LC-MS/MS法測定飲料中12種水溶性合成著色劑

◎ 蔡志靜，程江闖

（普研（上海）標準技術服務有限公司，上海 201318）

食品中的著色劑，即色素，可分為天然和合成兩大類，主要作用是使食品著色，改善感官顏色。其中，合成著色劑主要是通過化學物質合成獲得，按照化學結構來分，有非偶氮類著色劑和偶氮類著色劑，食品中常用的偶氮類著色劑有檸檬黃、誘惑紅、莧菜紅、日落黃、偶氮玉紅和胭脂紅等；按照溶解性來分，有脂溶性著色劑和水溶性著色劑，目前飲料中使用的著色劑基本上都是水溶性著色劑[1]。水溶性著色劑相對于天然著色劑來說成本低、著色力強、易調(diào)色及穩(wěn)定性好，深受各類食品生產(chǎn)企業(yè)的青睞，但部分合成著色劑存在一定安全隱患，某些食品飲料生產(chǎn)企業(yè)為了自身的利益，可能會超限量使用和非法添加合成著色劑[2-3]。如果長期大量食用這些超限量或非法添加合成著色劑的食品，會對人體產(chǎn)生一定的危害。例如會引起生育能力下降，損傷兒童智力發(fā)育，也可能會對人體肝臟產(chǎn)生一定程度的危害，部分著色劑在人體內(nèi)可能轉換成致癌物質[4-6]。因此，對于合成著色劑的使用范圍及使用量，在我國都有明確的規(guī)定。目前，水溶性著色劑檢測的前處理方法主要有固相萃取法、聚酰胺粉吸附法、QuEChERS法和溶劑超聲提取法等[7-11]。定量檢測方法主要有紫外可見分光光度法、高效液相色譜法、薄層色譜法和液相色譜串聯(lián)質譜法等[12-13]。本研究擬利用超聲、離心、固相萃取、氮吹等前處理方法進行飲料中12種水溶性合成著色劑的提取和凈化和濃縮，采用液相色譜串聯(lián)質譜法進行定性和定量分析，本方法可以簡單、快速、準確篩選飲料中的12種水溶性著色劑，提高檢測效率，為飲料中合成著色劑的含量檢測提供研究依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PTFE針式濾器：0.22 μm，上海安譜公司；PWAX小柱：150 mg/6 mL，天津博納艾杰爾公司；Waters ACQUⅠTY UPLC BEH C18色 譜 柱：50 mm×2.1 mm×1.7 μm，Waters公司；甲醇、乙腈、乙酸銨：色譜純，ThermoFisher公司；氨水、甲酸：分析純，國藥集團；檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、新紅、赤蘚紅、亮藍、靛藍和酸性橙：標準物質，曼哈格公司；誘惑紅、偶氮玉紅、酸性紅73：標準物質，Dr.Ehrenstorfer公司；飲料樣品：市售，上海地區(qū)市場采購。

1.2 儀器與設備

ExionLCTM-Sciex Triple Quad 6500液相色譜串質譜儀，美國Sciex公司；Mettler Toledo ME204E型分析天平，梅特勒公司；MilliPore 24UV型超純水儀，美國MilliPore公司；KQ-500VDE型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器公司；TGL-20M型低溫冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器公司；EFAA-DC24-RT型氮吹儀、SBEQ-CG1824型固相萃取裝置，上海安譜公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液制備

用水配制成濃度為10 mg·L-1的12種水溶性合成著色劑標準混合溶液，用空白質基質溶液逐級稀釋成 50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1和1 000 μg·L-1的標準工作溶液，混勻，過 0.22 μm PTFE針式濾器，待測。

1.3.2 前處理方法

（1）不含蛋白質液體飲料。取25.0 g樣品至50 mL塑料離心管中，超聲10 min，以4 000 r·min-1冷凍離心5 min，上清液用0.22 μm的PTFE濾膜過濾至進樣小瓶中，待上機分析。

（2）含蛋白質液體飲料和固體飲料。準確稱取1.0 g樣品至15 mL塑料離心管中，加5 mL超純水，渦旋混勻，再超聲10 min，然后以4 000 r·min-1冷凍離心5 min，用一次性吸管將上層溶液轉移至另一15 mL塑料離心管中，重復用水提取一遍，合并提取液。先后用5 mL甲醇和5 mL超純水活化PWAX小柱，將提取溶液上樣至小柱，棄去流出液。依次用5 mL甲醇和5 mL水淋洗小柱，吹干小柱，接著先用6 mL甲酸甲醇（V/V=1∶50）洗脫，再用6 mL氨水甲醇（V/V=1∶9）洗脫，收集洗脫液至氮吹管中，將氮吹儀的水浴溫度設定為60 ℃，并將試液氮氣吹至近干，用超純水定容至1.0 mL，渦旋均勻后，試液用0.22 μm PTFE針式濾器過濾至進樣小瓶，待上機分析。

1.3.3 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：Waters ACQUⅠTY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進樣量：2 μL；柱溫：40 ℃；流動相 A：5 mmol·L-1乙酸銨水溶液；流動相B：乙腈；流速：0.4 mL·min-1；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序表

（2）質譜條件。離子源類型：電噴霧離子源；離子源溫度：550 ℃；掃描方式：負離子掃描；電噴霧電壓：-4 500 V；干燥氣1：60 psi、干燥氣2：60 psi；離子對、碰撞電壓等參數(shù)見表2。

表2 12種水溶性合成著色劑采集參數(shù)表

2 結果與分析

2.1 色素的定性與定量

在食品添加劑檢測領域，高效液相色譜法應用比較廣泛，但在多種水溶性合成著色劑同時測定時，其定性和定量容易受雜質干擾，尤其在含量較低時，定性和定量容易出現(xiàn)偏差。隨著食品檢測技術的不斷發(fā)展，質譜檢測技術可以彌補高效液相色譜方面的缺陷，得到廣泛使用，所以本方法在12種水溶性合成著色劑的定性和定量檢測時，采用液相色譜串聯(lián)質譜法，優(yōu)化質譜參數(shù)后，各化合物的響應見圖1。

2.2 前處理方法的影響

對于不含蛋白質類液體飲料，其基質比較簡單，且容易混勻，可以直接取適量樣品進行超聲處理，微孔濾膜過濾后直接進樣檢測。對于含蛋白質類液體飲料和固體飲料，由于其基質比較復雜，必須采取相應的前處理來減少基質的干擾，針對此類樣品，本方法先用水提取色素，然后用PWAX小柱凈化，水浴氮吹濃縮，微孔濾膜過濾后再進樣檢測。

2.3 檢出限和標準曲線

按照本方法的前處理和儀器條件，將不含色素的乳飲料作為加標基質，各進樣7次，以3倍信噪比（S/N）作為檢出限。標準曲線采用基質曲線，線性相關系數(shù)r2為0.991～0.999，符合《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）中校準曲線相關系數(shù)不低于0.99的要求，最后確定本方法飲料中12種水溶性色素的檢出限為0.01～0.03 mg·kg-1，低于國家標準《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35—2016）中的檢出限為0.2～0.5 mg·kg-1的要求。

2.4 回收率和精密度

按照本方法的前處理和儀器條件，將不含色素的碳酸飲料和乳飲料作為加標基質，選擇線性范圍的低、中、高3個濃度點進行基質加標實驗，平行測定6次，分別計算其回收率和精密度。由于尼龍等濾膜材質對于色素會有一定的吸附，導致回收率降低，本方法采用PTFE材質濾膜，可有效降低色素的吸附，有利于回收率的提高。按照本方法進行加標回收率與精密度試驗，碳酸飲料中加標的12種水溶性色素的回收率為70.9%～108.6%，精密度為1.6%～10.0%，乳飲料中加標的12種水溶性色素的回收率為70.6%～102.8%，精密度為0.8%～9.8%。符合《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）中回收率與精密度的要求，其具體方法驗證技術指標見表3。

表3 飲料中12種水溶性色素方法驗證技術指標表

2.5 實際樣品分析

從市場上隨機采購20種不同的飲料，按照本方法對其進行12種水溶性色素含量的檢測，其中6種飲料檢出了12種水溶性色素，含有一種或幾種色素，如日落黃、亮藍、檸檬黃、莧菜紅、誘惑紅和胭脂紅等，其含量在0.02～16.50 mg·kg-1，符合我國規(guī)定的使用范圍和限量要求，20個樣品著色劑檢出情況見表4。

3 結論

本研究建立了液相色譜串聯(lián)質譜法同時測定飲料中12種水溶性合成著色劑的檢測方法。本方法準確、快速，針對基質的復雜程度選擇不同的前處理方法，對于復雜樣品能有效減少基質干擾，利用液相色譜串聯(lián)質譜儀進行分析，能更加準確快速地定性與定量。實驗結果表明，本方法在檢出限、回收率、精密度等方面都能滿足飲料中12種水溶性色素的同時測定，為實驗室檢測人員及技術研究人員提供了相應的技術參考，對于食品安全監(jiān)測也具有重要的意義。