張靜雅,李欣雨,張 成,王偉偉,張 鵬,侯巨梅,劉 銅,?
(1.海南大學(xué)植物保護學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點實驗室,???570228;2.海南省綠色農(nóng)用生物制劑創(chuàng)制工程研究中心(海南大學(xué)),???570228)
木薯ManihotesculentaCrantz為大戟科木薯屬植物,是非洲、亞洲、美洲和拉丁美洲、熱帶和亞熱帶地區(qū)數(shù)百萬人的主要糧食作物[1]。隨著經(jīng)濟的增長和能源缺口的不斷加大,木薯作為一種糧食作物和能源材料,其種植面積在不斷地擴大[2]。然而,在我國廣西、廣東、海南等木薯主產(chǎn)區(qū),炭疽病發(fā)生普遍[3],成為木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素之一。木薯炭疽病由Colletotrichumgloeosporioidesf.sp.manihotisHenn(Penz)Sacc侵染引起[4],主要危害木薯莖部、葉片和果實,常在多雨季節(jié)發(fā)生[5],嚴重影響木薯產(chǎn)量和品質(zhì)。目前,對木薯炭疽病的防治主要以化學(xué)防治為主[6],然而長期使用化學(xué)農(nóng)藥會導(dǎo)致病原菌出現(xiàn)抗藥性以及農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題。因此,篩選和使用高效、無殘留的生物菌劑進行防治尤為重要。
木霉菌Trichodermaspp.適應(yīng)性廣、生長繁殖能力強,在自然界各種生態(tài)環(huán)境中廣泛分布[7]。它可以產(chǎn)生多種拮抗病原物物質(zhì)、細胞壁降解酶類和促生因子。因此,木霉菌作為重要的生防菌,被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[8]。木霉菌對炭疽病的防治已有較多報道。如棘孢木霉GYSW-6m1對草莓炭疽菌LC0220具有較強的競爭、抗生和重寄生作用,同時對草莓幼苗也表現(xiàn)出較好的促生作用[9];長枝木霉SMF2孢子懸浮液噴施和灌根處理葫蘆,可以顯著降低葫蘆炭疽病的發(fā)生[10],利用哈茨木霉GZ-5可以有效地防治菩提樹炭疽病[11],但目前應(yīng)用于防治木薯炭疽病的木霉菌鮮有報道。因此,本研究擬從木薯根際土壤分離獲得的木霉菌中,篩選出對木薯炭疽病菌具有較強拮抗作用的菌株,進行室內(nèi)防效測定,以期開發(fā)為防治該病害的生防菌劑。
木薯炭疽病病葉從海南省儋州木薯種質(zhì)資源圃采集;15株木霉菌分離自木薯根際土壤樣品,由海南省綠色農(nóng)用生物制劑創(chuàng)制工程研究中心提供;用于室內(nèi)致病性檢測和防效的木薯葉片為華南9號品種。
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g,蒸餾水定容至1 L;PSA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水定容至1 L;CMA培養(yǎng)基:玉米粉25 g,瓊脂20 g,蒸餾水定容至1 L;OA培養(yǎng)基:燕麥粉60 g,瓊脂15 g,蒸餾水定容至1 L;CMD培養(yǎng)基:玉米粉50 g,葡萄糖10 g,瓊脂18 g,蒸餾水定容至1 L;SNA培養(yǎng)基:KH2PO41.0 g,KCl 0.5 g,KNO31.0 g,MgSO4.7H2O 0.5 g,葡萄糖0.2 g,蔗糖0.2 g,瓊脂18 g,蒸餾水定容至1 L。
從海南儋州木薯種質(zhì)資源圃選擇新鮮、病斑清晰的木薯病葉,利用手術(shù)剪刀在病健交界處剪取約0.5 cm×0.5 cm病葉組織,采用組織分離法[12]進行病原菌分離。待病斑周圍長出菌絲后,挑取菌絲轉(zhuǎn)接于新鮮的 PDA平板上,采用單孢分離法[13]對病原菌進行純化。將純化的菌株接種于新鮮木薯葉片進行致病性檢測,根據(jù)柯赫氏法則,等葉片發(fā)病后與自然發(fā)病葉片癥狀進行比較,重新分離病原菌,與原接種菌進行比較分析。病原菌的鑒定采用形態(tài)學(xué)和分子鑒定的方法相結(jié)合進行。將病原菌接于 PSA、PDA、CMA和OA培養(yǎng)基上進行菌落形態(tài)和顏色特征觀察,收集在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的分生孢子,進行分生孢子形態(tài)觀察。采用CTAB法[14]提取病原菌DNA,參考林春花[15]報道的引物序列,分別擴增rDNA-ITS、GAPDH、ACT、CHS-1和TUB2基因序列,將PCR產(chǎn)物回收后克隆進行測序,序列提交GenBank中進行比對,手動修正錯誤序列后,下載相似性高的菌株及模式菌的相關(guān)序列,用ClustalX軟件進行比對后,將不同序列拼接在一起,利用MEGA 7.0進行多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,通過自展法(Bootstrap)進行檢驗,設(shè)置1000次重復(fù),進行病原菌的分子鑒定。
拮抗木薯炭疽病菌的木霉菌篩選參照趙玳琳等[9]方法。分別將15株木霉菌與木薯炭疽菌進行平板對峙培養(yǎng),即取5 mm菌餅接種于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿兩端,兩菌餅相距5 cm。以只接木薯炭疽病菌的平板作為對照,每個處理3次重復(fù)。放置于28 ℃培養(yǎng),并于接種后3、5、7 d測量菌落半徑,計算抑制率。抑制率(%)=(對照組半徑-處理組半徑)/對照組半徑×100。
將木霉菌LG004-52、ZJB3-12和LS073-23的菌餅(5mm)接種于PDA培養(yǎng)基中間,于28 ℃培養(yǎng)2 d后,將木薯炭疽病菌接種于另一個 PDA培養(yǎng)基中間,然后將與接種木霉菌株的培養(yǎng)皿對扣以滅菌玻璃紙隔開,避免菌絲和孢子干擾。以空白培養(yǎng)基與炭疽病菌對扣為對照,每個處理設(shè)置3次重復(fù),培養(yǎng)3、5、7 d后測量病原菌菌落直徑,計算抑制率。抑制率(%)=(對照組直徑-處理組直徑)/對照組直徑×100。
將木霉菌LG004-52、ZJB3-12和LS073-23菌餅(5 mm)轉(zhuǎn)接含150 mL PD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d后用滅菌濾紙過濾,將濾液用0.22 μm過濾膜除菌2次后即為無菌發(fā)酵液。取無菌發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基按1:1比例混合倒平板,待其冷卻后,將木薯炭疽病菌轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基中央,分別于3、5和7 d測量菌落直徑,計算抑制率。
1.6.1 木霉菌形態(tài)學(xué)鑒定 將木霉菌分別轉(zhuǎn)接于PDA、SNA和CMD培養(yǎng)基上,參考木霉菌種群分類系統(tǒng)以及《真菌鑒定手冊》[16-19],根據(jù)菌株在SNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h時菌落形態(tài)、分生孢子梗、瓶梗以及分生孢子的特征對木霉菌進行形態(tài)學(xué)鑒定。
1.6.2 木霉菌分子鑒定 采用CTAB法提取木霉菌基因組DNA[20],利用引物rpb2-5f(5′-GAYGAYMGW GATCAYTTYGG-3′)和 rpb2-7cr(5′-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3′),擴增rpb2 基因序列。PCR 反應(yīng)體系(25 μL):2×GreenTaqMix 12.5 μL、10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μL,模板 DNA 1 μL,ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性1 min,59 ℃退火90 s,72 ℃延伸90 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。利用DNA純化回收試劑盒(天根生化科技)回收PCR產(chǎn)物,連接到pBM16A載體(北京博邁德基因技術(shù)有限公司),挑選陽性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將序列提交 NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對,下載相似性高的菌株序列,采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進行木霉菌分子鑒定。
制備木霉菌孢子懸浮液(5×106孢子/mL),將孢子懸浮液均勻噴施在大小一致的木薯葉片上,以噴施無菌水為對照,每個處理20片葉片。待葉片晾干后,用無菌針刺傷葉片并在傷口上放置一個直徑為5 mm的木薯炭疽病菌菌塊,每片葉子中央接種1個菌塊,保濕培養(yǎng)4 d后,將發(fā)病木薯葉片和標尺一起拍照,使用軟件IMAGE J(Wayne Rasband,National Institute of Health,USA)按照圖片中標尺大小設(shè)定尺度,測量病斑面積,計算抑制率。抑制率(%)=(對照組面積-處理組面積)/對照組面積×100。
利用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,SPSS 25對抑菌率數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。
通過組織分離法和致病性檢測,獲得3株疑似炭疽病菌的分離物(DZT-1,DZT-2和DZT-3)(圖1A,B),將其中菌株DZT-1轉(zhuǎn)接于PSA、PDA、CMA和OA培養(yǎng)基上進行形態(tài)學(xué)觀察,其菌落為圓形,邊緣齊整(圖1C);病菌在PDA和PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲旺盛,產(chǎn)孢時呈現(xiàn)黑褐色,但產(chǎn)孢時間不規(guī)律(圖1C);分生孢子呈圓柱形,有1個隔,無色;附著孢無色,圓柱形(圖1D、E);其形態(tài)特征與蔡吉苗[21]描述的膠孢炭疽菌形態(tài)一致,因此推測可能為膠孢炭疽菌。
圖1 菌株DZT-1致病性檢測與形態(tài)學(xué)鑒定Fig.1 Pathogenicity test and morphological identification of strain DZT-1
通過擴增克隆獲得該菌rDNA-ITS(登錄號:MZ373236)、基因GAPDH(登錄號:MZ403777)、ACT(登錄號:MZ403778)、CHS-1(登錄號:MZ403779)和TUB2(登錄號:MZ403780)片段序列,將序列按ITS-GAPDH-ACT-CHS-1-TUB2的順序分別首尾相連,以NJ法構(gòu)建菌株的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)結(jié)果顯示,菌株DZT-1與膠孢炭疽菌C.gloeosporioidesCORCG4和IMI356878聚類同一支,表明DZT-1可能為膠孢炭疽菌。因此,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定,該病原菌被鑒定為膠孢炭疽菌。
圖2 基于ITS、GAPDH、ACT、CHS-1和TUB2基因序列聯(lián)合構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 A polygenic phylogenetic tree was constructed based on ITS, GAPDH, ACT, CHS-1 and TUB2 gene sequences
通過平板對峙試驗,15株供試木霉菌株對木薯炭疽病菌DZT-1均表現(xiàn)一定抑制作用(表1,圖3),其中菌株LG004-52、ZJB3-12和LS073-23培養(yǎng)7 d時,對膠孢炭疽病菌DZT-1的抑制率分別為82.69%、82.69%和83.45%,均高于其他菌株(P<0.05),表明這3株木霉具有對木薯膠孢炭疽菌具有較強的拮抗作用,并進一步開展抑菌和室內(nèi)防效試驗。
圖3 不同木霉菌株與木薯膠孢炭疽菌DZT-1的對峙培養(yǎng)Fig.3 Confrontation culture of different Trichoderma strains against C.gloeosporioides DZT-1
表1 15株木霉菌對木薯膠孢炭疽菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of 15 Trichoderma strains isolates against C.gloeosporioides
通過揮發(fā)性物質(zhì)的拮抗試驗,木霉菌株LG004-52對炭疽菌DZT-1的抑制率顯著高于菌株LS073-23和ZJB3-12;但隨著培養(yǎng)時間延長,3株木霉菌株的抑制率差異不顯著(表2,圖4)。木霉菌株ZJB3-12產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物在前期抑制炭疽菌氣生菌絲生長,DZT-1菌餅周圍出現(xiàn)圓形空洞(圖4)。
圖4 3株木霉菌揮發(fā)性物質(zhì)對木薯膠孢炭疽菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of volatile substances of 3 Trichoderma strains against C.gloeosporioides
表2 3株木霉菌揮發(fā)性物質(zhì)對木薯膠孢炭疽菌的抑制作用Table 2 Inhibitiory of volatile substances of 3 Trichoderma strains against C.gloeosporioides
通過發(fā)酵液的抑菌試驗,在 3株木霉菌中,菌株 ZJB3-12的發(fā)酵液呈金黃色,對膠孢炭疽菌 DZT-1抑菌作用最強,可完全抑制炭疽菌菌絲的生長,抑制率為100%;其次是菌株LS073-23的發(fā)酵液,抑制率為83.70%;菌株LG004-52發(fā)酵液對病原菌菌絲半徑無影響,但菌絲生長稀疏。因此,木霉菌ZJB3-12發(fā)酵液中可能產(chǎn)生了較強的抑菌活性物質(zhì),抑制了膠孢炭疽病菌的生長(表3,圖5)。
圖5 3株木霉菌的發(fā)酵液對木薯膠孢炭疽菌的抑制作用Fig.5 Growth inhibition of 3 Trichoderma strains against C.gloeosporioides
表3 3株木霉菌發(fā)酵液對木薯膠孢炭疽菌的抑制作用Table 3 Inhibitory of metabolites of 3 Trichoderma strains against C.gloeosporioides
2.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株LG004-52在PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲茂盛,長而呈絨毛狀,接種點中心具有環(huán)狀的不育區(qū)域;在SNA培養(yǎng)基上,其氣生菌絲稀疏,在接種點周圍有少量淡綠色孢子堆;在CMD培養(yǎng)基上,氣生菌絲茂盛,可見淺綠色的孢子堆。分生孢子梗側(cè)枝短,不分枝,壺腹型或瓶狀,單生,成對或3個輪生,分生孢子綠色,平滑,球形(圖6A1-A6)。
菌株LS073-23在PDA培養(yǎng)基上,氣生菌絲茂盛,分生孢子形成明顯的深綠色同心環(huán);在SNA培養(yǎng)基上,幾乎沒有氣生菌絲,分生孢子初期白色,后期變綠;在CMD培養(yǎng)基上氣生菌絲不明顯,淺綠色孢子堆離散分布于接種點對面。分生孢子梗金字塔型,具有輪生或經(jīng)常明顯配對的側(cè)枝,分支與主枝呈近直角,分生孢子近球形、粗糙、墨綠色(圖6B1-B6)。
圖6 3株木霉菌的形態(tài)圖Fig.6 Morphology of 3 Trichoderma strains
菌株ZJB3-12在PDA上培養(yǎng)基上,氣生菌絲茂盛,分生孢子豐富,分散均勻,呈同心環(huán)狀,產(chǎn)生黃色色素;在SNA培養(yǎng)基上,氣生菌絲稀疏,分生孢子豐富,淺綠色;在CMD培養(yǎng)基上,幾乎沒有氣生菌絲,分生孢子堆離散型分布。分生孢子梗長梗草型,可育枝通常由幾個層次的分枝組成,頂端附近的枝條上有單一的瓶梗,不再分枝;分生孢子圓柱狀,通常頂生于直的、鉤狀的或者彎曲單個瓶梗內(nèi)(圖6C1-C6)。2.5.2 分子生物學(xué)鑒定 通過PCR擴增,分別從菌株LG004-52、LS073-23和ZJB3-12獲得1294、1343和1291 bprpb2基因片段;經(jīng)過裁剪后利用MEGA7.0的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,菌株LG004-52(登錄號:MZ361837)、LS073-23(登錄號:MZ361838)和ZJB3-12(登錄號:MZ361839)分別與短密木霉T.breve、棘孢木霉T.asperellum和長枝木霉T.longibrachiatum聚為同一分支。因此,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定結(jié)果,將3株木霉菌分別鑒定為短密木霉、棘孢木霉和長枝木霉。
圖7 3株木霉菌基于rpb2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of 3 Trichoderma strains based on rpb2 sequence
通過室內(nèi)保濕培養(yǎng)4 d后,木霉菌株LG004-52、LS073-23、ZJB3-12孢子懸浮液處理過的葉片的平均病斑面積分別為3.84、3.79和1.51 cm2,對照組平均病斑面積為6.13 cm2,3株木霉對炭疽病的抑制率分別為37.36%、38.17%和75.37%,其中木霉ZJB3-12對木薯葉片炭疽病的發(fā)生抑制作用最強(表4,圖8)。因此,該菌株可以作為木薯炭疽病生物防治的候選菌株。
表4 3株木霉菌對木薯葉片炭疽病的防效Table 4 Control effect of 3 Trichoderma strains on cassava leaves of C.gloeosporioides
圖8 3株木霉菌孢子懸浮液對木薯炭疽病的離體葉片防效Fig.8 The control effect of conidia suspension of 3 Trichoderma strains isolates to C.gloeosporioides on isolated leaves
木薯炭疽病是木薯生產(chǎn)中危害非常嚴重的一種世界性病害[21]。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所在對中國廣西、廣東、海南等木薯主產(chǎn)區(qū)的病害普查中,發(fā)現(xiàn)該病發(fā)生普遍[4]。1993年蔣冬榮[22]在廣西桂林木薯優(yōu)良品種“南植188”發(fā)現(xiàn)木薯炭疽病菌,初步鑒定該病病原是黑盤孢目的刺盤孢菌。2008年蔡吉苗等[23]在海南儋州發(fā)現(xiàn)木薯炭疽病,經(jīng)致病性測定,形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合ITS序列分析確定其為膠孢炭疽菌。然而,單一的ITS序列只能鑒定少部分炭疽菌種,越來越多的研究采用多基因進行炭疽菌的鑒定與遺傳多樣性分析。本研究除了對炭疽菌DZT-1進行柯赫氏法驗證、形態(tài)學(xué)觀察以外,并采用ITS-GAPDH-ACTCHS-1-TUB2多基因聯(lián)合建樹分析,將該病原菌鑒定為膠孢炭疽菌。
目前,對木薯炭疽病的防治主要是采用化學(xué)防治,對于利用木霉制劑來生物防治木薯炭疽病國內(nèi)外未見報道。但是利用木霉菌防治其他作物的炭疽病已有較多的報道。如張曉夢等[24]利用綠色木霉和棘孢木霉防治枸杞炭疽病菌,2株木霉菌株均表現(xiàn)抑菌作用和促進植物生長的能力,并存在多種生防因子。趙興麗等[25]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉使茶炭疽病菌菌落萎縮,顏色變暗;其進發(fā)酵液也能有效抑制茶炭疽病菌菌絲生長,使菌絲表面皺縮。
木霉菌對植物病原菌的作用機制并不是單一的,有時是兩種或幾種生防機制協(xié)同作用[26]。Lazazzara等[27]研究表明在木霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物(VOCs)中,α-farnesene、cadinene、1,3-octadiene、2-pentylfuran和6-pentyl-2H-pyran-2-one降低了葡萄葉片霜霉病的嚴重程度。王子晴等[28]研究結(jié)果顯示鉤狀木霉C6揮發(fā)性物質(zhì)對北細辛菌核病菌抑制率為53.73%,哈茨木霉A17、鉤狀木霉A26、擬康氏木霉B30、鉤狀木霉C6的發(fā)酵液對北細辛菌核病菌的抑制率分別為56.33%、77.22%、82.28%和46.20%。Xin等[29]研究發(fā)現(xiàn)木霉菌株T2發(fā)酵液中的活性代謝產(chǎn)物6-pentyl-2h-pyran2-one(6PP)擾亂了三七根腐病菌的代謝平衡,特別是氨基酸代謝。Mao等[30]對菌株MHT1134的抑菌能力進行了評價,發(fā)現(xiàn)滅菌和未滅菌處理的發(fā)酵液均能有效抑制病原菌的菌絲生長,抑菌效果分別達50.71%和74.01%。本研究通過平板對峙試驗,篩選到3株對木薯炭疽病菌表現(xiàn)較強抑菌作用的木霉菌株,其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及無菌發(fā)酵液對木薯炭疽病菌絲生長具有明顯的抑制作用,其中木霉菌株ZJB3-12揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌菌落生長造成明顯“空洞”現(xiàn)象;且其發(fā)酵液可完全抑制木薯炭疽病菌菌絲的生長,推測該菌株的發(fā)酵液中可能存在對炭疽病菌具有高活性的物質(zhì)。通過室內(nèi)防效試驗,木霉菌株ZJB3-12分生孢子懸浮液降低木薯離體葉片上炭疽病的發(fā)生。因此,木霉菌株ZJB3-12具有良好的生防潛力,將是后續(xù)的田間應(yīng)用的候選菌株。目前關(guān)于該菌株無菌發(fā)酵液的抑菌活性成分正在進行分離鑒定,將明確其抑菌機制,為開發(fā)生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。