腫瘤患者ABCG1 和USF1 基因多態(tài)性與紫杉醇不良反應(yīng)相關(guān)性研究*

李 超 ，李安娜 ，張童童 ，李 巍 ，許志玲 ，孟 珺 △

（1. 國家癌癥中心·國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心·中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518116； 2. 廣東省深圳市第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518112）

紫杉醇是從紅豆杉類植物中分離提取到的天然三環(huán)二萜生物堿類化合物，能使微管蛋白和組成微管的微管蛋白二聚體失去動(dòng)態(tài)平衡，抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，并觸發(fā)細(xì)胞凋亡，從而有效阻止腫瘤細(xì)胞增殖，為臨床常用抗腫瘤藥物，已廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌等［1-4］。與其他抗腫瘤藥物相似，紫杉醇具有治療窗窄、毒副作用大的特點(diǎn)，其藥品不良反應(yīng)（ADR）主要表現(xiàn)為血液學(xué)毒性、過敏反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)、肝臟毒性、外周神經(jīng)毒性、脫發(fā)等［5-6］，且存在較大的個(gè)體差異［7］，可能與藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因多態(tài)性相關(guān)［8］。目前認(rèn)為，紫杉醇的代謝為有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OATP）1B1/ 3 將血液循環(huán)中的紫杉醇攝取進(jìn)入肝細(xì)胞，肝細(xì)胞中的紫杉醇通過細(xì)胞色素（CYP）3A4/ 5 酶 先 代 謝 為 3′ - P - 羥 基 紫 杉 醇 ，繼 而 被CYP2C8 酶代謝為6α-3′-P- 雙羥基紫杉醇；或通過CYP2C8 酶先代謝為6α-羥基紫杉醇，再由CYP3A4/5酶代謝為6α-3′-P-雙羥基紫杉醇。紫杉醇原形及代謝物主要通過三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，主要經(jīng)糞便排泄，少部分通過尿液排泄，一部分經(jīng)腸肝循環(huán)再次回到體循環(huán)。相關(guān)關(guān)鍵代謝酶如 CYP3A4，CYP2C8，CYP3A5 等，以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCB1，ABCC1，ABCC2，ABCG2 及多藥耐藥相關(guān)蛋白，P-糖蛋白等基因多態(tài)性是引起紫杉醇療效和ADR 個(gè)體差異的重要因素［9-11］。但藥物代謝基因網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，上述藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體基因多態(tài)性尚不能完全解釋紫杉醇ADR 個(gè)體差異性的原因。為此，本研究中檢測了以紫杉醇為基礎(chǔ)化學(xué)治療（簡稱化療）方案的96例患者的基因多態(tài)性，收集并統(tǒng)計(jì)ADR，分析基因多態(tài)性與ADR 的相關(guān)性，為制訂紫杉醇的個(gè)體化用藥方案提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診；病歷和隨訪資料完整；化療方案中含有紫杉醇；血常規(guī)、肝腎功能、心功能正常，預(yù)計(jì)生存期超過12 周。本研究方案獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病；妊娠期或哺乳期；試驗(yàn)前存在干擾研究的ADR。

病例選擇與分組：選取中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院2018年1月至12月收治的腫瘤患者96例，其中乳腺癌1例，卵巢癌58 例，肺癌32例，食管癌5例；中位年齡56歲；男32例，女64例。

1.2 治療方案與ADR 判斷標(biāo)準(zhǔn)

患者的化療方案均為紫杉醇+卡鉑/順鉑，紫杉醇的給藥劑量為150～175 mg/ m2，連續(xù)3 h 靜脈滴注給藥，每21 d為1個(gè)周期。ADR的評(píng)估參照《常見不良反應(yīng)事件評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)4.0版》（CTCAE 4.0）。

1.3 基因檢測

患者化療前取外周血2 mL，EDTA - 2Na 抗凝，備用。按試劑盒（德國Qiagen公司）說明書提取DNA。采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）基因分型法檢測基因多態(tài)性。首先，進(jìn)行TOF-MS擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。PCR 反應(yīng)體系為5 μL，包括DNA 模板5～50 ng，dNTPs 200 μmol/L，10 × PCR 緩沖液0.5 μL，不同反應(yīng)孔多重正、反向擴(kuò)增引物2 μL（每條引物終濃度為200 nmol/L），熱啟動(dòng)Taq 酶1 U。PCR反應(yīng)條件為，94 ℃預(yù)變性5 min，按94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s 循環(huán) 40 次，72 ℃延伸 5 min。延伸產(chǎn)物純化后，加入384 孔檢測芯片（SpectroCHIP），采用MALDI -TOF MS儀進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。基因型分布遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)使用Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)；不同位點(diǎn)的基因型分布及其與腫瘤化療ADR 以率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)或Fisher′s exact test 檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因分布情況

選擇并檢測以下10個(gè)基因：CYP3A4（rs2242480 C>T）、ABCG1（rs1541290 G>A）、CYP2C8（rs11572080 C>A）、ABCC3（rs1051640 A>G）、SLC22A14（rs4679028 G>A）、CYP8B1（rs735320 C > T）、GSTM3（rs7483 C > T）、CYP2C8（rs10509681 T>C），以及上游轉(zhuǎn)錄因子（USF）1（rs2516839 C > T）、USF1（rs3737787 G > A）。CYP2C8（rs11572080 C>A）、CYP8B1（rs735320 C>T）、CYP2C8（rs10509681 T > C）基因均未發(fā)生突變，為野生型。除USF1（rs3737787 G > A）和 GSTM3（rs7483 C > T）基因外，其余均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P>0.05）?；蛐头植技邦l率見表1。

表1 基因型分布及頻率（n=96）Tab.1 Distribution and frequency of genotype（n=96）

2.2 基因多態(tài)性與紫杉醇ADR 的關(guān)系

ABCG1（rs1541290 G > A）：GG 型、GA 型、AA 型患者發(fā)生3～4 級(jí)中性粒細(xì)胞減少的概率分別為42.86%（6/14），29.09%（16/55），59.26%（16/27），組間差異顯著（P<0.05）。與GA 型比較，AA 型患者發(fā)生 3～4 級(jí)中性粒細(xì)胞減少的概率顯著升高（P<0.05）。詳見表2。

表2 ABCG1（rs1541290 G ＞A）基因多態(tài)性與紫杉醇ADR的關(guān)系Tab.2 Relationship between ABCG1（rs1541290 G ＞A）gene polymorphism and ADR of paclitaxel

USF1（rs2516839 C>T）：CC 型、CT 型、TT 型患者發(fā)生3～4 級(jí)血紅蛋白減少的概率分別為19.15%（9/47）、39.02%（16/41）、0（0/8），組間比較差異顯著（P<0.05）；CC 型、CT 型、TT 型患者發(fā)生 3～4 級(jí)中性粒細(xì)胞減少的概率 分 別為 27.66%（13/ 47）、48.78%（20/ 41）、12.50%（1/8），組間比較差異顯著（P<0.05）。與CC型和CT型比較，TT型患者發(fā)生3～4級(jí)血紅蛋白減少的概率均顯著降低（P<0.05）；與CT型比較，TT型患者發(fā)生3～4級(jí)中性粒細(xì)胞減少的概率顯著降低（P<0.05）。詳見表3。

表3 USF1（rs2516839 C ＞T）基因多態(tài)性與紫杉醇ADR的關(guān)系Tab.3 Relationship between USF1（rs2516839 C ＞ T）gene polymorphism and ADR of paclitaxel

3 討論

本研究中檢測了10個(gè)基因的多態(tài)性，其中CYP3A4（rs2242480 C > T）、ABCG1（rs1541290 G > A）、USF1（rs2516839 C > T）、ABCC3（rs1051640 A > G）、SLC22A14（rs4679028 G>A）、USF1（rs3737787 G>A）、GSTM3（rs7483 C > T）7 個(gè)基因發(fā)生了突變。ABCG1（rs1541290 G>A）的基因多態(tài)性分析中，與GA型比較，AA 型患者發(fā)生3～4 級(jí)中性粒細(xì)胞減少的概率顯著升高（P<0.05）；USF1（rs2516839 C>T）的基因多態(tài)性分析中，與CC型和CT型比較，TT型患者發(fā)生3～4級(jí)血紅蛋白減少的概率均顯著降低（P<0.05）；與CT 型比較，TT 型患者發(fā)生3～4 級(jí)中性粒細(xì)胞減少的概率顯著降低（P<0.05）。

目前，關(guān)于紫杉醇體內(nèi)代謝的相關(guān)酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究主要集中于CYP3A4，CYP2C8，ABCB1，ABCG2，ABCC1/2，OATP1B3［11-12］，關(guān)于轉(zhuǎn)運(yùn)體 ABCG1 基因多態(tài)性對紫杉醇毒性影響的研究相對較少。ABCG1 屬ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族成員，主要在膽固醇從外周向肝臟逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中發(fā)揮作用，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的表型，參與腫瘤細(xì)胞的生長。巨噬細(xì)胞中ABCG1的表達(dá)也與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，rs225388位點(diǎn)基因多態(tài)性與肺癌患者的生存相關(guān)［13］，rs3788007 位點(diǎn)基因多態(tài)性與紫杉醇的胃腸道毒性相關(guān)［14］，rs492338 位點(diǎn)與紫杉醇誘發(fā)的神經(jīng)毒性密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABCG1（rs1541290 G > A）基因多態(tài)性與中性粒細(xì)胞減少相關(guān)。但目前該位點(diǎn)基因多態(tài)性對紫杉醇代謝及毒副作用的影響尚不明確，需進(jìn)一步進(jìn)行功能研究。

USF通過結(jié)合DNA啟動(dòng)子的E-box基本序列發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，USF1基因突變可能導(dǎo)致信號(hào)通路改變，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［15］。YE 等［16］的研究認(rèn)為，USF1基因中的單核苷酸多態(tài)性（rs2516839 和rs3737787）與基于紫杉醇化療的療效和安全性，以及在卵巢癌治療中的預(yù)后密切相關(guān)。其中，rs2516839位點(diǎn)基因多態(tài)性在紫杉醇敏感和耐藥組間的等位基因頻率存在顯著差異。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USF1（rs2516839 C>T）基因多態(tài)性與紫杉醇的ADR 如血紅蛋白、白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞減少相關(guān)，進(jìn)一步表明USF1（rs2516839 C>T）在紫杉醇化療療效和ADR中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果可為臨床個(gè)體化使用紫杉醇時(shí)減少ADR 提供一定理論參考，促進(jìn)紫杉醇在腫瘤患者中的合理使用。但尚有一定局限性，收集的樣本量相對較小，無法對紫杉醇ADR 進(jìn)行全面分析，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證本研究結(jié)果；未進(jìn)行相關(guān)基因的功能研究，其對紫杉醇代謝等方面的具體影響有待進(jìn)一步研究。