齊墩果酸抗肺癌作用及其機(jī)制研究進(jìn)展*

池嘉棟 ，顧鵬飛 ，馬煒柯 ，趙杰 ，鄭向前 ，高明 ，3

（1.甲狀腺頸部腫瘤科，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實驗室，天津 300060；2.骨科，天津市天津醫(yī)院，天津大學(xué)，天津 300211；3.乳腺甲狀腺外科，天津市人民醫(yī)院，天津 300121）

在全球范圍內(nèi)，肺癌對人類健康帶來的威脅愈發(fā)顯著[1-2]。盡管隨著研究的深入，人們對肺癌的誘因、發(fā)生發(fā)展過程、致病機(jī)制和治療方案選擇有了較深入的認(rèn)識，但其發(fā)病率和病死率依然高居不下。根據(jù)細(xì)胞分化程度以及形態(tài)特征，肺癌常分為小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）兩類。非小細(xì)胞肺癌具體分為鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌3類[3]。非小細(xì)胞肺癌在所有類型肺癌中發(fā)病率最高，約占全部肺癌患者的80%。其極易發(fā)生轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端臟器，患者的生存期較短[1]。

齊墩果酸又名慶四素，是一種五環(huán)三萜類化合物，由英國化學(xué)家FB Powers首次從木犀科植物中發(fā)現(xiàn)并分離獲得，后由Ruzicka確定了其結(jié)構(gòu)[4]。其廣泛存在于木犀科、龍膽科、五加科等植物，以及苦丁茶、葡萄皮等食物的表皮膜中，可形成一種特殊的蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)屏障，抵御病原體和水分流失。除了防護(hù)作用外，齊墩果酸還具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗糖尿病、抗微生物等藥理作用，并且其抗癌作用已在多種癌癥中得到驗證，如肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌等[5-7]?，F(xiàn)根據(jù)文獻(xiàn)將齊墩果酸抗肺癌作用及機(jī)制綜述如下。

1 齊墩果酸的提取、分離和表征

齊墩果酸的提取方法包括索氏提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等[5-6]。薄層色譜（TLC）、高效液相色譜（HPLC）和核磁共振（NMR）常用于齊墩果酸的表征和鑒定[5，7]。齊墩果酸的分離通常需要用非極性溶劑（如正己烷、石油醚等），隨后利用沉淀及結(jié)晶、真空液相色譜和柱層析等技術(shù)分離。溶劑的選擇、萃取溶劑的濃度、溶劑與植物物質(zhì)的比例、溫度、萃取時間等因素也會對齊墩果酸的提取和分離效率產(chǎn)生影響[8]。

2 齊墩果酸抑制肺癌的作用機(jī)制

齊墩果酸抑制肺癌主要通過直接和間接兩個途徑來發(fā)揮作用。肺癌的主要發(fā)病機(jī)制包括細(xì)胞凋亡異常以及細(xì)胞周期失控等。細(xì)胞凋亡是由多種因子參與介導(dǎo)并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過程。多項研究表明，肺癌與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)，線粒體、死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程在肺癌中均具有重要作用[9]。細(xì)胞周期失控會引起肺癌細(xì)胞異常復(fù)制增殖，伴隨新生血管的異常形成，共同組成肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要特征。此外，免疫系統(tǒng)也在其中扮演著重要的角色。探討齊墩果酸在腫瘤發(fā)展不同環(huán)節(jié)的作用及機(jī)制，有望為肺癌的臨床治療提供新思路和新方向[10-11]。

2.1 抑制肺癌細(xì)胞增殖 在小鼠皮下荷瘤模型中，治療組每日予以口服齊墩果酸（低劑量組 40 mg/kg；高劑量組 120 mg/kg）。結(jié)果顯示高劑量組瘤體積（600 mm3）顯著低于低劑量組（1 500 mm3）和對照組（2 200 mm3），表明齊墩果酸可以抑制腫瘤的生長[12]。Matsunaga等[13]報道了一項9，10-菲醌對于肺癌影響的體外實驗研究，發(fā)現(xiàn)9，10-菲醌能通過醛酮還原酶1-B10促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長。而齊墩果酸是醛酮還原酶1-B10的拮抗劑。在3D細(xì)胞培養(yǎng)模型中，齊墩果酸能顯著抑制9，10-菲醌的促癌作用，聯(lián)合齊墩果酸組的腫瘤體積僅為單純菲醌組的1/3。此外，研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸呈時間及劑量依賴性抑制A549，NCI-H460和NCI-H1299等肺癌細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明齊墩果酸抑制PGCL3細(xì)胞的IC50為44.73 μmol/L，在該濃度條件下，集落形成抑制率為61.6%。CCK8實驗表明齊墩果酸干預(yù)Bel-7402細(xì)胞48 h后能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖速率[14]?？傮w而言，齊墩果酸通過抑制肺癌細(xì)胞的增殖能夠發(fā)揮顯著抗腫瘤作用。

2.2 誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡 腫瘤細(xì)胞的凋亡過程與正常細(xì)胞存在很大差異。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制其發(fā)展及轉(zhuǎn)移是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一[15]。研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸處理非小細(xì)胞肺癌后，凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的活性顯著升高[16]。齊墩果酸可通過多個作用靶點(diǎn)同時調(diào)控不同信號通路與生物學(xué)過程從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中包括細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平、NF-κB信號通路、Notch信號通路、JAK/STAT3信號通路、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）家族蛋白、線粒體功能、細(xì)胞色素C釋放以及核糖聚合酶的表達(dá)等[17]，具體作用機(jī)制如下。

2.2.1 調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子水平 鈣離子在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，參與人體內(nèi)各項生理活動，維持細(xì)胞的膜電位并參與神經(jīng)電信號傳導(dǎo)[18-19]。通常認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子（Ca2+）濃度的持續(xù)升高是凋亡的啟動環(huán)節(jié)之一[20]。黃煒等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與甘草酸、甘草次酸相比，齊墩果酸處理肺癌細(xì)胞PGCL3 48 h后，細(xì)胞凋亡率升高到61.6%，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，因此齊墩果酸具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。衛(wèi)小紅等[22]用梯度濃度齊墩果酸處理A549細(xì)胞后，檢測胞內(nèi)鈣離子濃度及細(xì)胞凋亡率改變。結(jié)果顯示隨著齊墩果酸濃度升高，胞內(nèi)Ca2+濃度隨之顯著升高。相關(guān)分析結(jié)果表明細(xì)胞凋亡率與胞內(nèi)鈣離子濃度具有相關(guān)性（R2＝0.981，P＜0.01）。Ca2+作為第二信使參與細(xì)胞凋亡早期和晚期的全過程，和Capase-3酶的激活也密切相關(guān)。有研究報道，當(dāng)NCIH446肺癌細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度為（202.18±21.20）μmol/L 時，凋亡相關(guān)基因間變性淋巴瘤激酶（ALK）、KARS、Bax、Bcl-2表達(dá)均顯著升高[23]。

2.2.2 影響B(tài)cl-2/Bax蛋白的表達(dá) 細(xì)胞凋亡受多種蛋白調(diào)控，其中Bcl-2家族起著至關(guān)重要的作用[24]。Bcl-2具有明顯抑制細(xì)胞凋亡的作用，位于細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中[25]。研究表明，大細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織Bcl-2基因表達(dá)顯著升高，并且其高表達(dá)和不良預(yù)后相關(guān)[26]。Feng等[27]從夏枯草中分離得到了齊墩果酸，將其與肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞共同孵育，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率和齊墩果酸呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，證明齊墩果酸可以誘導(dǎo)SPC-A-1細(xì)胞的凋亡。后續(xù)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞Bax和Bad高表達(dá)，并抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明齊墩果酸能通過影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。

2.2.3 調(diào)控NF-κB信號通路 NF-κB是一個具有多個作用靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子[28]。朱斌等[29]的研究表明，OLO2（一種新型齊墩果酸衍生物）在人肺腺癌細(xì)胞A549中的 IC50約為（1.96±0.41）μmol/L，OLO2治療后顯著提高了腫瘤細(xì)胞凋亡水平。OLO2聯(lián)合順鉑治療能顯著降低NF-κB基因的表達(dá)。從表觀遺傳學(xué)的角度來看，齊墩果酸能夠顯著抑制小鼠肺組織中NF-κB的乙?；揎椝?，從而特異性調(diào)控靶基因的表達(dá)[30]。將齊墩果酸衍生物SZC015與非小細(xì)胞肺癌H322細(xì)胞共孵育后，細(xì)胞凋亡率顯著上升。在這個過程中，0、10、20、30 μmol/L SZC015 梯度濃度處理后，下游促凋亡蛋白cleaved Caspase-3和cleaved Caspase 9的表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性升高。同時Akt等保護(hù)性基因表達(dá)呈現(xiàn)遞減趨勢[31]。這些研究表明齊墩果酸可以通過干擾NF-κB信號通路相關(guān)分子誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡。

2.2.4 調(diào)控JAK/STAT3信號通路 STAT3信號通路在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[32]。在晚期肺癌患者中，大約50%存在STAT3信號的過度持續(xù)激活。STAT3的激活受細(xì)胞內(nèi)激酶的精確調(diào)控，如Janus Kinase等[33]。在非小細(xì)胞肺癌中，由于JAKs等激酶的功能異常，導(dǎo)致STAT3過度活化并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而與細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[34]。因此，抑制STAT3向核內(nèi)轉(zhuǎn)移可能是治療肺癌的一個有效策略。Tang等人利用肺癌細(xì)胞A549進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)齊墩果酸干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著增加。機(jī)制研究表明齊墩果酸可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)生成大量ROS，ROS能夠抑制Akt和JAK2/STAT3信號，降低JAK2和STAT3的磷酸化水平，進(jìn)而阻止STAT3核轉(zhuǎn)位，最終促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。

2.3 影響細(xì)胞周期

2.3.1 調(diào)控miR-122/cyclin G1/MEF 2D軸阻滯細(xì)胞周期 齊墩果酸調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制主要是通過影響miR-122/cyclin G1/MEF 2D通路，引起細(xì)胞周期停滯[35]。許多研究表明，miRNA是肺癌進(jìn)展中一類重要的調(diào)控因子，與肺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有著密不可分的關(guān)系，而中藥活性單體齊墩果酸可以特異性調(diào)控靶標(biāo)miRNA的表達(dá)[12]。Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸在鼠源鱗狀上皮細(xì)胞LC-1及小鼠原發(fā)性肺癌中，能夠上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子HNF-6和HNF-1α的水平從而促進(jìn)miR-122的表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游分子cyclin G1以及MEF 2D的表達(dá)，使癌細(xì)胞停滯在G0/G1期，降低肺癌細(xì)胞的增殖率。齊墩果酸能使A549細(xì)胞增殖速率明顯下降，該抑制作用具有時間和濃度依賴性。此外，在活體水平齊墩果酸也能誘導(dǎo)miR-122表達(dá)增加。因此，齊墩果酸能夠影響miR-122/cyclin G1/MEF 2D通路導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散。

2.3.2 調(diào)控cyclin B1/cdc 2阻滯細(xì)胞G2/M期 絲裂原活化蛋白激酶的激活與細(xì)胞周期阻滯密切相關(guān)，有研究表明齊墩果酸可以顯著增加ERK的磷酸化水平，因此齊墩果酸可能通過該方式影響細(xì)胞周期。細(xì)胞周期的G2/M期進(jìn)程是由成熟促進(jìn)因子（cyclin B1/cdc 2復(fù)合物）驅(qū)動。Wang等[17]將齊墩果酸與肺癌細(xì)胞A549孵育后，發(fā)現(xiàn)G2/M期的細(xì)胞含量升至60%，遠(yuǎn)高于對照組的15%。在齊墩果酸的作用下，G2/M期過渡檢查點(diǎn)cyclin B1和cdc2表達(dá)量顯著降低。另一方面，p21表達(dá)量卻顯著升高。已知p21是一種促進(jìn)細(xì)胞停留在G2/M期的蛋白。因此，齊墩果酸作用于腫瘤細(xì)胞后，可以增加ERK磷酸化水平以及p21蛋白表達(dá)，抑制cyclin B1/cdc 2復(fù)合物的合成，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，從而有效干擾肺癌細(xì)胞周期過程。

2.4 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬 自噬是一種依賴溶酶體的自我降解途徑。一般認(rèn)為發(fā)生在腫瘤細(xì)胞的自噬起到自我保護(hù)作用，但是過度的自噬會起到抑癌作用。一項在A459細(xì)胞中的研究表明，20 μg/mL濃度的齊墩果酸干預(yù)A459細(xì)胞48 h后，細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II的表達(dá)明顯增加，同時伴隨線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，主要表現(xiàn)為線粒體腫脹，并可見大量碎片。另一項針對A459細(xì)胞的研究表明，SZC017（齊墩果酸衍生物）能夠誘導(dǎo)LC3-II及Beclin-1的表達(dá)呈劑量依賴性升高，并可觀察到大量自噬體[36]。同時，齊墩果酸干預(yù)后細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)因子PINK 1/Parkin的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高[37]。另一方面，齊墩果酸對于自噬的影響和細(xì)胞凋亡/增殖密切相關(guān)。氯喹作為自噬抑制劑，干預(yù)H322細(xì)胞后，pro-Caspase 3及LC3的表達(dá)明顯升高。這提示一定程度的抑制自噬可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖[31]。

2.5 調(diào)控腫瘤微環(huán)境

2.5.1 抑制腫瘤血管新生 血管生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)[38]。其中VEGF在血管生成中起主導(dǎo)地位[39]。牛國平等[39]研究了齊墩果酸對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）增殖、侵襲和遷移能力的影響，結(jié)果表明齊墩果酸能夠有效抑制HUVECs的遷移能力。此外，齊墩果酸可以在體內(nèi)水平阻斷VEGFR磷酸化、抑制MEK/JNK通路激活，從而抑制肺癌的血管生成過程并降低其通透性，最終抑制肺癌細(xì)胞的擴(kuò)增和轉(zhuǎn)移。

2.5.2 調(diào)控腫瘤免疫反應(yīng) 免疫反應(yīng)是影響癌癥發(fā)展的重要因素之一。通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，間接對腫瘤進(jìn)行免疫調(diào)控是最新的研究熱點(diǎn)。齊墩果酸能夠顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力及T淋巴細(xì)胞的免疫功能。在荷瘤小鼠體內(nèi)，齊墩果酸可以增加NK細(xì)胞的數(shù)目，并且可以促進(jìn)其分泌白介素（IL）-2因子，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞殺傷能力[40]。在肺癌臨床治療中，基于PD-1/PDL-1的免疫治療策略受到越來越多關(guān)注。在A549與T細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，齊墩果酸能夠顯著促進(jìn)T細(xì)胞分泌IL-2，同時增強(qiáng)T細(xì)胞對A549細(xì)胞的殺傷作用[41]。研究證明齊墩果酸可以提高腫瘤微環(huán)境中促炎因子IL-1β的含量，從而有效提升抗原提呈作用，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[41]。

3 齊墩果酸的衍生物及新劑型

齊墩果酸具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等藥理活性，但其多環(huán)剛性結(jié)構(gòu)又使得齊墩果酸具有水溶性差、生物利用度低、毒性大、藥理活性弱等缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其療效。為了改進(jìn)這些缺點(diǎn)，研究人員以齊墩果酸母環(huán)結(jié)構(gòu)為模板來進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可以顯著提高齊墩果酸的水溶性和生物利用度，為新藥的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。目前齊墩果酸衍生物主要是在C-3羥基、C-12/C-13雙鍵和C-28位羧基上進(jìn)行功能化修飾[42]。新劑型主要包括納米顆粒、脂質(zhì)體、固體分散體和磷脂復(fù)合物制劑等。通過對齊墩果酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以及劑型優(yōu)化能夠顯著提高其水溶性和生物利用度等[43]。

3.1 酯類/氮雜環(huán)類衍生物 以齊墩果酸為前體化合物，通過酯化、氧化還原、縮合等反應(yīng)，合成齊墩果酸磷脂類化合衍生物，通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)，該化合物抑制肺癌的能力較原齊墩果酸有著顯著性的提高，同時其安全性也有很大的提升[44]。此外，以齊墩果酸為先導(dǎo)化合物，通過氧化還原反應(yīng)得到氮雜環(huán)衍生物QDGS-6。體內(nèi)外活性檢測表明，QDGS-6的活性相較于單純齊墩果酸具有明顯的提高，在細(xì)胞水平上的安全性更高，在有效抑制肺癌細(xì)胞A549增殖的同時，生物毒性更低[45]。

3.2 膠束包合物 膠束可以提高齊墩果酸的溶解度、生物利用度等[46]。研究發(fā)現(xiàn)利用薄膜分散法制備了齊墩果酸膠束，并對其進(jìn)行表征及體內(nèi)外釋放效率的驗證。體外釋藥結(jié)果表明，包含游離齊墩果酸的透析袋在24 h釋藥約為80%，然而齊墩果酸膠束僅為40%左右，因此可以達(dá)到緩釋目的。此外，齊墩果酸膠束對A549和PC-9細(xì)胞的抗腫瘤效果要明顯高于游離齊墩果酸。體內(nèi)實驗結(jié)果證明齊墩果酸膠束可顯著減小肺癌腫瘤體積，抑制腫瘤的侵襲、遷移[47]。所以，齊墩果酸聚合物膠束是一種很有前途的納米藥物遞送系統(tǒng)，為肺癌的臨床治療提供了新的理論基礎(chǔ)和技術(shù)策略。

4 結(jié)論與展望

齊墩果酸可通過多種途徑抑制肺癌，對肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲均具有一定的抑制作用。目前臨床上對肺癌的非手術(shù)治療大多依靠放療、化療、靶向治療及免疫治療等，然而放化療嚴(yán)重的副作用及不良反應(yīng)依然是不可避免的，相對而言，齊墩果酸等中藥單體在副作用及不良反應(yīng)上有著明顯優(yōu)勢，且隨著研究深入，化學(xué)合成的齊墩果酸衍生物及新劑型能夠顯著提高其水溶性和生物利用度，強(qiáng)化抗腫瘤效果的同時保證生物安全性。因此，未來進(jìn)一步結(jié)合中醫(yī)學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等多學(xué)科技術(shù)制備可以精確、高效靶向腫瘤部位的齊墩果酸新制劑，有望為肺癌的臨床治療提供新的策略和方向。