木蝴蝶總黃酮提取工藝優(yōu)選*

嚴緒華 ，梅 凌 ，方振峰

（1. 湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院綜合藥學部，湖北 武漢 430010； 2. 江漢大學醫(yī)學院藥學系，湖北 武漢 430056）

木蝴蝶為紫葳科木蝴蝶屬植物木蝴蝶Oroxylum indicum（L.）Vent 的干燥成熟種子，其果實一般在秋、冬季采收［1］，主要分布于我國福建、臺灣、廣東、廣西、四川、貴州、云南等地［2］。其最早記載于《滇南本草》，原名千張紙，《本草綱目拾遺》中開始用木蝴蝶名，沿用至今［3］。木蝴蝶具有清肺利咽、疏肝和胃功效，常用于治療肺熱咳嗽、喉痹、音?。?］、肝胃氣痛等癥［5］，具有抗炎、止咳等作用的主要成分為黃酮類化合物［3，6］。目前，從木蝴蝶中分離得到白楊素、黃芩素、黃芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、槲皮素等60 多個黃酮化合物［6］，其抗腫瘤作用較好［7-10］。目前，木蝴蝶總黃酮的提取方法有超聲浸漬法、回流提取法等［11-15］，但其方法學研究均不完整。木蝴蝶B 是中藥木蝴蝶的特征性成分，2020 年版《中國藥典（一部）》規(guī)定，以木蝴蝶B含量作為評價中藥木蝴蝶質(zhì)量的指標。為此，本研究中以木蝴蝶苷B 為對照品，篩選了提取木蝴蝶總黃酮的最優(yōu)工藝，并進行了驗證，為其提取工藝的開發(fā)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1780 型雙光束紫外-可見分光光度計（島津儀器<蘇州>有限公司）；島津AUX120型分析天平（島津儀器有限公司，精度為0.01 mg）；ME104E 型電子天平（梅特勒- 托利多儀器< 上海> 有限公司，精度為0.000 1 g）；KM - 500DE 型超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；HH.S型電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫(yī)療機械廠）；FW-100型高速萬能粉碎機（天津市華鑫儀器廠）。

1.2 試藥

木蝴蝶苷B 標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號為B20881，純度不低于98%）；95%乙醇、甲醇、硝酸鋁［Al（NO3）3］、亞硝酸鈉（NaNO2）均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（NaOH，分析純，上海沃凱生物技術(shù)有限公司）；水為實驗室自制超純水；木蝴蝶（批號為20190912），產(chǎn)地云南，購自亳州中藥材市場，經(jīng)江漢大學張濤教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 木蝴蝶苷B 含量測定

2.1.1 溶液制備

取木蝴蝶苷B 標準品2 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，用甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為0.203 0 mg/mL的木蝴蝶苷B對照品溶液。取木蝴蝶粉末3.0 g，精密稱定，用75%乙醇溶液60 mL回流提取2 h，趁熱抽濾，將濾液蒸干，用適量甲醇超聲（功率為500 W，頻率為40 kHz）使溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。精密量取對照品溶液、供試品溶液、蒸餾水各適量，分別置10 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，再加入 10%Al（NO3）3溶液 0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加入4% NaOH 溶液4 mL，用甲醇定容，搖勻，靜置15 min［16］，即得對照品顯色溶劑、供試品顯色溶劑和空白顯色溶劑。

2.1.2 方法學考察

線性關(guān)系考察：精密吸取木蝴蝶苷B 對照品溶液25，50，250，500，1 000，2 000 μL，分別置10 mL 容量瓶中，分別按2.1.1 項下方法制備顯色溶劑，得系列質(zhì)量濃度的標準品溶液。以空白顯色溶劑為空白溶液，分別在387 nm 波長處測定紫外吸光度，以對照品溶液質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=0.012 8C+0.000 4，r=0.999 6（n= 6）。結(jié)果表明，木蝴蝶苷B 質(zhì)量濃度在0.50～40.00 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

檢測限和定量限確定：在387 nm 波長處連續(xù)測定空白顯色溶劑6次，記錄吸光度，得平均吸光度值，即噪音。取對照品溶液按2.1.1 項下方法制備顯色溶劑，稀釋成不同質(zhì)量濃度進行吸光度測定，扣除空白，以3倍信噪比的質(zhì)量濃度為檢測限，得到檢測限為4.22 μg/L；以10 倍信噪比的質(zhì)量濃度為定量限，得到定量限為13.11 μg/L。

日內(nèi)精密度與日間精密度試驗：精密吸取對照品溶液0.5 mL，置100 mL 容量瓶中，按2.1.1 項下方法制備顯色溶劑，于387 nm 波長處測定6 次，記錄吸光度；連續(xù)測定3 d，每天2 次，記錄吸光度。結(jié)果木蝴蝶苷B吸光度的RSD分別為0.17%和0.29%（n= 6），表明儀器的日內(nèi)和日間精密度均良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為20190912）樣品粉末3 g，精密稱定，共6份，按2.1.1項下方法制備供試品溶液和顯色溶劑，于387 nm 波長處測定吸光度。結(jié)果吸光度的RSD為0.52%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取重復(fù)性試驗項下供試品溶液0.25 mL，置50 mL 容量瓶中，按2.1.1 項下方法制備顯色溶劑，分別于0，1，6，24，36，48 h 時在387 nm 波長處測定吸光度。結(jié)果吸光度的RSD為0.79%（n=6），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取樣品粉末3 g，共9 份，精密稱定，分別按樣品含量的80%，100%，120%加入標準品，按2.1.1項下方法制備供試品溶液和顯色溶劑，于387 nm波長處測定吸光度，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 木蝴蝶苷B加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of recovery test of Oroxin B（n=9）

2.2 木蝴蝶總黃酮提取工藝優(yōu)選

2.2.1 提取方法

回流提取法：取木蝴蝶粉末3.0 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，加入75%乙醇溶液60 mL，連接冷凝回流裝置，80 ℃回流提取2 h，抽濾，將濾液蒸干，用甲醇少量、多次潤洗，轉(zhuǎn)移溶液，置50 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，部分過濾，取續(xù)濾液0.05 mL，置10 mL容量瓶中，按2.1.1 項下方法制備顯色溶劑，于387 nm波長處測定吸光度3次。結(jié)果木蝴蝶總黃酮的平均含量為2.14 mg/g，RSD為0.27%（n=3）。

超聲提取法：取木蝴蝶藥材3.0 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，加入75%乙醇溶液60 mL，于40 ℃超聲（功率為500 W，頻率為40 kHz）萃取30 min，抽濾，將濾液蒸干，用甲醇少量、多次潤洗，轉(zhuǎn)移溶液，置50 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，部分過濾，取續(xù)濾液0.05 mL，置10 mL 容量瓶中，按2.1.1 項下方法制備顯色溶劑，于387 nm 波長處測定吸光度3 次。結(jié)果木蝴蝶總黃酮的平均含量為1.73 mg/g，RSD為0.58%（n=3）。

煎煮法：取木蝴蝶粉末3.0 g，精密稱定，置100 mL燒杯中，加入蒸餾水60 mL，煮沸30 min，抽濾，將濾液蒸干，用甲醇少量、多次潤洗，轉(zhuǎn)移溶液，置50 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，部分過濾，取續(xù)濾液0.05 mL，置10 mL 容量瓶中，按2.1.1 項下方法制備顯色溶劑，于387 nm 波長處測定吸光度3 次。結(jié)果木蝴蝶總黃酮的平均含量為0.73 mg/g，RSD為0.22%（n=3）。

單因素ANOVO 方差分析結(jié)果：采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件對3 種提取方法所得總黃酮含量進行單因素ANOVO 方差分析，結(jié)果見表2。不同方法測得的總黃酮含量的數(shù)值均滿足方差齊性的前提條件（P=0.243 ＞0.05）。結(jié)果表明，不同提取方法得到的總黃酮含量差異顯著。故木蝴蝶總黃酮最優(yōu)提取方法選擇回流提取法。

表2 提取方法影響總黃酮含量的單因素方差分析結(jié)果Tab.2 Results of single-factor ANOVA of extraction methods affecting the content of total flavonoids

2.2.2 提取溶劑種類

取木蝴蝶粉末3.0 g，共3份，精密稱定，分別置100 mL圓底燒瓶中，分別加入60 mL 蒸餾水、乙醇、甲醇，按2.1.1項下方法制備供試品溶液和顯色溶劑，以387 nm波長處測定吸光度，計算木蝴蝶總黃酮的含量。結(jié)果見圖1。在測得的總黃酮含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P= 0.464 ＞0.05）下，進行提取溶劑影響木蝴蝶總黃酮含量的單因素ANOVA 統(tǒng)計分析，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，不同提取溶劑對總黃酮含量的影響顯著。由圖1可知，總黃酮含量最高時所用溶劑為乙醇，故以乙醇作為木蝴蝶總黃酮的提取溶劑。

表3 提取溶劑影響木蝴蝶總黃酮含量的單因素方差分析結(jié)果Tab.3 Results of single-factor ANOVA of extraction solvent affecting the content of total flavonoids in Oroxyli Semen

圖1 提取溶劑種類考察Fig.1 Investigation results of the types of extraction solvent

2.2.3 提取溶劑體積分數(shù)

取木蝴蝶粉末3.0 g，共5份，精密稱定，分別置100 mL圓底燒瓶中，分別加入60 mL 20%，40%，60%，75%，95%乙醇，按2.1.1項下方法制備供試品溶液和顯色溶劑，于387 nm 波長處測定吸光度，計算木蝴蝶的總黃酮含量。結(jié)果見圖2。同時，在測得總黃酮含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P= 0.893 ＞0.05）下，進行乙醇體積分數(shù)影響木蝴蝶總黃酮含量的單因素ANOVA 分析和兩兩間多重比較LSD檢驗。結(jié)果見表4和表5。結(jié)果表明，乙醇體積分數(shù)對總黃酮含量的影響顯著，且各濃度下所得總黃酮含量差異顯著（P< 0.001）。由圖2 可知，總黃酮含量在75%乙醇體積分數(shù)時最大，故75%為木蝴蝶總黃酮的最佳提取溶劑體積分數(shù)。

表4 乙醇體積分數(shù)影響木蝴蝶總黃酮含量的單因素方差分析結(jié)果Tab.4 Results of single-factor ANOVA of the ethanol volume fraction affecting the content of total flavonoids in Oroxyli Semen

表5 不同乙醇體積分數(shù)組間多重比較LSD檢驗結(jié)果Tab.5 Results of the LSD test for multiple comparisons among groups with different ethanol volume fraction

圖2 提取溶劑濃度考察Fig.2 Investigation results of extraction solvent concentration

2.2.4 提取溫度

取木蝴蝶粉末3.0 g，共6份，精密稱定，分別置100 mL圓底燒瓶中，分別加入75%乙醇60 mL，分別于40，50，60，70，80，90 ℃下回流，按2.1.1 項下方法制備供試品溶液和顯色溶劑，于387 nm 波長處測定吸光度，計算木蝴蝶總黃酮的含量。結(jié)果見圖3。同時，在測得的總黃酮含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P=0.549 ＞0.05）下，進行提取溫度影響木蝴蝶總黃酮含量的單因素ANOVA 分析和兩兩間多重比較LSD 檢驗。結(jié)果見表6和表7?？芍?，隨著溫度不斷升高，黃酮的含量呈現(xiàn)先升高后下降最后又升高的趨勢，在60 ℃時達到最高值；不同提取溫度對總黃酮含量的影響非常顯著；60 ℃與50 ℃時所得總黃酮含量差異顯著（P< 0.05），60 ℃與70 ℃時所得總黃酮含量差異極顯著（P< 0.001）。故選擇60 ℃為木蝴蝶總黃酮的最佳提取溫度。

圖3 提取溫度考察Fig.3 Investigation results of extraction temperatures

表6 提取溫度影響木蝴蝶總黃酮含量的單因素方差分析結(jié)果Tab.6 Results of single factor ANOVA of the extraction temperatures affecting the content of total flavonoids in Oroxyli Semen

表7 不同提取溫度組間多重比較LSD檢驗結(jié)果Tab.7 Results of the LSD test for multiple comparisons among groups with different extraction temperatures

2.2.5 提取時間

取木蝴蝶粉末3.0 g，共5 份，精密稱定，分別置于100 mL 圓底燒瓶中，分別回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 h，按2.1.1 項下方法制備供試品溶液和顯色溶劑，于387 nm 波長處測定吸光度，計算木蝴蝶總黃酮的含量。結(jié)果見圖4。同時，在測得總黃酮含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P= 0.096 ＞0.05）下，進行提取時間影響木蝴蝶總黃酮含量的單因素ANOVA 分析和兩兩間多重比較LSD 檢驗。結(jié)果見表8 和表9。可知，總黃酮含量在提取3 h 達到最高，與提取1.5 h 時的含量相近；不同提取時間對總黃酮含量的影響非常顯著；提取1.5 h 和3.0 h與其他提取時間所得總黃酮含量顯著差異（P<0.001），而提取 1.5 h 和 3.0 h 所得總黃酮含量無顯著差異（P= 0.147 ＞0.05）?？紤]到工業(yè)化生產(chǎn)的能耗，故選擇1.5 h 為木蝴蝶總黃酮的最佳提取時間。

表8 提取時間影響木蝴蝶總黃酮含量的單因素方差分析結(jié)果Tab.8 Results of single-factor ANOVA of the extraction time affecting the content of total flavonoids in Oroxyli Semen

表9 不同提取時間組間多重比較LSD檢驗結(jié)果Tab.9 Results of the LSD test for multiple comparisons among groups with different extraction time

圖4 提取時間考察Fig.4 Investigation results of extraction time

2.2.6 料液比

取木蝴蝶粉末3.0 g，共5 份，精密稱定，分別置合適的圓底燒瓶中，分別加入1∶10，1∶15，1∶20，1∶30，1∶40（m/V）的75%乙醇，按2.1.1項下方法制備供試品溶液和顯色溶劑，于387 nm 波長處測定吸光度，計算木蝴蝶總黃酮的含量。結(jié)果見圖5。同時，在測得總黃酮含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P=0.622 ＞0.05）下，進行了料液比影響木蝴蝶總黃酮含量的單因素ANOVA 分析和兩兩間多重比較LSD 檢驗。結(jié)果見表10和表11?？芍S著料液比的增大，木蝴蝶總黃酮的含量先增大后減小，料液比為1∶20（m/V）時，總黃酮含量最大；不同料液比對總黃酮含量的影響非常顯著；料液比為1∶20（m/V）時和其他料液比所得總黃酮含量有極顯著差異（P<0.001）。故選擇1∶20（m/V）為木蝴蝶總黃酮提取的最佳料液比。

表10 液料比影響木蝴蝶總黃酮含量的單因素方差分析結(jié)果Tab.10 Results of single-factor ANOVA of the solid / liquid ratios affecting the content of total flavonoids in Oroxyli Semen

表11 不同料液比組間多重比較LSD檢驗結(jié)果Tab.11 Results of the LSD test for multiple comparisons among groups with different solid / liquid ratios

圖5 料液比考察Fig.5 Investigation results of solid / liquid ratios

2.3 驗證試驗

取木蝴蝶粉末3.0 g，共3份，精密稱定，以2.2項下優(yōu)選的提取工藝條件，按2.1.1項下方法制備供試品溶液和顯色溶劑，于387 nm 波長處測定吸光度，并計算木蝴蝶總黃酮的含量。結(jié)果木蝴蝶總黃酮含量的平均值為2.23 mg/ g，RSD為1.49%（n= 3），表明優(yōu)選的提取工藝合理。

3 討論

提取方法選擇：木蝴蝶總黃酮包括苷及其苷元，苷元在水中的溶解度差，在乙醇中的溶解度好，而黃酮苷在水中和乙醇中溶解度均較好。煎煮法雖然遵循古法，但由于水中黃酮苷元的溶解性較差，故煎煮法所得總黃酮的含量最低。超聲提取法是利用超聲波的空化效應(yīng)和震蕩力［17］，破壞植物細胞壁，使溶劑充分深入到細胞中，從而達到較好的提取效果，操作簡單，提取時間短［18-19］，但提取率偏低?；亓魈崛》m然耗時，操作相對煩瑣，但提取率高。

溶劑種類選擇：甲醇和乙醇，能溶解大部分化合物，但甲醇的價格通常比乙醇貴，乙醇還具有一定增溶作用。因此，在大部分試驗中，尤其是工業(yè)化生產(chǎn)，優(yōu)先選擇乙醇作溶劑。本研究中采用甲醇、乙醇和水3 種不同溶劑進行提取，結(jié)果以乙醇為溶劑時，木蝴蝶中總黃酮的含量最高，故優(yōu)先選用乙醇為溶劑。

溶劑體積分數(shù)選擇：黃酮類化合物中通常存在多個酚羥基或糖，總黃酮的極性也會相應(yīng)變大，要使總黃酮溶出，用極性稍大的溶劑效果會更好。由單因素試驗結(jié)果可知，當乙醇體積分數(shù)小、極性很大時，總黃酮含量較低；當乙醇體積分數(shù)為75%時，木蝴蝶中總黃酮溶出最多，含量最高；當乙醇體積分數(shù)增大到95%時，溶劑極性變小，木蝴蝶中極性小的物質(zhì)更易溶出，總黃酮含量相應(yīng)變小。

提取溫度選擇：單因素試驗中，隨著溫度的升高，提取所得總黃酮含量先升高，在60 ℃到達頂點后顯著下降，在80 ℃時最低，之后又略有升高。分析原因，可能是因為低于60 ℃時，隨著溫度升高加快了黃酮類成分的擴散速度，有助于溶質(zhì)擴散，超過60 ℃時黃酮中酚羥基在高溫下易被氧化［20］，導(dǎo)致總黃酮被破壞，含量明顯下降。

提取時間選擇：單因素試驗中，提取0.5 h 時總黃酮含量較高，隨后下降，然后升高，接著又下降、升高，呈波浪變化。分析原因，可能是在提取0.5 h 前，提取溶劑的黏度較低，質(zhì)點傳質(zhì)效果好，擴散系數(shù)也較大［20］，有利于總黃酮在乙醇中溶解度的增加，含量較高，之后黏度增大，溶出變慢，含量下降，隨著黃酮苷類成分的大量溶出和苷元類部分溶出，總黃酮含量也隨之增加，在提取1.5 h 時達到峰值，之后色素和雜質(zhì)的溶出量增加，總黃酮含量降低，但隨著時間的延長，黃酮類成分溶解更多，含量逐漸增加。

料液比選擇：單因素試驗中，隨著提取溶劑體積的增大，提取所得總黃酮的含量先升高，后降低。分析其原因，可能是由于隨著溶劑體積的不斷增加，木蝴蝶粉末與溶劑的接觸面積會不斷增大，使木蝴蝶中總黃酮成分更易溶出［21］。當料液比為1∶20（m/V）時，木蝴蝶中黃酮類成分基本溶出，繼續(xù)增加溶劑體積，不會明顯增加總黃酮的溶出量，相反會使色素和雜質(zhì)的溶出量增加，降低總黃酮含量。

綜上所述，所建立的方法操作簡單，結(jié)果可靠，數(shù)據(jù)準確，可為木蝴蝶中黃酮類化合物的進一步開發(fā)和利用提供參考。