高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定葡萄酒中的檸檬酸

◎ 譚凱燕

（廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，廣西 南寧 530200）

葡萄酒中只有少量無(wú)機(jī)酸，大部分是有機(jī)酸。葡萄酒中的有機(jī)酸是決定葡萄酒風(fēng)味的重要物質(zhì)，也是決定葡萄酒酸度的主要因素，有機(jī)酸在葡萄酒釀造過(guò)程中及釀造后均占有重要地位。葡萄酒中的有機(jī)酸主要包括蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸和琥珀酸等，這些有機(jī)酸可調(diào)節(jié)葡萄酒的酸堿度，并直接影響葡萄酒的顏色、口感和生物穩(wěn)定性。因此，葡萄酒中有機(jī)酸的定量測(cè)定對(duì)葡萄酒的品質(zhì)鑒定具有重要意義[1]。

檸檬酸，又名枸櫞酸，天然檸檬酸在自然界中分布很廣，尤其是在果蔬中。在某些食品中加入檸檬酸后，可改善口感，促進(jìn)食欲，還可促進(jìn)身體的正常代謝，適當(dāng)?shù)膭┝繉?duì)人體無(wú)害，因此食品工業(yè)中其被廣泛用作酸味劑、抗氧化劑和穩(wěn)定劑。在葡萄酒的釀造過(guò)程中，適當(dāng)添加檸檬酸可以維持和穩(wěn)定葡萄酒的顏色，并調(diào)節(jié)葡萄酒的口感[2]。但其使用量在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中有嚴(yán)格限制，《葡萄酒》（GB/T 15037—2006）中規(guī)定，干、半干和半甜葡萄酒中檸檬酸的含量≤1 g·L-1，甜葡萄酒中檸檬酸的含量≤2 g·L-1?！镀咸丫啤罚℅B/T 15037—2006）中檸檬酸指定的分析方法為《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038—2006）中的高效液相色譜法，按此方法測(cè)定葡萄酒中的檸檬酸時(shí)，由于葡萄酒中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，很難把檸檬酸完全分離出來(lái)，導(dǎo)致定性定量不準(zhǔn)確[3-4]。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道中常見(jiàn)葡萄酒中檸檬酸的檢測(cè)方法有高效液相色譜法和離子色譜法，未見(jiàn)有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定葡萄酒中檸檬酸的檢測(cè)方法的報(bào)道。因此，有必要建立一種靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確、檢出限低的檢測(cè)方法，以改善上述方法的不足，研究建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定葡萄酒中檸檬酸含量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈：色譜純Fisher；飲用純凈水：娃哈哈飲料有限公司；甲酸：色譜純，純度98%；水相濾膜：0.22 μm，CNW；有機(jī)濾膜：0.22 μm，CNW；檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度為99.80%，Stanford Chemicals。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó) AB Sciex公 司；AcclaimTM RSLC 120 C182.2 μm 2.1 mm×100 mm色譜柱：美國(guó)Thermo公司；AG-285電子天平：瑞士AMTTLE。

1.3 方法原理

試樣直接用蒸餾水稀釋后，經(jīng)高效液相色譜分離，選擇質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行定性、定量。采用外標(biāo)法定量檢測(cè)檸檬酸的含量。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 流動(dòng)相的配制

流動(dòng)相A（0.1%甲酸-水溶液）：取500 μL甲酸（色譜純）加入500 mL飲用純凈水中，過(guò)0.22 μm水相濾膜，超聲混勻去CO2即可。

流動(dòng)相B（乙腈）：色譜純，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，超聲去CO2即可。

洗針液（10%甲醇溶液）：取20 mL甲醇（色譜純）加入180 mL飲用純凈水中，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，超聲混勻去CO2即可。

1.4.2 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

稱取0.05 g檸檬酸于50 mL容量瓶中，用飲用純凈水溶解并定容到刻度，充分混勻。檸檬酸質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于2～4 ℃的冰箱冷藏儲(chǔ)存。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制

將檸檬酸儲(chǔ)備溶液用飲用純凈水稀釋成濃度分別為 0 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、200 μg·L-1、400 μg·L-1和 1 000 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.4.4 儀器條件

（1）色譜條件。C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸/水（梯度洗脫，見(jiàn)表1），流速0.3 mL·min-1，柱溫 45 ℃，進(jìn)樣量 5 μL[5]。

表1 梯度洗脫程序表

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源，負(fù)離子模式（ESⅠ-）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，電噴霧電壓為-4 500 V，離子源溫度為550 ℃，霧化氣、氣簾氣壓力為55，按以上條件對(duì)檸檬酸的離子對(duì)進(jìn)行摸索，最終確定目標(biāo)化合物的離子對(duì)條件，見(jiàn)表2[5]。

表2 檸檬酸質(zhì)譜監(jiān)測(cè)參數(shù)條件表

1.4.5 樣品的制備

移取1.0 mL葡萄酒樣品放入100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至刻度，混合均勻，過(guò)0.22 μm水相濾膜于進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.4.6 空白試驗(yàn)

不加樣品，蒸餾水過(guò)0.22 μm水相濾膜于進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.5 結(jié)果計(jì)算

樣品中檸檬酸的含量按式（1）計(jì)算。

式中：X為樣品中檸檬酸的含量，g·L-1；c為測(cè)定溶液中檸檬酸的含量，μg·L-1；V為樣液的最終定容體積，mL；m為取樣量，mL；f為樣品的稀釋倍數(shù)；1000 000 為 μg·L-1轉(zhuǎn)換為 g·L-1的換算因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和方法檢出限

從圖1可知，此高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)得檸檬酸在0～1 000 μg·L-1范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999 5。該方法的最低檢出限為0.05 mg·L-1，最低定量限為0.15 mg·L-1（以葡萄酒樣品稀釋10倍時(shí)計(jì)算）。

2.2 回收率和精密度

向葡萄酒樣品中分別加入檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品后，按照1.4.5步驟進(jìn)行回收試驗(yàn)的驗(yàn)證，在不同濃度水平上（50 μg·L-1、200 μg·L-1、1 000 μg·L-1）加標(biāo)，每個(gè)加標(biāo)濃度均進(jìn)行6次平行試驗(yàn)?；厥章首畹蜑?0.1%，最高為107.0%，平均回收率為96.0%，相應(yīng)的變異系數(shù)（RSD）為2.1%～7.6%，說(shuō)明該試驗(yàn)的回收率和精密度較好。

2.3 樣品的測(cè)定

10個(gè)不同廠家的葡萄酒樣品按1.4.5方法進(jìn)行處理后，按照1.4.4儀器條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)峰面積采用外標(biāo)法計(jì)算檸檬酸含量，結(jié)果滿意。

3 討論

3.1 液相色譜法試驗(yàn)情況

取不同廠家的10個(gè)葡萄酒樣品，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038—2006中液相色譜法測(cè)定葡萄酒中的檸檬酸，樣品經(jīng)稀釋后直接用液相色譜儀分析，其中7個(gè)葡萄酒樣品的液相色譜無(wú)法將樣品中其他組分與檸檬酸完全分離（如圖2所示），這樣極易造成定性判定錯(cuò)誤，并造成檢測(cè)結(jié)果定量不準(zhǔn)確[2]。另外3個(gè)葡萄酒樣品的液相色譜基本能將樣品中其他組分與檸檬酸分離（如圖3所示），但色譜基線波動(dòng)大，僅靠保留時(shí)間定性定量，也很難保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法試驗(yàn)情況

取上述不同廠家的10個(gè)葡萄酒樣品，經(jīng)稀釋后采用此液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，10個(gè)葡萄酒樣品的MRM色譜圖與檸檬酸不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液及葡萄酒樣品1、樣品2的MRM圖基本一致（見(jiàn)圖4），葡萄酒樣品溶液中的檸檬酸峰型極好，周圍無(wú)雜峰干擾，基線平穩(wěn)，不受樣品中復(fù)雜基質(zhì)的影響，能準(zhǔn)確完成葡萄酒樣品中檸檬酸的定性定量分析。

4 結(jié)論

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)比較驗(yàn)證，葡萄酒樣品經(jīng)簡(jiǎn)單稀釋處理，選擇高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀檢測(cè)，可以得到準(zhǔn)確的檸檬酸的定性定量結(jié)果。說(shuō)明高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法準(zhǔn)確、高效、重現(xiàn)性好，并能有效消除樣品中其他組分對(duì)目標(biāo)峰的干擾，靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確、檢出限低，可用來(lái)準(zhǔn)確分析葡萄酒中檸檬酸含量。