食物中毒樣品中大腸埃希氏菌的分離、檢測(cè)和鑒定

◎ 龍 慧，龍永艷，王 偉，吳 葵，樊國(guó)印

（南昌市疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330038）

大腸埃希氏菌是一種革蘭氏陰性桿菌，有周生鞭毛、無(wú)芽孢、兼性厭氧，其廣泛分布在人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)[1]。誤食被大腸埃希氏菌污染的食物，通常會(huì)引起腹瀉、嘔吐等癥狀，尤其是對(duì)于新生兒、老年人等免疫力較低的人群，在感染大腸埃希氏菌后不給予處理治療，會(huì)嚴(yán)重影響患者的身體健康[2-3]。建立靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于預(yù)防和控制大腸埃希氏菌引起的食品安全事件尤為重要。目前，《國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》（GB 4789.38—2012）明確規(guī)定大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)方法，通過(guò)LST肉湯多管發(fā)酵進(jìn)行檢測(cè)，最少需要2 d才能對(duì)結(jié)果進(jìn)行初步的判定，具有一定的滯后性，無(wú)法滿足食物中毒樣品快速檢測(cè)的需求[4]。熒光定量PCR是通過(guò)擴(kuò)增特定的靶基因?qū)崿F(xiàn)指數(shù)放大，然后收集熒光信號(hào)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線用于靶標(biāo)定量，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)短，且能夠滿足快速檢測(cè)的需求，適用于食物中毒樣品的應(yīng)急檢測(cè)[5-7]。熒光定量PCR主要分為染料法和探針?lè)ǎ玖戏ㄊ菍?duì)擴(kuò)增后的雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，非特異性的擴(kuò)增的二聚體會(huì)影響熒光信號(hào)造成假陽(yáng)性[8-10]。

本研究使用探針?lè)ㄟM(jìn)行檢測(cè)，選取大腸埃希氏菌的uidA基因設(shè)計(jì)引物和探針序列，構(gòu)建熒光定量PCR檢測(cè)體系并評(píng)價(jià)方法的檢測(cè)性能，進(jìn)一步應(yīng)用建立的檢測(cè)方法對(duì)食物中毒樣本進(jìn)行分析，并對(duì)檢測(cè)為大腸埃希氏菌陽(yáng)性的樣本進(jìn)行分離鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)。這為熒光定量PCR用于食品中檢測(cè)大腸埃希氏菌提供科學(xué)依據(jù)，能夠及時(shí)掌握食源性大腸埃希氏菌的生化及耐藥信息。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）、腦心浸出液（北京路橋技術(shù)股份有限公司）、Premix Ex Taq?（TAKARA，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）、革蘭氏陰性菌細(xì)菌鑒定卡（梅里埃）、細(xì)菌藥敏鑒定卡（梅里埃）；高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、熒光定量PCR儀-CFX96 Touch[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物和探針設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBⅠ數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的大腸埃希氏菌特異性基因uidA序列，使用Beacon designer 8設(shè)計(jì)引物和探針，并利用NCBⅠ BLAST驗(yàn)證引物的特異性，確定不存在非目標(biāo)菌的基因匹配，引物和探針序列委托通用生物（安徽）股份有限公司合成。

1.2.2 基因組DNA提取

細(xì)菌基因組DNA的提取采用水煮沸法。取菌懸液1 mL加入到1.5 mL無(wú)菌離心管中，放置在高速離心機(jī)中12 000 r·min-1離心3 min，去除上清液，然后加入1 mL PBS緩沖液重懸，12 000 r·min-1離心3 min，重復(fù)一次，最后重懸在500 μL超純水中，獲取菌懸液；將菌懸液放置在沸水中，煮沸15 min，使細(xì)菌破裂暴露出基因組DNA，然后放置在冰水浴中5 min，最后通過(guò)12 000 r·min-1離心5 min，上清液即為基因組DNA。

1.2.3 方法的建立和性能評(píng)價(jià)

根據(jù)Beacon designer 8軟件提供的引物和探針Tm值，設(shè)置退火和延伸溫度范圍為55.0～65.0 ℃，進(jìn)行梯度PCR，根據(jù)不同溫度對(duì)應(yīng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度確定最佳的退火和延伸溫度。qPCR擴(kuò)增體系總體積為25 μL，包含 12.5 μL（2×）Premix Ex Taq?，0.5 μL 上游引物uidA-F（10 μmol·L-1）、0.5 μL 下 游 引 物uidA-R（10 μmol·L-1），0.5 μL 探針uidA-P（10 μmol·L-1），5 μL基因組DNA模板，6 μL超純水；擴(kuò)增程序，95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，57.0 ℃退火和延伸30 s，在退火和延伸階段采集熒光信號(hào)。

取純菌液按照2.3的方法提取基因組DNA，并進(jìn)行梯度稀釋，獲取菌濃度為101～108CFU·mL-1的基因組DNA，然后對(duì)基因組DNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，根據(jù)不同細(xì)菌濃度對(duì)應(yīng)的Ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性相關(guān)性和擴(kuò)增效率以及檢測(cè)靈敏度。

選取2株目標(biāo)菌、8株非目標(biāo)菌的純菌液，按照2.3的方法提取基因組DNA，通過(guò)qPCR擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.4 生化鑒定

取qPCR鑒定為大腸埃希氏菌的陽(yáng)性樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲取4株大腸埃希氏菌單菌落，然后接種在腦心浸出液中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)得到菌懸液。將菌懸液進(jìn)行稀釋，使菌濃度大約在0.5麥?zhǔn)蠁挝?，然后按照全自?dòng)細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)（VⅠTEK 2）要求進(jìn)行操作。

1.2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

取qPCR和生化鑒定為大腸埃希氏菌的菌懸液，將菌懸液稀釋至濃度約為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，使用革蘭氏陰性菌藥敏卡片（AST-GN16）進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，確定大腸埃希氏菌分離菌的耐藥信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的建立

qPCR體系建立為快速靈敏的檢測(cè)目標(biāo)菌提供了基礎(chǔ)，本研究成功建立了熒光定量PCR檢測(cè)大腸埃希氏菌。退火溫度優(yōu)化的結(jié)果如圖1所示，當(dāng)溫度為55.0～57.0 ℃時(shí)，RFU值逐漸增加，57.0～65.0 ℃時(shí)RFU值逐漸降低，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，選取57.0 ℃為最佳退火溫度。

qPCR擴(kuò)增曲線結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增曲線為典型的S型曲線，基線期、指數(shù)期和平臺(tái)期明顯，曲線平滑無(wú)分叉現(xiàn)象，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在2 h內(nèi)完成，表明qPCR檢測(cè)體系的成功建立。

2.2 方法檢測(cè)限的評(píng)價(jià)

方法檢測(cè)限是評(píng)價(jià)檢測(cè)方法性能的重要指標(biāo)，在最優(yōu)條件下對(duì)不同濃度的目標(biāo)菌進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)qPCR擴(kuò)增結(jié)果，以不同細(xì)菌濃度對(duì)應(yīng)的Ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示，線性方程Y=-3.116X+42.85，擴(kuò)增效率為109%，線性相關(guān)性R2=0.996 6，線性范圍為10～108CFU·mL-1，檢測(cè)靈敏度為10 CFU·mL-1。結(jié)果表明，本研究建立的qPCR檢測(cè)體系，檢測(cè)靈敏度高、線性范圍寬，具有較好的擴(kuò)增效率。

2.3 方法特異性評(píng)價(jià)

選取2株大腸埃希氏菌（ATCC 25922、ATCC 8739），8株非目標(biāo)菌[鼠傷寒沙門氏菌（CMCC 50115）、副傷寒沙門氏菌（CMCC 80094）、腸炎沙門氏菌（ATCC 13076）、金黃色葡萄球菌（CMCC 26001）、金黃色葡萄球菌（CMCC 26003）、阪崎克羅諾桿菌（ATCC 29544）、蠟樣芽孢桿菌（ATCC 11778）和銅綠假單胞菌（ATCC 9027）]檢測(cè)特異性驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，uidA基因只能擴(kuò)增大腸埃希氏菌，其他非目標(biāo)菌無(wú)擴(kuò)增曲線，結(jié)果表明，本研究建立的qPCR檢測(cè)體系能夠特異性檢測(cè)大腸埃希氏菌。

2.4 大腸埃希氏菌的生化鑒定

根據(jù)VⅠTEK生化鑒定結(jié)果顯示，進(jìn)一步確定從食物中毒樣品中分離的4株菌為大腸埃希氏菌。具體的生化鑒定結(jié)果如表1所示，大部分生化結(jié)果都相同，只有少數(shù)生化項(xiàng)目存在差異，其中分離株C2能夠分解D-麥芽糖和蔗糖且酪氨酸芳胺酶陽(yáng)性，分離株C3能夠分解D-麥芽糖且γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶陰性，分離株C4能夠分解D-麥芽糖和蔗糖。

表1 生化鑒定結(jié)果表

2.5 大腸埃希氏菌藥敏實(shí)驗(yàn)

大腸埃希氏菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。4株大腸埃希氏菌分離株均表現(xiàn)出對(duì)氨芐西林、阿莫西林-棒酸、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢匹美、氨曲南、厄他培南、亞氨培南、阿米卡星、環(huán)丙沙星、呋喃妥因和復(fù)方新諾明等抗生素耐藥，對(duì)慶大霉素、妥布霉素、左旋氧氟沙星和替加環(huán)素等抗生素表現(xiàn)出不同的耐受情況，且不同分離株對(duì)一些抗生素的最低抑菌濃度（MⅠC）表現(xiàn)出不同。

表2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

續(xù)表2

3 結(jié)論

本研究選取大腸埃希氏菌特異性基因uidA設(shè)計(jì)引物和探針序列，構(gòu)建熒光定量PCR檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)靈敏、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)大腸埃希氏菌，檢測(cè)限低至10 CFU·mL-1。使用本研究建立的熒光定量PCR檢測(cè)體系對(duì)10份食物中毒樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4份大腸埃希氏菌陽(yáng)性樣本，對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行純培養(yǎng)分離獲取了4株大腸埃希氏菌。VⅠTEK生化鑒定進(jìn)一步表明這4株分離株為典型的大腸埃希氏菌，而且這4株分離株的生化鑒定結(jié)果基本一致，比對(duì)樣本來(lái)源信息發(fā)現(xiàn)，這4份樣本的采樣來(lái)自相同環(huán)境。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4株分離株對(duì)大部分的抗生素表現(xiàn)出相同的耐藥情況，只有少部分存在差異。

大腸埃希氏菌是一種常見(jiàn)引發(fā)食物中毒的病原菌，人們誤食被污染的食品后會(huì)引發(fā)一系列的疾病，建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)預(yù)防和控制由大腸埃希氏菌引發(fā)的食物中毒具有重要意義。進(jìn)一步生化和藥敏分析能夠掌握中毒樣品中大腸埃希氏菌的生物學(xué)特性，這為患者治療提供了科學(xué)依據(jù)。