苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠SCAP/SREBP1信號通路的調(diào)節(jié)作用研究*

馬漪，謝瓊

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，長沙 410000）

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率居女性第2位，男性第3位[1]。目前，結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，其主要治療方法是手術(shù)治療，但對于晚期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)治療效果并不理想。研究表明[2]腫瘤轉(zhuǎn)移是大多數(shù)癌癥患者死亡和治療失敗的主要原因，而通過血液途徑轉(zhuǎn)移到肝臟被認(rèn)為是結(jié)腸癌患者死亡的主要原因。研究證實(shí)[3]結(jié)腸癌的預(yù)后與轉(zhuǎn)移尤其是肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此抑制肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生是提高結(jié)腸癌的治療效果的手段之一。因此，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療是目前臨床的迫切需要。苦參堿是從中藥材苦參中提取得到的生物堿類物質(zhì)，近年來研究證實(shí)[4-5]其對于結(jié)腸癌的治療表現(xiàn)出顯著效果。本文通過研究苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠的腫瘤抑制作用及對SCAP/SREBP1通路的調(diào)節(jié)作用，為苦參堿的藥理作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人結(jié)腸癌 HCT116細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Balb/c裸小鼠，SPF級，6～8周齡，22～24g，購自于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK（湘）2019-0014]，飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)動物房。

1.3 藥品及試劑 苦參堿（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號19080911，純度>98%）；卡培他濱（上海羅氏制藥有限公司，批號 20191011）；SCAP、SREBP1兔多克隆抗體（艾博抗上海貿(mào)易有限公司，貨號ab190103、ab28481）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、轉(zhuǎn)化生長因子β1蛋白（TGF-β1）及白介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（碧云天生物科技有限公司，貨號A0208、PT878、PI328）；TRIzol試劑、cDNA提取試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，貨號 15596018、K1672）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、高效RIPA裂解液、ECL Plus超敏發(fā)光液、DMEM培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，貨號G1120、R0010、PE0010、11995）。

1.4 設(shè)備與儀器 BX51型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；QuantStudio 3實(shí)時PCR系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司）；CUT4060石蠟切片機(jī)（德國MicroTel公司）；GelDoc Go凝膠成像系統(tǒng)（伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司）；Allegra X-15R臺式冷凍離心機(jī)（貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）；7000CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Napco公司）。

1.5 分組及給藥 取結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞活力達(dá)到95%時，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為2×107個/mL。

72只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、肝轉(zhuǎn)移模型組、苦參堿低、中、高劑量組及卡培他濱組，每組 12只，參照文獻(xiàn)方法[6]建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型，小鼠麻醉后稱質(zhì)量，取仰臥位將小鼠固定于手術(shù)臺上，沿腹部正中切開，從脾下極貼近脾包膜向脾內(nèi)注射0.2mLHCT116細(xì)胞懸液，縫合，關(guān)腹，空白對照組小鼠只進(jìn)行假手術(shù)，不注射細(xì)胞懸液，7 d后小鼠腹部超聲顯示肝臟部位可見直徑為1 cm左右腫瘤生成視為造模成功?？鄥A低、中、高劑量組分別灌胃給予 12.5、25、50 mg/kg[7]的苦參堿，給藥 21 d[8]，卡培他濱組按照267 mg/kg[9]灌胃給予卡培他濱，給藥14 d，停藥7 d，空白對照組及肝轉(zhuǎn)移模型組灌胃給予生理鹽水。

1.6 小鼠肝臟質(zhì)量及肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)的測定小鼠處死后分離肝臟，并進(jìn)行稱質(zhì)量，檢查各組小鼠肝臟表面肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。

1.7 肝組織TGF-β1、IL-6測定 取小鼠肝組織樣品在4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液中研磨勻漿，15 000 r/min，離心半徑10 cm，4°C離心15 min，取上清液，用TGF-β1、IL-6 ELISA試劑盒檢測肝組織上清液中TGF-β1、IL-6水平。

1.8 HE染色 小鼠肝組織在4%中性甲醛固定24 h，脫水、透明處理后，石蠟包埋，石蠟切片機(jī)進(jìn)行5 μm切片，經(jīng)常規(guī)HE染色后，在顯微鏡下采用盲法進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.9 腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA測定 小鼠處死后，分離腫瘤組織，使用TRIzol試劑進(jìn)行總RNA提取，用cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。各基因引物如表1所示，應(yīng)用梯度實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增系統(tǒng)，PCR檢測SCAP、SREBP1mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)。結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCT法計算 SCAP、SREBP1 mRNA相對表達(dá)水平。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequence of genes

1.10 腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白水平測定 小鼠處死后取腫瘤組織，加入裂解液，研磨勻漿并離心后，測定蛋白濃度，各組取含有50 μg蛋白的上清液，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、分離后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，用5%牛血清白蛋白室溫封閉 1 h，用 SCAP、SREBP1（1∶1 000 稀釋）兔多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶2 000稀釋）孵育，使用ECL試劑和凝膠成像系統(tǒng)成像，ImageJ14.0軟件定量分析 SCAP、SREBP1蛋白水平。

1.11 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù) 所有統(tǒng)計分析使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。計量資料符合正態(tài)分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝臟質(zhì)量及肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)的影響 苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝臟重量及肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)的影響如圖1和圖2所示，與空白對照組比較，肝轉(zhuǎn)移模型組小鼠肝臟質(zhì)量及肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)顯著增加（P<0.05）；與肝轉(zhuǎn)移模型組比較，苦參堿各劑量組及卡培他濱組肝臟質(zhì)量及肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)顯著減少（P<0.05），隨著苦參堿劑量的增加，肝臟質(zhì)量及肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)降低更明顯。

圖1 各組小鼠肝臟質(zhì)量比較結(jié)果Fig.1 Comparison of liver weights of mice in each group

圖2 各組小鼠肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較結(jié)果Fig.2 Comparison of the number of liver metastasis nodules in each group of mice

2.2 苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝組織TGF-β1、IL-6的影響 苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝組織TGF-β1、IL-6的影響如圖3和圖4所示，與空白對照組比較，肝轉(zhuǎn)移模型組小鼠肝組織TGF-β1、IL-6水平顯著升高（P<0.05）；與肝轉(zhuǎn)移模型組比較，苦參堿各劑量組及卡培他濱組肝組織TGF-β1、IL-6水平顯著降低（P<0.05），隨著苦參堿劑量的增加，肝組織TGF-β1、IL-6水平降低更明顯。

圖3 各組小鼠肝組織TGF-β1水平比較結(jié)果Fig.3 Comparison of TGF-β1 levels in liver tissues of mice in each group

圖4 各組小鼠肝組織IL-6水平比較結(jié)果Fig.4 Comparison of IL-6 levels in liver tissues of mice in each group

2.3 肝組織HE染色結(jié)果 肝組織病理學(xué)檢查如圖5所示，空白對照組小鼠肝組織未見明顯病理學(xué)變化，與空白對照組比較，肝轉(zhuǎn)移模型組小鼠肝組織腫瘤細(xì)胞聚集，伴肝組織細(xì)胞炎癥浸潤及壞死脫落；與肝轉(zhuǎn)移模型組比較，苦參堿各劑量組及卡培他濱組肝組織腫瘤細(xì)胞聚集減輕，病理學(xué)改善。

圖5 肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE染色，×400）Fig.5 Liver histopathological examination results(HE staining，×400)

2.4 苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA的影響 苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA的影響如圖6所示，與空白對照組比較，肝轉(zhuǎn)移模型組小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA水平顯著升高（P<0.05）；與肝轉(zhuǎn)移模型組比較，苦參堿各劑量組及卡培他濱組腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA水平顯著降低（P<0.05），隨著苦參堿劑量的增加，腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA水平降低更明顯。

圖6 小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA水平比較結(jié)果Fig.6 Comparison of SCAP and SREBP1 mRNA levels in mouse tumor tissues

2.5 苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白表達(dá)的影響 苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白表達(dá)的影響如圖7所示，與空白對照組比較，肝轉(zhuǎn)移模型組小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白水平顯著升高（P<0.05）；與肝轉(zhuǎn)移模型組比較，苦參堿各劑量組及卡培他濱組腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白水平顯著降低（P<0.05），隨著苦參堿劑量的增加，腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白水平降低更明顯。

圖7 苦參堿對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白表達(dá)的影響Fig.7 The effect of matrine on the expression of SCAP and SREBP1 protein in tumor tissues of mice with liver metastases from colon cancer

3 討論

結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌進(jìn)展過程中常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移現(xiàn)象之一，臨床中表現(xiàn)出進(jìn)行性貧血、低熱、肝腫大、黃疸和腹水等多種癥狀，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量及預(yù)后。研究表明[10]結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)病率較高，約有50%的結(jié)腸癌患者會并發(fā)肝轉(zhuǎn)移。目前臨床中對于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療采用全身化療和局部手術(shù)治療，盡管肝切除是目前最有效的局部控制治療，但肝切除后患者5年生存率較低，且手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率高達(dá)70%[11]。同時目前結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的臨床化療方案中卡培他濱作為一線推薦藥物，但在臨床使用過程中存在耐藥率高、不良反應(yīng)大等多種缺點(diǎn)，所以目前對于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療藥物的開發(fā)仍是臨床的迫切需求。

苦參堿是從豆科植物苦參（Sophora flavescens Alt.）的干燥根、植株、果實(shí)中提取得到的生物堿，近年來研究表明[12-13]，苦參堿對酒精性脂肪肝、神經(jīng)病理性疼痛、萎縮性胃炎、宮頸癌等疾病具有顯著的藥理作用。近年來研究表明苦參堿對于結(jié)腸癌具有顯著的治療作用，繆冬映[4]研究表明苦參堿能夠通過調(diào)節(jié)Akt通路顯著抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡；王偉等[5]研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠抑制P-糖蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控結(jié)腸癌對奧沙利鉑的耐藥性；常城等[14]報道了苦參堿能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞周期阻滯，抑制HT29細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。同時，有研究表明苦參堿對于結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞及結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移均有顯著的抑制作用[15-16]。

肝臟質(zhì)量及肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)能夠反映結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的嚴(yán)重程度及肝組織炎癥水平狀態(tài)；TGF-β1及IL-6是肝組織炎癥病變及病理進(jìn)展的重要指標(biāo)之一，近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在內(nèi)源性腫瘤肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生過程中起到一定的促進(jìn)作用，檀誼洪等[17]研究發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸癌組織會釋放TGF-β1進(jìn)而促使肝臟Th1/Th2樣細(xì)胞因子漂移，誘導(dǎo)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移；黃曉明等[18]發(fā)現(xiàn)CT26細(xì)胞可誘導(dǎo)肝臟分泌TGF-β1，進(jìn)而促進(jìn)小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的形成；任淑萍等[19]研究發(fā)現(xiàn)IL-6腫瘤間質(zhì)血管中表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移；黃偉華等[20]報道了肝再生磷酸酶-3通過上調(diào)IL-6水平進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)研究表明，與肝轉(zhuǎn)移模型組比較，苦參堿各劑量組肝臟質(zhì)量、肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)、肝組織TGF-β1及IL-6水平均明顯降低，這提示苦參堿能夠成劑量依賴性的抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，緩解肝組織病理進(jìn)展，并降低結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠TGF-β1及IL-6水平，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移進(jìn)一步惡化。

SCAP/SREBP1通路是維持體內(nèi)糖代謝、膽固醇及脂類代謝平衡的重要信號通路。SCAP作為SREBP1蛋白激活的重要調(diào)節(jié)蛋白，SCAP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與SREBP1結(jié)合形成新的復(fù)合物，并通過囊泡被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體膜上，經(jīng)過高爾基體膜上相應(yīng)蛋白水解后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中被激活并發(fā)揮相應(yīng)作用。近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)SCAP/SREBP1通路與腫瘤疾病的發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。鄧嘉成[21]研究報道了SCAP誘導(dǎo)的SREBP1的激活是腫瘤生長所必需的條件，同時阻斷SREBP1的激活能夠抑制膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖；Jump等[22]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)SCAP/SREBP1過度激活；羅吉等[23]研究發(fā)現(xiàn)抑制SREBP1的表達(dá)則能夠通過抑制PIK3R3基因進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯，并誘導(dǎo)其凋亡；李衛(wèi)華等[24]研究發(fā)現(xiàn)SREBP1在正常子宮細(xì)胞中低表達(dá)，而在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，抑制SREBP1的表達(dá)則能夠抑制子宮內(nèi)膜癌的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲能力，由此可見SCAP/SREBP1的過度表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與肝轉(zhuǎn)移模型組比較，腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA及蛋白水平顯著降低，提示苦參堿成劑量依賴性的抑制SCAP/SREBP1通路的過度激活，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移進(jìn)展。

綜上所述，苦參堿能夠顯著抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，緩解肝組織病理學(xué)改變，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)SCAP/SREBP1信號通路有關(guān)。