馬兜鈴酸減毒與分離方法研究進(jìn)展*

程 玉，余寒優(yōu)，索 芳，任 青，張迎慶

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院制藥工程系，湖北 武漢 430068）

馬兜鈴科植物在《神農(nóng)本草經(jīng)》《雷公炮炙論》《肘后備急方》《婦人大全良方》等文獻(xiàn)中均有記載。其品種有600 多種，分布廣泛，在世界各地有數(shù)百個(gè)品種被用于治療疾病，如馬兜鈴屬在印度用于解蛇毒、緩解關(guān)節(jié)痛和發(fā)熱，在巴西用于止瀉、鎮(zhèn)痛、消炎、抗癌等。我國含馬兜鈴酸的藥材主要包括馬兜鈴科馬兜鈴屬AristolochiaL. 和細(xì)辛屬AsarumL.，如馬兜鈴、天仙藤、朱砂蓮、細(xì)辛、關(guān)木通、青木香、廣防己、尋骨風(fēng)等［1］。馬兜鈴科植物中的馬兜鈴酸具有強(qiáng)烈的致癌性和腎毒性［2-3］，是3，4-次甲二氧基-10-硝基-1-菲酸衍生物，有多種基本組成結(jié)構(gòu)。目前，有明確毒性作用的成分有馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ［4］，其余部分的腎毒性及致癌性差異尚未明確。馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ在體內(nèi)硝基還原酶的作用下，一部分被還原為馬兜鈴內(nèi)酰胺，進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞，經(jīng)長時(shí)間積累而導(dǎo)致毒性；另一部分在還原過程中進(jìn)一步與DNA 作用，形成加合物，直接損傷DNA，最終導(dǎo)致基因突變，產(chǎn)生毒性。流行病學(xué)證據(jù)表明，馬兜鈴酸能與DNA 形成親電加合物，并出現(xiàn)具有突變標(biāo)識特征的堿基對“A∶T →T∶A 顛換突變”，致人體患癌［5-6］。據(jù)國際致癌物評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)馬兜鈴酸為一級致癌物［7］。故各國均限制或禁止銷售和使用含馬兜鈴酸的中藥材和中成藥，我國也取消了關(guān)木通、青木香、廣防己的藥材標(biāo)準(zhǔn)，并對含馬兜鈴、尋骨風(fēng)、天仙藤、朱砂蓮的中藥制劑按處方藥的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行嚴(yán)格管理，并在藥品標(biāo)簽和藥品說明書中增加可引起腎臟損害的安全警示信息。2020 年版《中國藥典（一部）》剔除了天仙藤和馬兜鈴，僅收錄細(xì)辛，規(guī)定藥用部位為根和根莖，并對限度進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定。同時(shí)，提高了相關(guān)中成藥制劑的藥品標(biāo)準(zhǔn)，擬增加馬兜鈴酸限量檢查，近年來關(guān)于馬兜鈴酸減毒的研究日益增多［8-9］。為此，在馬兜鈴酸傳統(tǒng)減毒方法的基礎(chǔ)上，綜述了現(xiàn)代分離純化技術(shù)在馬兜鈴酸的減毒、固相萃取富集分析，以及在不同馬兜鈴酸組分標(biāo)準(zhǔn)品制備中的應(yīng)用與研究進(jìn)展，為含馬兜鈴酸中藥材的合理使用和相關(guān)中成藥的檢測提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 傳統(tǒng)減毒方法

1.1 炮制減毒

炒焦：嚴(yán)建業(yè)等［10］研究了細(xì)辛的不同炮制方法，馬兜鈴酸減毒效果按炒焦> 堿醋制> 鹽制> 堿制> 醋制>米泔水制>甘草制>酒制>蜜制>姜制順序依次降低。其中，炒焦工藝對細(xì)辛中馬兜鈴酸Ⅰ的去除率最高，超過60%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

醋炙：李天鳳等［11］對關(guān)木通進(jìn)行姜炙、醋炙、蜜炙、甘草炙、堿制、炒炙、酒炙，以及堿蜜合制、堿酒合制、堿姜合制，并采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定各炮制品馬兜鈴酸的含量，計(jì)算其脫除率。結(jié)果關(guān)木通醋炙品中馬兜鈴酸含量較低，且其醋炙品水浸出物與醇浸出物的含量均較高。與其他方法相比，醋炙法更穩(wěn)定。

蜜炙：章瑩等［12］分析不同產(chǎn)地馬兜鈴蜜炙后的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)蜜炙后馬兜鈴酸Ⅰ含量降低了36%，且最適蜜炙條件為加蜜量30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蜜 - 水比例為1∶3（V/V），溫度為200 ℃，加熱25 min。

潤洗、陰干：姜思奇等［13］研究了北細(xì)辛飲片的炮制工藝與藥材質(zhì)量間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，北細(xì)辛藥材潤洗5 min、24.6 ℃陰干24 h，或潤洗5 min、25.0～35.0 ℃烘干8 h，均可符合北細(xì)辛飲片要求。綜合考慮后，將北細(xì)辛藥材潤洗48 h，24.6 ℃陰干48 h，馬兜鈴酸Ⅰ的含量由9.87 μg/g 降至7.99 μg/g。故可將其作為北細(xì)辛飲片的減毒工藝。

發(fā)酵：發(fā)酵法通過微生物降解中藥中有毒物質(zhì)，與普通炮制方法相比優(yōu)勢顯著，其工藝條件溫和，無污染。曹藝等［14］采用液體發(fā)酵技術(shù)，以關(guān)木通、青木香、馬兜鈴、尋骨風(fēng)藥材粉末為原料，在黑曲霉、米曲霉等10個(gè)菌種的發(fā)酵降解下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化脫毒。采用超高效液相色譜（UPLC）法測定發(fā)酵前后藥材中馬兜鈴酸Ⅰ的含量，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌可降低藥材中馬兜鈴酸Ⅰ的含量。LIU 等［15］采用高效液相色譜 - 電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜法測定馬兜鈴植物根部與6 種不同藥用真菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵所得發(fā)酵產(chǎn)物中馬兜鈴酸的含量，擬訂色譜條件［色譜柱為C18柱，檢測器為二極管陣列檢測器，溫度為30 ℃，流動相為乙腈（A）-0.2%乙酸（B）］進(jìn)樣測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0～20 min 內(nèi)出現(xiàn)了新的色譜峰，采用柱后分流法進(jìn)行電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI- MS）負(fù)離子模型檢測，推斷出7個(gè)馬兜鈴酸成分。在發(fā)酵過程中，上述7 種化合物含量均減少，說明發(fā)酵可有效減毒。此外，優(yōu)化后的HPLC - MS 法有助于馬兜鈴酸的含量測定。向薇［16］從馬兜鈴根際土壤中獲得33 株純培養(yǎng)菌株，經(jīng)驗(yàn)證，其中11株均對馬兜鈴酸Ⅰ有降解作用，在非優(yōu)化條件下48 h 內(nèi)可最多降解85.36%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的馬兜鈴酸Ⅰ。將獲得的降解菌株用于馬兜鈴酸Ⅰ含量較高的青木香進(jìn)行發(fā)酵炮制，再結(jié)合篩選得到的分子標(biāo)志物進(jìn)行腎毒性評價(jià)，效果較好。

1.2 配伍減毒

單味藥：配伍的單味中藥主要有補(bǔ)益類中藥黃芪、冬蟲夏草、當(dāng)歸、甘草等，活血類中藥丹皮、丹參等，清熱類中藥生地黃、竹葉、黃連等，瀉下類中藥大黃等［17］。馬艷苗等［18］通過RP-HPLC 法考察了關(guān)木通配伍苦寒藥黃連后馬兜鈴酸Ⅰ的含量變化趨勢。結(jié)果顯示，不同比例配伍組中馬兜鈴酸Ⅰ的含量不同，特別是關(guān)木通與黃連配伍比例為1∶1.5（m/m）時(shí)，馬兜鈴酸Ⅰ含量下降了72%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。提示“寒寒相配”的中藥配伍形式有助于降低關(guān)木通中馬兜鈴酸Ⅰ的含量，中藥配伍減毒理論有一定科學(xué)依據(jù)。邵珠瑩等［19］采用超高效液相色譜- 三重四極桿質(zhì)譜串聯(lián)（UPLC - TQD - MS）法探討了關(guān)木通配伍干姜的減毒存效機(jī)制，結(jié)果顯示，關(guān)木通-干姜（1∶2，m/m）配伍組馬兜鈴酸Ⅰ對大鼠急性腎功能的損傷程度顯著低于生品組，且不影響對大鼠的利尿作用。

復(fù)方：汪瀟晗等［20］報(bào)道了復(fù)方（如龍膽瀉肝湯、復(fù)方導(dǎo)赤散）與拆方配伍對關(guān)木通減毒作用的影響，發(fā)現(xiàn)復(fù)方配伍組中馬兜鈴酸溶出量較關(guān)木通單煎組顯著下降。曹小帥等［21］采用中成藥制劑配伍來減毒，如腦靈片由黃精、紅參、鹿茸等11味中藥材組方，有補(bǔ)氣血、養(yǎng)心腎功效，與關(guān)木通共煎后，測得的馬兜鈴酸Ⅰ含量明顯降低。

在傳統(tǒng)中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，中藥配伍可實(shí)現(xiàn)減毒增效。按準(zhǔn)確配伍用量，采用現(xiàn)代炮制技術(shù)能減少其大部分毒性成分，但尚需制訂詳細(xì)的量化指標(biāo)及使用規(guī)范，以指導(dǎo)臨床使用。

2 分離純化方法

2.1 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法是利用超臨界流體提取、分離有效成分的新技術(shù)。超臨界流體的溶解性、滲透性及擴(kuò)散性能均高，黏度低，通過改變壓力或溫度來調(diào)節(jié)其溶解能力，實(shí)現(xiàn)對不同成分高選擇性地提取分離，多用于天然活性物質(zhì)的提取分離［22-24］。LIANG 等［25］評價(jià)了超臨界流體萃取法去除馬兜鈴和關(guān)木通中馬兜鈴酸的可行性，結(jié)果表明，萃取方式和夾帶劑的摩爾分?jǐn)?shù)是影響馬兜鈴酸萃取的主要因素。去除馬兜鈴酸的最適動態(tài)條件為容器壓力194 bar，溫度50 ℃，夾帶劑濃度0.2 摩爾分?jǐn)?shù)，萃取4 h。結(jié)果顯示，馬兜鈴中馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ的去除率分別為65.2%和59.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），關(guān)木通中的去除率分別為81.3%和81.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

2.2 分子印跡法

2.2.1 減毒

分子印跡是一種為獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與特定目標(biāo)分子相匹配的聚合物的技術(shù)，制備的分子印跡聚合物（MIP）對目標(biāo)分子具有特異性和選擇性，廣泛用于中藥研究［26-27］。肖榕［28］采用可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合（RAFT）法制備了馬兜鈴酸分子印跡微球，并對其吸附性能進(jìn)行研究。以馬兜鈴酸Ⅰ為模板分子，丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，二硫代苯甲酸（4-氰基戊酸）酯為鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，二甲基甲酰胺-水溶液（8∶2，m/m）為致孔劑，采用RAFT 技術(shù)制備MIP，其收率為63.42%。所得MIP 對模板馬兜鈴酸Ⅰ具有良好的特異性和選擇性吸附能力，可至少重復(fù)使用6 次。取25.0 mg MIP 可吸附5.0 mL 關(guān)木通乙醇提取物（馬兜鈴酸Ⅰ質(zhì)量濃度為0.001 8 mg/mL），結(jié)果馬兜鈴酸Ⅰ含量降至液相的檢測限（6.47 ng/mL）以下，平均回收率為41.70%。結(jié)果表明MIP 可用于去除天然產(chǎn)物中馬兜鈴酸Ⅰ。

2.2.2 固相萃取富集

固相萃取是常用的樣品分析檢測前處理技術(shù)，通過固體吸附劑吸附液體樣品中的目標(biāo)物質(zhì)，與其他干擾物分離，利用洗脫液或加熱解吸附洗脫，達(dá)到目標(biāo)化合物分離和富集的目的［29］。目前，溶劑萃取-柱色譜分離法為常用的馬兜鈴酸富集檢測方法，需多次抽取、萃取、脫色等，以及柱色譜分離，操作煩瑣，耗時(shí)，成本高，富集效率不高，提取量受限。一般固相萃取材料采用C18柱和C8柱，對強(qiáng)保留雜質(zhì)無法有效去除。MIPs合成的固相萃取材料因識別性能好、富集效率高而受到青睞。分子印跡技術(shù)用于馬兜鈴酸的分析檢測預(yù)處理時(shí)，可從中藥材浸取液中經(jīng)固相萃取富集分離馬兜鈴酸，檢測靈敏度高。

傅強(qiáng)等［30］報(bào)道了從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測微量馬兜鈴酸Ⅰ的方法，首先進(jìn)行硅膠活化，對硅膠表面進(jìn)行氨基化改性，再在硅膠表面合成MIP；將所得MIP 裝柱，以甲醇活化，制備得到分子印跡-固相萃取柱，可用于檢測富集中成藥龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸Ⅰ。該方法操作簡單，且采用偽模板分子氧氟沙星代替馬兜鈴酸Ⅰ，富集過程安全、環(huán)保，結(jié)合容量高，傳質(zhì)速率快，富集效率高。GE 等［31］也報(bào)道，以偽模板分子氧氟沙星代替馬兜鈴酸Ⅰ制備的MIP作為固相萃取吸附劑，從中藥材中分離富集馬兜鈴酸。結(jié)果顯示，馬兜鈴酸Ⅰ富集達(dá)16 倍，其質(zhì)量濃度在0.1～200.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998 7），回收率為64.94%～77.73%，精密度試驗(yàn)的RSD≤0.8%。

GE 等［32］合成了一種混合磁性介孔碳分子印跡聚合物（MMC@MIPs），用于從大鼠尿液樣本中選擇性識別馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ。以氯化膽堿/乙醇基深共晶溶劑和吲哚美辛分別作為洗脫劑和假模板分子，研究了制備材料的形貌、結(jié)構(gòu)和表面基團(tuán)，并篩選MMC@MIPs - MSPE 工藝的最佳條件。結(jié)果表明，該方法回收率較好（86.7%～94.3%），標(biāo)準(zhǔn)偏差較?。?4.85%），在0.5～30 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2為0.991 0～0.996 0）。

LI 等［33］報(bào) 道 了 MIP 功 能 化 的 磁 性 碳 納 米 管（MCNTs）對馬兜鈴酸Ⅰ的去除效果。通過一種簡便、環(huán)保的溶膠-凝膠工藝獲得MCNTs@AAI-MIPs，先用溶劑熱法合成MCNTs，在乙醇和水的作用下，模板分子與功能單體苯三甲氧基硅烷自組裝，以正硅酸四乙酯為交聯(lián)劑，在MCNTs 上涂覆馬兜鈴酸Ⅰ- MIPs 膜，得到MCNTs@馬兜鈴酸Ⅰ-MIPs。結(jié)果表明，印跡納米復(fù)合材料分離速度快（10 s），吸附容量高（18.54 μg/mg），動態(tài)平衡時(shí)間短（15 min），選擇性好，模板分子印跡因子為3.17，可從復(fù)雜的中藥樣品中有效、特異地提取馬兜鈴酸Ⅰ。

陸雅婷等［34］采用表面分子印跡技術(shù)制備了馬兜鈴酸Ⅰ磁性MIPs，載體為經(jīng)過硅殼改性后的Fe3O4，功能單體為甲基丙烯酸，交聯(lián)劑為EGDMA，引發(fā)劑為AIBN，溶劑體系為乙腈-甲醇（3∶1，V/V），且模板分子、功能單體、交聯(lián)劑質(zhì)量比為1∶4∶20，形成表面印跡層，得到對馬兜鈴酸Ⅰ有特異性吸附作用的MIPs，印跡效率可達(dá)3.11，可用于實(shí)際樣品中馬兜鈴酸Ⅰ的富集和分析。

2.3 吸附法

2.3.1 減毒

孫博航等［35］報(bào)道了采用離子交換法從中藥材北細(xì)辛中獲得無毒提取物的制備工藝。北細(xì)辛全草經(jīng)熱水煎煮提取，取濾液，冷卻后調(diào)節(jié)pH 值。采用陽離子、陰離子交換法，可去除北細(xì)辛藥材中具有揮發(fā)性的黃樟醚，以及非揮發(fā)性的馬兜鈴酸、烏頭堿、去甲烏頭堿等有毒成分，能較好地保留有效成分，兼顧性強(qiáng)，工藝簡單，能源消耗低，節(jié)約資源，生產(chǎn)過程清潔無污染。

2.3.2 固相萃取富集

張曉哲等［36］大孔樹脂法富集馬兜鈴酸預(yù)處理，采用自制價(jià)廉的大孔吸附樹脂萃取柱，大孔吸附樹脂填料為HPD-100/Diaion/AB-8，填料裝填體積保持為上樣溶液體積的2～5 倍，以不高于40%甲醇或乙醇溶液除去雜質(zhì)，以70%～100%甲醇或乙醇溶液洗脫富集馬兜鈴酸類化合物，回收率高，穩(wěn)定性好，價(jià)格低廉，更適合微量馬兜鈴酸的富集和高靈敏測定。

FANG 等［37］報(bào)道了一種雙離子液體固定化硅膠多相萃取馬兜鈴酸的方法，可從實(shí)際樣品中分離馬兜鈴酸。結(jié)果顯示，在60 ℃的流動相甲醇 - 水（60∶40，V/V）中，與其他吸附劑相比，IM -BIM@Sil 提取的馬兜鈴酸量最多（16.69 mg/ g）。將該吸附劑用于馬兜鈴酸的多相萃取，經(jīng)過提取8 次，多次洗滌和洗脫，從9 個(gè)真實(shí)樣品中分離到（2.4～70.9）× 10-3mg/ g 馬兜鈴酸，回收率為70.0%～110.6%，RSD為3.5%～9.1%，表明方法準(zhǔn)確性高。

CHEN 等［38］將雙離子液體固定于一種金屬-有機(jī)骨架ZIF-67制備成吸附劑，用于黃藤中馬兜鈴酸Ⅰ固相萃取。吸附模型分析結(jié)果顯示，在25 ℃下120 min內(nèi)，固定化吸附劑的吸附量最高（50.9 mg/g）。固相萃取過程中每1 g 藥材可除去0.02 mg 馬兜鈴酸Ⅰ，回收率為96.2%～100.0%，RSD為3.5%～4.0%。

SHU 等［39］將螺旋碳纖維與殼聚糖雜化材料作為固相萃取吸附劑，用于馬兜鈴酸分析檢測的富集預(yù)處理。利用螺旋碳纖維的超強(qiáng)容量，并在表面修飾殼聚糖，殼聚糖帶有大量氨基和乙酰氨基，在稀酸溶液中易質(zhì)子化并以陽離子形式存在，能與有機(jī)酸通過靜電相互作用形成復(fù)合物，并通過控制pH 實(shí)現(xiàn)選擇性吸附和脫附。殼聚糖改性螺旋碳纖維對馬兜鈴酸Ⅰ結(jié)合能力優(yōu)良（77.72 mg/ g），選擇性高。采用固相萃取結(jié)合HPLC法對藥用植物中馬兜鈴酸Ⅰ進(jìn)行了富集和檢測。馬兜鈴酸Ⅰ的質(zhì)量濃度在0.5～150 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為73.61%～77.73%，RSD<5%。

SHU 等［40］報(bào)道了腺嘌呤修飾的磁性多壁碳納米管用于基于多種相互作用的馬兜鈴酸的選擇性提取。該吸附劑對馬兜鈴酸的吸附量為24.5 μg/mg，建立了富集和檢測中藥中馬兜鈴酸的磁性固相萃取-高效液相色譜法。馬兜鈴酸Ⅰ的回收率為92.7%～97.5%，馬兜鈴酸Ⅱ的回收率為92.6%～99.4%，RSD<4%。

2.4 液液色譜法

為了分離毫克級的不同類型馬兜鈴酸，采用無固相支持的液液色譜技術(shù)，如逆流色譜（CCC）法和離心分配色譜（CPC）法均可適用于分離極性次級代謝產(chǎn)物，無論是在洗脫或pH 區(qū)帶精制和離子交換置換模式下均可進(jìn)行。強(qiáng)離子交換模式離心分配色譜（SIX -CPC）法適用于分離離子化或可離子化的代謝產(chǎn)物，如羥基肉桂酸、迷迭香酸、硫代葡萄糖苷、花青素、皂苷或多肽。SIX-CPC法中交換劑為離子型，在任何pH下均保持正電荷（陽離子交換劑）或負(fù)電荷（陰離子交換劑），陰離子交換劑主要是苯扎氯銨、三辛基甲基氯化銨（Aliquat 336?）等季銨鹽，離子型分析物形成穩(wěn)定的離子對直接捕獲到固定相中。無置換劑的流動相不能洗脫所提取的分析物，加入置換劑時(shí)分析物出現(xiàn)在流動相中。所有分析物沿柱以相同的速率移動，而移動速率取決于置換劑的濃度。SIX-CPC 法會通過不同分析物與交換劑間形成離子對的差異實(shí)現(xiàn)高分辨純化。ABDELGADIR等［41］采用基于強(qiáng)離子交換置換的SIX -CPC 法提取純化了的小苞馬兜鈴（Aristolochia bracteolataLam.）的馬兜鈴酸，一步制備便可分離得到馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲa。方法為采用雙相溶劑系統(tǒng)甲基叔丁基醚-丙酮 -甲醇 - 水（3∶1∶1∶3，V/V/V/V），三辛基甲基氯化銨（Aliquat 336?）為有機(jī)固定相的陰離子交換劑，碘化鈉為水流動相的置換劑。從5 g 小苞馬兜鈴粗提物中分別得到45.5，77.2，35.1 mg馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲa，純度均大于95%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

段文娟等［42］報(bào)道了一種基于pH 區(qū)帶逆流色譜技術(shù)的快速分離純化馬兜鈴酸類化合物的方法，能對關(guān)木通藥材中的馬兜鈴酸類化合物實(shí)現(xiàn)有效分離純化。該方法在普通制備型高速逆流色譜分離純化有機(jī)酸類成分的應(yīng)用基礎(chǔ)上發(fā)展而來，并根據(jù)化合物解離常數(shù)（pKa）大小依次洗脫，尤其適合有機(jī)酸類物質(zhì)的分離。pH區(qū)帶逆流色譜法進(jìn)樣量分離效率均高，分離效果好，雜質(zhì)易收集，可實(shí)現(xiàn)pH 監(jiān)控，待分離組分被高度濃縮。由于馬兜鈴酸類化合物苯環(huán)上連接的基團(tuán)不同，化合物的pKa 也存在一定差異，故可采用pH 區(qū)帶逆流色譜法進(jìn)行富集與分離。具體方法：將關(guān)木通粉碎后使用乙醇加熱回流提取，減壓濃縮得浸膏，加水混旋，使用石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓蒸干得馬兜鈴酸總提取物；采用pH 區(qū)帶逆流色譜進(jìn)行分離與富集，以石油醚-乙酸乙酯 - 正丁醇 - 水體系（5∶5∶1∶6，V/V/V/V）為溶劑分層后在上相固定相和下相流動相中分別加入一定量的三氟乙酸和三乙胺，泵入高速逆流色譜儀后進(jìn)行分離純化，可在10 h內(nèi)一次性制備4個(gè)純度大于95%的馬兜鈴酸組分（馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲa、馬兜鈴酸Ⅳa），制備成本低于現(xiàn)有技術(shù)，操作簡便，效率高，且環(huán)保，明顯優(yōu)于現(xiàn)有硅膠柱色譜法或HPLC法。

3 結(jié)語

具有致癌性和腎毒性的馬兜鈴酸是中藥材的常見成分，在傳統(tǒng)減毒增效方法的基礎(chǔ)上，現(xiàn)代分離純化技術(shù)可達(dá)到減毒增效、富集分離純化的效果。