木霉共培養(yǎng)發(fā)酵對黃瓜枯萎病的防治效果

陳 凱，隋麗娜，趙忠娟，李 玲，扈進冬，李紀順*

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)/山東省科學院生態(tài)研究所，濟南 250103；2.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)/生物工程學院，濟南 250353)

黃瓜枯萎?。–ucumber Fusarium wilt）是由尖孢鐮孢黃瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.cucumeriumOwen，FOC侵染引起的真菌病害，發(fā)病周期涉及黃瓜整個生長期，發(fā)病率通常為 10%～30%，嚴重年份可達50%；產量損失10%～50%，甚至絕收[1,2]。長期連作、土壤肥力下降、微生物菌群失衡是導致病害日漸嚴重的主要原因[3]。

黃瓜枯萎病的防治措施主要有抗性品種選育、作物間作、化學防治及生物防治等?？剐云贩N選育具有難度系數高、周期長、果實品質下降等缺陷[4,5]。作物間作雖可減少發(fā)病率，也存在田間管理困難、效果不理想等問題[6-8]?；瘜W藥劑在一定程度上能抑制黃瓜枯萎病的發(fā)生，馬永強[9]研究表明，53.3 mg/g的噁霉靈·咯菌腈懸浮劑處理對黃瓜枯萎病防治效果為82.92%；Shi等[10]通過兩年的田間試驗，發(fā)現375 g/ha的阿維菌素與咯菌腈聯合使用顯著降低南方根結線蟲Meloidogyneincognita和 FOC在土壤中的定殖數量，黃瓜增產達40.00%以上。長期使用化學藥劑易導致病原菌產生抗藥性、并帶來環(huán)境污染、農藥殘留等問題。生物防治因其安全、友好、成本低、來源廣等優(yōu)點，成為當今植物病害防治的研究熱點，防治黃瓜枯萎病的微生物種類主要有細菌、放線菌及木霉等。祝久香[11]利用多粘類芽胞桿菌PaenibacilluspolymyxaHX-140菌液灌根，對黃瓜枯萎病的田間防治效果達50.85%；李鴻坤等[12]研究發(fā)現，肉桂栗色鏈霉菌StreptomycescinnamocastaneusHJG-5粉劑對黃瓜枯萎病的盆栽防治效果達68.97%，顯著高于多菌靈可濕性粉劑；Redda等[13]從內蒙古草原及森林土壤中分離到11株對黃瓜枯萎病的相對防治效果達100%的木霉菌株Trichodermaspp.。

黃瓜枯萎病的防治趨向低毒、低殘留及綠色生態(tài)型發(fā)展，目前主要利用單一菌株進行生物防治，由于單一微生物及其制劑在應用中受外界環(huán)境影響較大，防效不夠穩(wěn)定。研究表明復合微生物比單一微生物對植物的促生和控制病害的效果更好，呈現增效作用[14,15]；Cong等[16]發(fā)現黑根霉Rhizopusnigricans與擬康氏木霉T.pseudokoningii混合發(fā)酵液對FOC的平板抑制率較單一菌株高60%以上，在盆栽試驗中可提高黃瓜苯丙氨酸解氨酶PAL、超氧化物歧化酶SOD及過氧化物酶POD的活性，對黃瓜枯萎病的田間防治效果達76.5%。木霉是重要的植物病害生物防治菌，廣泛分布在自然界中，在土壤和植物根際生物量中占有較大比例，木霉對黃瓜枯萎病的生防機制主要包括空間占位、降解病原菌細胞壁、產生抗生性代謝產物及誘導植物產生防御抗性等[17-19]。本實驗室前期篩選到兩株生防效果較好的木霉菌株：深綠木霉T.atrovirideHB20111和哈茨木霉T.harzianumTW21990[20,21]，本文擬探討兩株木霉共培養(yǎng)發(fā)酵對黃瓜種子發(fā)芽的影響及對黃瓜枯萎病的防治效果，為復合微生物農藥的開發(fā)利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

生防菌株為深綠木霉 HB20111（保藏編號 CGMCC No.16963）和哈茨木霉 TW21990（保藏編號CGMCC No.12864），病原真菌為尖孢鐮孢黃瓜?；虵OC，均為本室分離保藏。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L。PDA培養(yǎng)基：1 L PDB培養(yǎng)基中加入10 g瓊脂。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉20 g、黃豆粉10 g、K2HPO45 g、KH2PO42 g、蒸餾水1 L。

1.2 供試種子與試劑

黃瓜種子：品種為“津春 5號”，濟南綠嘉園蔬菜種苗公司。對照藥劑：25 g/L咯菌腈懸浮劑（Fludioxonil），先正達南通作物保護有限公司。DNA提取試劑盒：DNeasy PowerSoil土壤微生物DNA提取試劑盒，凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司。

1.3 兩株木霉的親和性測定

菌株HB20111、TW21990純化后，用φ＝5 mm的無菌打孔器打取菌落邊緣的菌餅，接種在PDA平板的兩端，25 ℃對峙培養(yǎng)5 d，觀察兩菌落在交接處的生長情況。

1.4 FOC孢子懸浮液的制備

將3塊φ＝5 mm的FOC菌餅接入100 mL PDB培養(yǎng)基中，25 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，鏡檢產生大量分生孢子后，用8層無菌擦鏡紙過濾掉菌絲，濾液經血球計數板計數后，用無菌水稀釋至分生孢子含量分別為106、107cfu/mL的FOC孢子懸浮液。

1.5 共培養(yǎng)發(fā)酵液及發(fā)酵濾液的制備

菌株HB20111和TW21990在PDA平板上培養(yǎng)至產孢，用無菌水懸浮分生孢子，血球計數板計數后，制備成分生孢子含量為107cfu/mL的木霉孢子懸浮液。分別吸取50 μL的兩種木霉孢子懸浮液接入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)。分別于24、32、40、48、56、64、72、80、88 h取樣，收集不同時間的共培養(yǎng)發(fā)酵液；將共培養(yǎng)發(fā)酵液用無菌水分別梯度稀釋50、100、250、500和1000倍，獲得不同稀釋倍數的共培養(yǎng)發(fā)酵液；將共培養(yǎng)發(fā)酵液于8000 r/min離心10 min，保留上清液，再用0.22 μm微孔濾膜過濾，獲得發(fā)酵濾液。

1.6 共培養(yǎng)發(fā)酵液及發(fā)酵濾液浸種抑菌萌發(fā)試驗

通過種子萌發(fā)試驗篩選共培養(yǎng)發(fā)酵的最佳條件。挑選健康、大小一致的黃瓜種子，種子用5% NaClO消毒10 min，無菌水沖洗干凈，用無菌濾紙吸干水分。先用1.5中不同處理的共培養(yǎng)發(fā)酵液或發(fā)酵濾液浸種1 h，取出種子，再置于1.4中的107cfu/mL FOC孢子懸浮液中浸種1 h，以無菌水為對照CK。處理完畢，將種子均勻放置在φ＝90 mm的雙層濕濾紙平皿中，每皿20粒，3個重復。25 ℃保濕培養(yǎng)64 h，統(tǒng)計種子發(fā)芽率，測量根長，計算發(fā)芽抑制率和根長增長率。發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽種子粒數/供試種子粒數×100，發(fā)芽抑制率（%）＝（對照組發(fā)芽率－處理組發(fā)芽率）/對照組發(fā)芽率×100，根長增長率（%）＝（處理組根長－對照組根長）/對照組根長×100。

1.7 木霉共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜枯萎病的溫室效果試驗

1.7.1 試驗設計與方法 試驗地點為山東省科學院東區(qū)溫室內，試驗期為2020年9月16日至2020年10月28日，試驗設5個處理：CK、Fludioxonil、HB20111、TW21990、HB20111+TW21990。試驗用土為健康大田土，過篩后等量分裝一次性干凈花盆（口徑13 cm、高12 cm、800 g土/盆），每盆澆入1.4中的300 mL 106cfu/mL的 FOC孢子懸浮液，室溫預培養(yǎng) 3 d。木霉單菌株 HB20111、TW21990及其共培養(yǎng)HB20111+TW21990分別于發(fā)酵培養(yǎng)基中25 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液500倍稀釋后浸種1 h，藥劑處理用100 μg/mL Fludioxonil浸種1 h，CK對照用清水浸種1 h。浸種完畢，將種子均勻播種在花盆中，種子上覆蓋200 g土，每處理20粒種子，3個重復，隨機區(qū)組排列，常規(guī)管理，待出苗后每盆定苗15株。

1.7.2 黃瓜幼苗及土樣收集 試驗結束，小心取出黃瓜幼苗根系，保留完整植株，抖掉根周圍結構松散的土粒，收集與根結合緊密的根際土。土樣放-20 ℃保存，幼苗放4 ℃保存。

1.7.3 病害調查 按照中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準《黃瓜主要病害抗病性鑒定技術規(guī)程第三部分：黃瓜抗枯萎病鑒定技術規(guī)程》，將黃瓜枯萎病病情級別劃分為5個級別：0級，無癥狀；1級，子葉黃化，但未萎蔫；2級，子葉萎蔫；3級，子葉和真葉萎蔫或植株矮化；4級，枯死。并統(tǒng)計病情指數和防治效果。病情指數＝Σ（病級數×該病級植株數）/（最大病級數×植株總株數）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數－處理組病情指數）/對照組病情指數×100。

1.7.4 黃瓜幼苗鮮重調查 黃瓜幼苗沖洗干凈，用濾紙吸干水分，稱量各處理組幼苗鮮重，計算增重率。增重率（%）=（處理組幼苗鮮重－對照組幼苗鮮重）/對照組幼苗鮮重×100。

1.7.5 FOC熒光定量分析 利用DNeasy PowerSoil試劑盒提取土樣DNA，以土樣DNA為模板，FOC特異性引物 FOF1（5′-ACATACCACTTGTTGCCTCG-3′）和 FOR1（5′-CGCCAATCAATTTGAGGAACG-3′）[22]進行定量分析。qRT-PCR 擴增體系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL、10 μmol/L 上下游引物各 1 μL、DNA模板 1 μL、ddH2O 補足至 20 μL。擴增程序：95 ℃預變性 10 min；95 ℃變性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，40 cycles；循環(huán)結束后，樣品加熱到95 ℃，立刻降至60 ℃保持5 s，然后每5 s提高0.5 ℃遞增到95 ℃，建立熔解曲線。根據下列公式計算每克土樣中的FOC拷貝數[23]。待測樣本拷貝數（Copies/g）＝SQ×（6.02×1023×10-9×v）/（SD×660×m），其中SQ為待測樣本濃度，v為提取土樣DNA體積（μL），m為提取土樣質量（g），SD為標準質粒堿基數。

1.8 數據統(tǒng)計與分析

運用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對試驗數據進行分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗，以不同小寫字母表示各處理間在0.05水平上存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 兩株木霉的親和性測定

PDA平板上25 ℃對峙培養(yǎng)5 d，兩菌株HB20111和TW21990親和性較好，菌落間沒有明顯的拮抗帶產生（圖1），兩菌落完全接觸，菌落面積幾乎各占50%，菌落交接處形成一條稍增厚的氣生菌絲帶，整個平板上幾乎布滿分生孢子。平板背面有色素差別，菌株TW21990產生黃色色素，菌株HB20111色素顏色較淺。

圖1 深綠木霉HB20111和哈茨木霉TW21990對峙培養(yǎng)Fig.1 Confrontation culture between T.atroviride HB20111 and T.harzianum TW21990

2.2 木霉共培養(yǎng)發(fā)酵液及濾液浸種抑菌對黃瓜種子發(fā)芽的影響

2.2.1 不同稀釋倍數發(fā)酵液對黃瓜種子發(fā)芽的影響 25 ℃、130 r/min培養(yǎng)88 h，不同稀釋倍數的共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜種子發(fā)芽的影響結果見圖2。稀釋倍數不同，對黃瓜種子發(fā)芽率的影響不同，與對照CK相比，發(fā)酵液50、100倍稀釋液顯著抑制種子發(fā)芽（P＜0.05），發(fā)芽抑制率分別為17.24%、10.35%；而250、500、1000倍稀釋液與對照CK無顯著性差異。稀釋倍數對黃瓜種子的根長有顯著性影響（P＜0.05），在50～500倍稀釋之間，根長與稀釋倍數成正比，500倍稀釋液處理根長增長率達108.53%，但1000倍稀釋液處理則成下降趨勢（根長增長率70.03%）。綜合發(fā)芽率和根長結果，發(fā)酵液500倍稀釋效果最好。

圖2 不同稀釋倍數木霉共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜種子發(fā)芽的影響Fig.2 Effect of cucumber seeds germination with Trichoderma co-cultured fermentation broth at different dilution ratio

2.2.2 不同時間發(fā)酵液對黃瓜種子發(fā)芽的影響 不同時間共培養(yǎng)發(fā)酵液500倍稀釋液對黃瓜種子發(fā)芽的影響結果見圖3。發(fā)酵時間對黃瓜種子的發(fā)芽率無顯著影響，但對黃瓜根長有顯著影響（P＜0.05）。在24～72 h之間，發(fā)酵時間越長，共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜種子根長的促生效果越好，發(fā)酵72 h根長增長率達108.53%；但在72～88 h之間，共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜種子的根長影響不顯著。故最佳發(fā)酵時間為72 h。

圖3 不同時間木霉共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜種子發(fā)芽的影響Fig.3 Effect of cucumber seeds germination with Trichoderma co-cultured fermentation broth at different time

2.2.3 發(fā)酵濾液對黃瓜種子發(fā)芽的影響 發(fā)酵72 h，500倍稀釋的共培養(yǎng)發(fā)酵濾液對黃瓜種子發(fā)芽的影響結果見圖 4。發(fā)酵濾液(FF)與發(fā)酵液(FB)對黃瓜種子發(fā)芽率無顯著影響，但對黃瓜根長的促生效果差異顯著（P＜0.05），根長增長率較發(fā)酵液降低21.19%。

圖4 發(fā)酵濾液對黃瓜種子發(fā)芽的影響Fig.4 Effect of cucumber seeds germination with fermentation filtrate

依據以上結果，共培養(yǎng)發(fā)酵及浸種的最佳條件為：采用發(fā)酵培養(yǎng)基，25 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液500倍稀釋處理。

2.3 木霉共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜枯萎病的溫室防治效果

2.3.1 共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜根際土 FOC拷貝數的影響 溫室條件下，不同處理黃瓜根際土 FOC拷貝數不同（表1）：4組處理與對照CK均存在顯著差異（P＜0.05）；單菌株 HB20111、共培養(yǎng)HB20111+TW21990與藥劑Fludioxonil也存在顯著差異（P＜0.05）；共培養(yǎng)HB20111+TW21990黃瓜根際土FOC拷貝數最低，為0.88×109copies/g，較單菌株 HB20111、TW21990顯著降低了黃瓜根際土FOC拷貝數（P＜0.05）。

2.3.2 共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜枯萎病病情指數的影響 不同處理黃瓜枯萎病病情指數不同（表1），4組處理與對照CK存在顯著差異（P＜0.05）；單菌株HB20111、共培養(yǎng)HB20111+TW21990與藥劑Fludioxonil存在顯著差異（P＜0.05）；共培養(yǎng)HB20111+TW21990病情指數最低，與單菌株及其他處理間均存在顯著差異（P＜0.05），對黃瓜枯萎病的防治效果達73.65%，較單菌株HB20111、TW21990分別提高了6.76%、9.46%。

2.3.3 共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜幼苗鮮重的影響 不同處理對黃瓜幼苗單株鮮重的影響不同（表 1）：4組處理與對照CK存在顯著差異（P＜0.05）；藥劑Fludioxonil、單菌株HB20111及TW21990間無顯著差異；共培養(yǎng)HB20111+TW21990效果最好，與單菌株及其他處理間均存在顯著差異（P＜0.05），幼苗鮮重增重率達35.64%，較單菌株HB20111、TW21990分別提高了11.54%、13.31%。

表1 木霉共培養(yǎng)發(fā)酵液對黃瓜枯萎病的溫室防治效果Table 1 Control efficiency of Trichoderma co-cultured fermentation against cucumber Fusarium wilt in greenhouse

3 討論

近年來，菌株聯合作用防治植物病害的研究逐步引起大家的關注[24,25]。菌株HB20111與TW21990是本實驗室前期篩選的綜合生防效果較好的木霉菌株，菌株HB20111具有生長速率快、抑菌譜廣、易產生分生孢子、水解酶活性較高的特點；菌株 TW21990具有生長速率快、抑菌譜廣、易產生分生孢子、抗生性代謝產物活性較高的特點。兩株木霉在 PDA平板上對峙培養(yǎng)時，無拮抗現象產生，具有較好的親和性，為共培養(yǎng)發(fā)酵提供了有利條件。

通過浸種抑菌萌發(fā)試驗發(fā)現，不同發(fā)酵時間、不同稀釋倍數的共培養(yǎng)發(fā)酵液及發(fā)酵濾液對黃瓜種子的發(fā)芽率及根長影響不同：有的是促生作用，有的則為抑制作用。表明各處理中代謝產物成分及含量可能存在差異，高濃度時抑制種子發(fā)芽，低濃度時促進種子發(fā)芽。發(fā)酵濾液對黃瓜根長的促生效果不如發(fā)酵液處理（P＜0.05），表明發(fā)酵液中的木霉菌體在浸種抑菌萌發(fā)中也扮演重要角色，故選擇共培養(yǎng)的最佳時間及使用濃度也是發(fā)揮其生防活性的重要因素。本文確定了2株木霉共培養(yǎng)最佳時間為72 h，浸種最佳稀釋倍數為500倍。

溫室條件下，共培養(yǎng)發(fā)酵液500倍稀釋液浸種后，黃瓜根際土FOC拷貝數、病情指數及幼苗鮮重均與單菌株HB20111、TW21990存在顯著差異（P＜0.05），顯示兩株木霉間協同增效作用明顯，共培養(yǎng)發(fā)酵后，兩株木霉可以進行優(yōu)勢和功能互補。也可能由于彼此間的生長競爭誘導分泌了更多的抗菌物質，且這些代謝產物也會對彼此的生長和代謝產生影響[26,27]。本研究還表明，各處理組根際土FOC拷貝數與病情指數成正比，與植株鮮重成反比。由于植株發(fā)病嚴重程度與植株根際土中病原菌的含量有關[28]，共培養(yǎng)發(fā)酵處理有效抑制了 FOC在黃瓜根際土中的定殖，故提高了對植物土傳病害的防控作用，促進了作物的健康生長。

木霉是土壤微生物中對植物有益的一大類群，木霉與植物的互作主要通過根部定殖實現，但其對植物地上部分基因表達的影響卻遠大于根部，并可誘導植物產生系統(tǒng)抗性[29]。木霉在田間發(fā)揮作用受多種因素的影響，在植物病害的生物防治應用上還有不少問題需要解決。本文只利用共培養(yǎng)發(fā)酵液進行了溫室防效測定，下一步擬通過液質分析等手段檢測共培養(yǎng)發(fā)酵液中代謝產物的種類及含量，探究上調或下調的物質，以期發(fā)現新型抗生性代謝產物或新的抗生機制。