光敏水凝膠免疫識(shí)別嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 Spike蛋白的快速納米檢測(cè)方法*

段醒妹 ，陳小華 ，帥 明

（1. 電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610054；2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072；3. 個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072）

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）可導(dǎo)致病毒性肺炎或肺部感染，傳染性高，具有廣泛的組織嗜性［1］。自2019 年新型冠狀病毒肺炎疫情暴發(fā)以來，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的核酸檢測(cè)試劑盒發(fā)揮了重要作用，但存在以下問題。1）SARS - CoV - 2為RNA 病毒，需依次完成樣本處理、集中送檢，流程復(fù)雜，無法滿足快速、高通量的檢測(cè)需求，若僅采用核酸檢測(cè)，易造成醫(yī)療擁擠，且部分患者無法及時(shí)確診，導(dǎo)致治療延誤或疫情擴(kuò)散；2）核酸檢測(cè)條件要求較高，需專業(yè)人員和較嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件；3）部分無癥狀感染者攜帶病毒量較低，采集的樣本中SARS-CoV-2核酸含量較低、PCR 實(shí)驗(yàn)操作失誤或樣本發(fā)生污染等均會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果［2-4］。本研究中基于抗原-抗體免疫識(shí)別反應(yīng)、納米技術(shù)與光敏水凝膠技術(shù)，建立了快速檢測(cè)SARS-CoV-2 Spike（S）蛋白的方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

N-1300D-W 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）；透析袋（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)為807D022）；WF - 501B 型藍(lán)光手電筒（美國(guó) UltraFire 神火公司）；GR110DP 型高壓滅菌器（美國(guó)致微儀器公司）。

1.2 試劑

馬來酰亞胺- 聚乙二醇- 聚己內(nèi)酯（Mal- PEG -PCL）聚合物（批號(hào)為RP01631084），甲氧基聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（mPEG-PCL）聚合物（批號(hào)為RM019155），均購(gòu)自西安瑞禧生物科技有限公司；S 蛋白抗體［Human anti - SARS - CoV - 2 Spike RBD antibody（hFC），成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)為S209906］；S 蛋白（美國(guó)OriGene公司，批號(hào)為TP701142）；光引發(fā)劑Irgacure 2959（Merck & Co.，Inc.，批號(hào)為410896）；甲基丙烯酸酐（MA，批號(hào)為EFL - GM - 30），明膠（批號(hào)為EFL -GEL - 001），均購(gòu)自蘇州永沁泉智能設(shè)備有限公司；Hepes 緩沖液（廣州賽國(guó)生物科技有限公司，批號(hào)為EZ2811C237）；其余試劑均為分析純，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

溶液A：分別取mPEG-PCL聚合物［相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為4 000，PEG 和PCL 的Mr均為2 000，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖 1 A］10 mg 和 Mal - PEG - PCL 聚合物（Mr為4 000，PEG和PCL的Mr均為2 000，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1 B）90 mg，混勻，用二氯甲烷［5-6］溶解，置溫度為60 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45 min，成膜。將膜取出，溶解于去離子水（或雙蒸水、純化水、生理鹽水）中。在60 ℃水浴條件下振蕩5 min，得質(zhì)量濃度為10 mg/ mL 的聚乙二醇- 聚己內(nèi)酯-馬來酰亞胺（MP-Mal）納米粒溶液，置4 ℃條件下保存，備用。分別取MP-Mal納米粒溶液100 mL和SARS - CoV - 2 S 蛋白抗體 100 mg，溶于 Hepes 緩沖液中，混勻，置4 ℃條件下過夜，即得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的S 蛋白抗體-MP-Mal 納米粒溶液，置4 ℃條件下保存，備用。取Irgacure 2959（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1 C）1.12 g（5 mmoL）、巰基乙酸0.24 mL（3.4 mmoL）、對(duì)甲苯磺酸0.16 g（0.83 mmoL），溶于50 mL 二氯甲烷中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于冷凝管中加熱回流5 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，最后用柱層析分離，即得目標(biāo)修飾產(chǎn)物2- 巰基乙酸-2-［4-（2-羥基-2-甲基丙酰基）苯氧基］乙酯和疏基 - Irgacure 2959。取S 蛋白抗體 - MP - Mal 納米粒溶液 10 mL、疏基 -Irgacure 2959 6 mg，溶于Hepes 緩沖液，混勻，置4 ℃條件下過夜。將混合溶液置透析袋（Mr為2 000）中，透析液為蒸餾水，置4 ℃條件下過夜，即得S蛋白抗體-MP-Irgacure 2959納米粒溶液（溶液A），置4 ℃條件下保存，備用。

圖1 化學(xué)結(jié)構(gòu)式A.mPEG-PCL polymer B.Mal-PEG-PCL polymer C.Irgacure 2959Fig.1 Chemical structures

溶液B：取純化水，置500 mL錐形瓶中，于121 ℃高壓滅菌器內(nèi)滅菌40 min；將滅菌后的純化水（溶液B）分裝于安瓿瓶中，每瓶2 mL，密封，保存。

溶液C：取明膠10 g，精密稱定，置100 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，60 ℃條件下攪拌至溶解，用滴液漏斗將8 mL MA緩慢滴入明膠溶液中，50 ℃條件下反應(yīng)3 h。加入40 ℃預(yù)熱的PBS 400 mL，將明膠溶液稀釋5 倍，用透析袋（Mr為12 000～14 000）在溫度為40 ℃、轉(zhuǎn)速為300 r/min 條件下透析7 d，再凍干7 d，使之呈白色泡沫狀，即得甲基丙烯?；髂z（GelMA），于4 ℃條件下保存。將 GelMA 用 PBS 溶解至濃度為 25%（m/V）的GelMA 水凝膠溶液（溶液C），以每瓶1 mL 的量分裝，于4 ℃條件下密封、避光，保存。

2.2 檢測(cè)方法

1）取出咽拭子，去包裝，將其浸入SARS - CoV - 2 S 蛋白溶液1 cm，充分沾染S 蛋白。2）取出咽拭子，插入溶液A 中，使拭子頭完全浸沒于溶液，攪拌3～5 s，使咽拭子上的SARS - CoV - 2 S 蛋白與溶液中納米粒子上偶聯(lián)的抗體形成較緊密的非共價(jià)結(jié)合。3）從溶液A中取出咽拭子，插入溶液B中，使拭子頭完全浸沒于溶液，攪拌3～5 s，充分洗滌。4）從溶液B 中取出咽拭子，插入溶液C 中，使拭子頭完全浸沒于溶液，攪拌3～5 s，取出。5）用藍(lán)光手電筒（照射波長(zhǎng)為405 nm）持續(xù)照射5～20 s，裝載溶液C 的試劑瓶與水平面保持垂直，光源入射角度需保證試劑瓶?jī)?nèi)溶液充分接受照射，倒置試劑瓶，使瓶身與水平面夾角為45°，觀察瓶?jī)?nèi)溶液是否凝固，若瓶?jī)?nèi)溶液由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，溶液不沿瓶壁向下流動(dòng)，為陽性，即含SARS-CoV- 2 S 蛋白；反之則為陰性，即不含SARS-CoV-2 S蛋白。

2.3 檢測(cè)溶液制備原料比例的確定

通過前期篩選試驗(yàn)確定MP - Mal 納米粒中Mal -PEG - PCL 聚合物與mPEG - PCL 聚合物的質(zhì)量比為0.2～9.0。其中，Mal - PEG - PCL 聚合物的質(zhì)量為90 mg，mPEG - PCL 聚合物的質(zhì)量為 10～450 mg。優(yōu)選Mal-PEG-PCL 聚合物9份（每份10 mg），mPEG-PCL聚合物 1 份（10 mg），mPEG - PCL 聚合物的Mr為4 000～8 000，mPEG-PCL（1∶1，Mr/Mr）；Mal-PEG-PCL聚合物的Mr為4 000～8 000，PEG-PCL（1∶1，Mr/Mr）。

前期制備溶液A 時(shí)，疏基-Irgacure 2959 的質(zhì)量為5～10 mg，在此范圍內(nèi)，S 蛋白抗體 - MP - Irgacure 2959 納米粒可有效結(jié)合光敏水凝膠；同時(shí)，每次反應(yīng)S 蛋白抗體- MP - Mal 納米粒中S 蛋白抗體的質(zhì)量為50～100 mg，在此范圍內(nèi)，S 蛋白抗體 - MP - Mal 納米?？捎行ЫY(jié)合SARS-CoV-2 S 蛋白，并使溶液C 中的光敏水凝膠固化。

Irgacure 2959 為一種藍(lán)光引發(fā)劑，在波長(zhǎng)為405 nm的藍(lán)光作用下可迅速吸收能量，產(chǎn)生自由基、陽離子等，從而引發(fā)光敏水凝膠固化反應(yīng)。本研究中，疏基-Irgacure 2959 的質(zhì)量為 5～10 mg，且溶液 C 中 GelMA 水凝膠溶液的濃度為5%～30%（m/V）時(shí)，經(jīng)405 nm 波長(zhǎng)的藍(lán)光照射，能在光催化劑的作用下固化。

3 討論

SARS - CoV - 2 的感染過程是由其表面的S 蛋白與宿主細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 相互識(shí)別開啟的［7-8］，S 蛋白是一類三聚體跨膜糖蛋白，在病毒表面形成特殊的花冠結(jié)構(gòu)。SARS-CoV - 2 進(jìn)入易感細(xì)胞，需與S蛋白的受體結(jié)合和蛋白水解的協(xié)同作用，促進(jìn)病毒與細(xì)胞融合。由于S 蛋白暴露于病毒表面，并介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，故可作為SARS-CoV-2 的抗原，是抗病毒藥物、治療性抗體、診斷方法等開發(fā)的關(guān)鍵靶標(biāo)［9-10］。

納米技術(shù)是研究結(jié)構(gòu)尺寸為1～100 nm 范圍內(nèi)材料的性質(zhì)和應(yīng)用的一種技術(shù)，最終目標(biāo)是直接以原子或分子形式構(gòu)造具有特定功能的產(chǎn)品［11-12］。納米顆粒表面可提供偶聯(lián)位點(diǎn)，將能特異性識(shí)別S蛋白的抗體和光引發(fā)劑共同偶聯(lián)于納米顆粒，以納米顆粒為介質(zhì)，可將光敏水凝膠技術(shù)與免疫識(shí)別技術(shù)相結(jié)合。

mPEG-PCL 是一種兩嵌段聚合物，一端為親水鏈段甲氧基聚乙二醇，另一端為親油鏈段聚ε- 己內(nèi)酯，生物相容性和安全性均良好［13］。Mal-PEG-PCL 不僅具有生物可降解性、生物相容性、兩親性，且能在水溶液中自動(dòng)組裝為納米顆粒，還能通過馬來酰亞胺基團(tuán)與抗體進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，是理想的納米藥物功能化載體骨架材料。

S 蛋白抗體可與SARS - CoV - 2 S 蛋白的抗原結(jié)合，從而發(fā)生免疫反應(yīng)［14-15］，使SARS-CoV-2 與S 蛋白抗體- MP - Irgacure 2959 納米粒相連。本研究中制得的S 蛋白抗體 - MP - Irgacure 2959 納米粒能與SARS-CoV-2 S 蛋白有效結(jié)合，使 SARS-CoV-2 牢固連接在納米粒上，且能使光敏水凝膠在接觸帶有SARS-CoV-2的納米粒溶液時(shí)迅速固化。

GelMA 為雙鍵改性明膠，在光引發(fā)劑的作用下，可通過紫外光及可見光交聯(lián)固化成膠。GelMA 光敏水凝膠具有天然和合成生物材料的特征，其三維結(jié)構(gòu)適于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，生物相容性和細(xì)胞反應(yīng)特性良好［16-17］。在405 nm波長(zhǎng)的藍(lán)光作用下，Irgacure 2959可使GelMA光敏水凝膠實(shí)現(xiàn)液態(tài)-固態(tài)的相互轉(zhuǎn)變。

綜上所述，本研究中建立的方法生產(chǎn)成本低，檢測(cè)效率高，易于貯存和運(yùn)輸，對(duì)設(shè)備和操作人員的依賴性低，可用于快速檢測(cè)SARS-CoV-2表面的S蛋白。