金卷升板膠囊揮發(fā)性成分氣相色譜-質譜聯(lián)用指紋圖譜研究*

李雅廉 ，于 靜 ，郭智敏 ，王玲嬌 △，李雅潔 ，楊繼章 ，孫國祥

（1. 北京市朝陽區(qū)六里屯社區(qū)衛(wèi)生服務中心，北京 100026； 2. 河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院藥學部，河北 石家莊 050031； 3. 沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110016）

金卷升板方為河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院多年臨床實踐的協(xié)定處方，擬開發(fā)為院內膠囊制劑，主治原發(fā)性免疫性血小板減少癥。其由金銀花、白術、茜草、熟大黃等中藥材組方，富含揮發(fā)性成分，具有解毒散瘀、清熱涼血、止血通絡之功效。方中，金銀花所含β- 谷甾醇可涼血止血［1］，白術所含蒼術酮能增強免疫力［2］，茜草所含反式角鯊烯用于活血通絡［3］，熟大黃所含呋喃醛具有解毒、抗炎作用［4］。方中藥材含有的揮發(fā)性成分超過50%，但目前的研究集中于極性成分［5-6］，尚未見關于其揮發(fā)性成分質量評價的報道。中藥指紋圖譜技術收載于《中國藥典》，近年來基于多方位數(shù)據(jù)處理的數(shù)字化指紋圖譜技術已逐漸被業(yè)內廣泛接受，能評價中藥質量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。本研究中建立了測定金卷升板膠囊中揮發(fā)性成分的氣相色譜- 質譜（GC - MS）指紋圖譜，并對指紋圖譜中的共有峰進行化學指認，為其質量標準改進和后續(xù)的藥效學研究提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TRACE DSQ型GC-MS儀（美國熱電公司）；Sartorius BS 110S 型分析天平（賽多利斯科學儀器<北京>有限公司，精度為萬分之一）；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為400 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

金卷升板膠囊（河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院院內制劑，批號分別為 150601，150518，150419，150407，080115，080302，080403，080505，080506，080709，180725，180923，規(guī)格為每粒0.5 g）；金銀花（批號為180801CP193），白術（批號為180201CP270），地錦草（批號為180701CP383），卷柏（批號為180101CP404），茜草（批號為180601CP608），山藥（批號為180802CP016），水牛角（批號為180101CP493），均購自河北萬修藥業(yè)有限公司；黃芩（批號為20170302），熟大黃（批號為20170502），均購自河北新祁中藥顆粒飲片有限公司；紫草（國藥樂仁堂河北藥業(yè)有限公司，批號為17041501）。上述藥材均經(jīng)河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院張振杰主管中藥師鑒定為正品，均符合2020 年版《中國藥典（一部）》的藥用標準。

2 方法與結果

2.1 氣相色譜（GC）與質譜（MS）條件

GC條件：色譜柱為DB-5毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為高純度氦（純度 ≥99.999%）；流速為1.0 mL/ min；進樣口溫度為250 ℃；進樣量為0.5 μL；程序升溫（起始溫度為60 ℃，以10 ℃/min 的速率升至150 ℃，以2 ℃ /min 的速率升至210 ℃，保持10 min；以10 ℃ / min 的速率升至280 ℃，保持 9 min）；分流進樣，分流比為5∶1。

MS條件：電離方式為電子轟擊離子源，轟擊能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；傳輸線溫度為250 ℃；檢測器溫度為300 ℃；溶劑延遲時間為4 min；質荷比為（m/z）為55～550。

2.2 供試品溶液制備

取樣品，研磨，取粉末6 g，精密稱定，加入15 mL 石油醚，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）20 min，離心5 min，取上清液，加入15 mL 石油醚，超聲20 min，離心5 min，取上清液，濃縮至1 mL，過濾，取濾液，即得。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取樣品內容物（批號為150518）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下試驗條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄各指紋峰相對保留時間和峰面積。結果各指紋峰相對保留時間的RSD<2.08%（n=6），相對峰面積的RSD<2.84%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品內容物（批號為150518）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，16，24 h 時按2.1 項下試驗條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄各指紋峰相對保留時間和峰面積。結果各指紋峰相對保留時間的RSD<2.94%（n=8），相對峰面積的RSD<3.07%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取樣品內容物（批號為150518）適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄各指紋峰相對保留時間和相對峰面積。結果各指紋峰相對保留時間的RSD< 1.91%（n=6），相對峰面積的RSD<3.41%（n=6），表明方法重復性良好。

2.4 GC-MS 指紋圖譜建立及共有峰指認

2.4.1 特征圖譜建立和相似度評價

取12 批樣品適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下試驗條件分別進樣測定，記錄色譜圖。其中22 號峰在各批樣品的指紋圖譜中分離度均良好，響應值較高，峰面積較大，為12 批樣品共有，故定義為參照峰。按出峰率100%計算，共確定52 個共有指紋峰。將譜圖積分結果導入中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0 軟件［7］，經(jīng)校正，以平均值法生成對照指紋圖譜（圖1）。對12 批樣品及對照指紋圖譜進行擬合，得到GC - MS 疊加指紋圖譜（圖2）。

圖1 金卷升板膠囊氣相色譜-質譜對照指紋圖譜Fig.1 GC-MS reference fingerprints of Jinjuan Shengban Capsules

圖2 12批金卷升板膠囊氣相色譜-質譜疊加指紋圖譜Fig.2 GC-MS superimposed fingerprints of 12 batches of Jinjuan Shengban Capsules

從樣品的指紋圖譜整體出發(fā)，用Sm表示樣品中化學指紋的數(shù)量和分布比例，用Pm表示樣品圖譜的整體含量，用α表示樣品的指紋變異范圍［8-9］。以金卷升板膠囊的參照峰為標準，分別計算12批樣品的Sm，Pm，α（表1）。結果除S12 外，其余11 批樣品的Sm≥ 0.90，表明各批樣品中成分數(shù)量和分布比例相似；各批樣品的Pm差異較大，S1 的Pm< 90%，S10 的Pm> 110%，其余批次樣品的Pm為90%～110%，表明各批樣品的含量有差異，而差異過大或過小均會影響藥品質量；參考系統(tǒng)指紋定量法評價等級結果，S5，S6，S9，S11的質量極好，S2，S3，S4，S7，S8的質量很好，S1和S10的質量好，S12的質量中等。

表1 12批金卷升板膠囊質量評價結果Tab.1 Quality evaluation results of 12 batches of Jinjuan Shengban Capsules

2.4.2 共有峰指認及藥味歸屬分析

根據(jù)12 批樣品GC-MS 指紋圖譜共有峰的保留時間，自動檢索美國國家標準與技術研究院（NIST）標準質譜數(shù)據(jù)庫，并與文獻［10-13］對比，對譜圖中的52個共有峰進行鑒定，最終對其中的46個峰進行了指認，并進行分析和藥味歸屬，發(fā)現(xiàn)其化學成分主要包括γ-欖香烯（10.91%）、反式角鯊烯（13.93%）、柏木醇（18.62%）、葉綠醇（13.55%）等，詳見表2。可見，制劑中的揮發(fā)性組分多源于金銀花、白術、茜草、大黃、地錦草、黃芩、紫草、卷柏等藥材（占制劑藥材配比的80%），證實了對揮發(fā)性成分的研究可對金卷升板膠囊的整體質量控制提供參考。

表2 12批金卷升板膠囊指紋圖譜共有峰鑒定結果Tab.2 Identification results of the common peaks of 12 batches of Jinjuan Shengban Capsules

3 討論

本研究中為了使指紋圖譜的樣品信息最大化，更好地反映其揮發(fā)性成分，在供試品溶液制備過程中，考察了石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基亞砜等溶劑對提取結果的影響，結果以石油醚為溶劑時得到色譜圖的色譜峰最多，干擾成分最少，故選擇石油醚作為提取溶劑?？疾炝瞬煌瑯O性的氣相色譜柱（安捷倫HP-5，DB-5，DB-17 毛細管色譜柱），通過優(yōu)化程序升溫條件，比較各譜圖的色譜峰數(shù)量及分離度，結果采用DB-5色譜柱所得色譜圖的色譜峰數(shù)量最多，響應值最高，各組分間的分離度最好，故選擇DB-5色譜柱進行分析。

中藥指紋圖譜技術作為一種簡便、穩(wěn)定、可靠的中藥質控方法，在藥效成分或活性成分未明確前運用指紋圖譜技術進行中成藥的質量評價，較傳統(tǒng)的單一成分或指標性成分評價更具整體性和全面性［14-15］。本研究中采用中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0軟件進行共有峰指認，采用系統(tǒng)指紋定量法進行評價，不僅可代替國家藥典委員會的中藥指紋軟件定性評價中藥質量（國家藥典委軟件不能解析質譜數(shù)據(jù)），且將各批樣品指紋中的大峰和小峰進行多維度統(tǒng)一化管理，使生成的對照指紋圖譜穩(wěn)定、可靠，進而定量反映金卷升板膠囊的指紋數(shù)量、所占比例和確切含量，彌補了國家藥典委員會軟件受指紋大峰影響嚴重、對指紋小峰突出、有可能為活性成分而不能準確判斷的缺點，從而精準、有效地評價質量。

根據(jù)藥味歸屬及共有峰指認結果，發(fā)現(xiàn)金卷升板膠囊的GC-MS 指紋圖譜能反映樣品中金銀花、白術、茜草、熟大黃、紫草、黃芩等藥材的成分，且多數(shù)具有生物學活性。通過GC-MS指紋圖譜技術控制上述化學成分所占比例，不僅可有效評價金卷升板膠囊的質量，也為后續(xù)其揮發(fā)性成分的提取提供了數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，本研究中建立的金卷升板膠囊的GC-MS指紋圖譜法操作簡便、可行，穩(wěn)定性良好，可用于檢測該制劑的揮發(fā)性成分，全面控制其質量，也為后續(xù)基于多組分的藥理學機制研究提供了依據(jù)。