木霉防治枸杞炭疽病菌，2株木霉菌株均表現(xiàn)抑菌作用和促進植物生長的能力，并存在多種生防因子。趙興麗等[25]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉使茶炭疽病菌菌落萎縮，顏色變暗；其進發(fā)酵液也能有效抑制茶炭疽病菌菌絲生長，使菌絲表面皺縮。

木霉菌對植物病原菌的作用機制并不是單一的，有時是兩種或幾種生防機制協(xié)同作用[26]。Lazazzara等[27]研究表明在木霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物（VOCs）中，α-farnesene、cadinene、1,3-octadiene、2-pentylfuran和6-pentyl-2H-pyran-2-one降低了葡萄葉片霜霉病的嚴重程度。王子晴等[28]研究結(jié)果顯示鉤狀木霉C6揮發(fā)性物質(zhì)對北細辛菌核病菌抑制率為53.73%，哈茨木霉A17、鉤狀木霉A26、擬康氏木霉B30、鉤狀木霉C6的發(fā)酵液對北細辛菌核病菌的抑制率分別為56.33%、77.22%、82.28%和46.20%。Xin等[29]研究發(fā)現(xiàn)木霉菌株T2發(fā)酵液中的活性代謝產(chǎn)物6-pentyl-2h-pyran2-one（6PP）擾亂了三七根腐病菌的代謝平衡，特別是氨基酸代謝。Mao等[30]對菌株MHT1134的抑菌能力進行了評價，發(fā)現(xiàn)滅菌和未滅菌處理的發(fā)酵液均能有效抑制病原菌的菌絲生長，抑菌效果分別達50.71%和74.01%。本研究通過平板對峙試驗，篩選到3株對木薯炭疽病菌表現(xiàn)較強抑菌作用的木霉菌株，其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及無菌發(fā)酵液對木薯炭疽病菌絲生長具有明顯的抑制作用，其中木霉菌株ZJB3-12揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌菌落生長造成明顯“空洞”現(xiàn)象；且其發(fā)酵液可完全抑制木薯炭疽病菌菌絲的生長，推測該菌株的發(fā)酵液中可能存在對炭疽病菌具有高活性的物質(zhì)。通過室內(nèi)防效試驗，木霉菌株ZJB3-12分生孢子懸浮液降低木薯離體葉片上炭疽病的發(fā)生。因此，木霉菌株ZJB3-12具有良好的生防潛力，將是后續(xù)的田間應(yīng)用的候選菌株。目前關(guān)于該菌株無菌發(fā)酵液的抑菌活性成分正在進行分離鑒定，將明確其抑菌機制，為開發(fā)生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。