越南紫薯組培快繁及FMV病毒檢測(cè)

李艷輝 穆玉潔 白冰洋 蔣素華

摘要 [目的]探究獲得大規(guī)模的越南紫薯脫毒苗的技術(shù)方法。[方法]采用莖尖組織培養(yǎng)快繁技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，探討不同培養(yǎng)基成分對(duì)越南紫薯無(wú)毒莖尖的誘導(dǎo)、分化、增殖以及生根的影響和羽狀斑駁病毒的檢測(cè)，建立越南紫薯高效再生體系和病毒檢測(cè)體系。[結(jié)果]篩選出最適越南紫薯不定芽產(chǎn)生的培養(yǎng)基是MS+6-BA 1.0 mg/L，最佳增殖培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+CW 2.0 mg/L，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L。[結(jié)論]該試驗(yàn)為大田甘薯種苗FMV病毒的高效檢測(cè)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 越南紫薯;FMV病毒;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào) S531? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）07-0092-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.021

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Tissue Rapid Propagation and FMV Virus Detection of Vietnam Ipomoea batatas

LI Yan-hui1， MU Yu-jie1， BAI Bing-yang2 et al

（1. Fengqiu County Agriculture and Rural Affairs Bureau， Xinxiang， Henan 453000;2. Luohe Tiankang Agricultural Development Co.， Ltd.， Luohe， Henan 462000）

Abstract [Objective]To acquire large-scale Vietnam Ipomoea batatas seedings. [Method]This study adopts the tissue of rapid propagation technology，discusses different culture medium components of Vietnam Ipomoea batatas buds reduction，differentiation，proliferation and the influence of root. [Result]The results illustrate that the MS+6-BA 1.0 mg/L was the optimum medium for Ipomoea batatas buds reduction， 1/2MS +6-BA 1.0 mg/L+CW 2.0 g/L was the best medium for Ipomoea batatas proliferation，1/2MS+NAA 0.5 mg/L was the optimum medium for Ipomoea batatas growing roots.[Conclusion]Therefore， this experiment can provide a fundamental theory for virus G detection in the field.

Key words Vietnam Ipomoea batatas;Virus FMV;Tissue culture

病毒病是甘薯的重要病害之一，該病直接影響甘薯的生產(chǎn)量，使其種性退化。據(jù)報(bào)道，目前世界上甘薯病毒有30余種 [1-3]，其中甘薯羽狀斑駁病毒（FMV）是我國(guó)甘薯中檢測(cè)到的最普遍的病毒[4]，通常情況下FMV與甘薯褪綠矮化病毒（CSV）交叉感染甘薯[5]。但是兩者對(duì)甘薯植株產(chǎn)生的影響不同，F(xiàn)MV主要的生理病癥是破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，降解葉綠素，常見(jiàn)的表現(xiàn)癥狀是不規(guī)則的萎黃癥狀、褪綠斑以及不規(guī)則的羽狀黃化斑，有些病斑外緣通常會(huì)有紫色素的產(chǎn)生。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前發(fā)現(xiàn)的甘薯病毒中，對(duì)甘薯感染面積最大的病毒是馬鈴薯Y病毒屬，病毒FMV和CSV都是馬鈴薯Y病毒[6]，F(xiàn)MV已被明確指出有多個(gè)株系，屬于世界性分布，幾乎所有的甘薯種植區(qū)都會(huì)有FMV的存在。FMV是長(zhǎng)825～850 nm、桿狀彎曲的粒子，是馬鈴薯Y病毒所有病毒中最長(zhǎng)的病毒[7-9]，侵染成功率相當(dāng)高。

甘薯采用無(wú)性繁殖進(jìn)行增殖，病毒會(huì)隨植株不斷的增殖，通過(guò)塊莖或者秧苗代代相傳，致使甘薯的生產(chǎn)質(zhì)量不斷下降。國(guó)內(nèi)外研究者致力于甘薯抗病毒育種及甘薯脫毒研究，但至今尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)甘薯病毒病有效的化學(xué)預(yù)防和治療藥劑，也未發(fā)現(xiàn)實(shí)用的甘薯品種能夠高抗病毒病[10]。鑒于此，甘薯脫毒苗的大量培養(yǎng)成為提高甘薯產(chǎn)量和質(zhì)量最有效的方法之一[11]。

甘薯脫毒苗的培養(yǎng)利用甘薯莖尖分生組織是無(wú)毒區(qū)的原理，將莖尖剝離，并進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得無(wú)毒苗的一種生物技術(shù)[12-13]。分子生物學(xué)檢測(cè)法即RT-PCR法，根據(jù)待測(cè)病毒外殼蛋白的核酸序列設(shè)計(jì)出特定的引物，提取越南紫薯的總RNA，建立合適的體系反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，用設(shè)計(jì)好的引物建立RT-PCR體系對(duì)得到的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增并用普通瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)[8]。該研究利用越南紫薯的莖尖進(jìn)行快繁，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)獲得真正的無(wú)毒薯苗，提高紫薯的生產(chǎn)量，為甘薯病毒檢測(cè)及脫毒苗快繁技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采取新鮮越南紫薯葉片，用自來(lái)水清洗干凈并放于液氮中速凍，標(biāo)記后存放于-80 ℃恒溫中備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)

在NCBI上查取SPFMV外殼蛋白（SPFMV-CP）的序列，用Primer premier 5.0 設(shè)計(jì)序列保守引物，并由上海英駿生物技術(shù)公司合成，上引物：FMV-CP-F：5′-TTAGGCAGATTATGACGCA-3′;下引物：FMV-CP-R：3′-GCACACCCCTCATTCCTA-5′。

1.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

利用TIANGEN公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取紫薯的總RNA，用試劑盒M-MLV反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠回收目的基因，然后進(jìn)行T載體連接轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)行基因測(cè)序。

1.4 越南紫薯的莖尖脫毒與病毒檢測(cè)

1.4.1 脫毒苗的獲得與芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。

選取健康無(wú)病斑的越南紫薯塊，用清水洗凈表面泥土。先用0.1%高錳酸鉀處理15 min，再用0.5%多菌靈浸泡1 h，撈出晾干，在0.1%多菌靈水中進(jìn)行恒溫催芽，溫度為28? ℃，相對(duì)濕度為80%～85%，待薯芽萌動(dòng)后，于35～40 ℃處理30 d（8 h/d）。

剪取生長(zhǎng)旺盛的甘薯枝條頂芽下3～6節(jié)，剪去葉片和葉柄后進(jìn)行消毒。消毒時(shí)先將材料放在水與洗潔精比例為1∶500的溶液中沖洗15 min，流水沖洗30 min，再將枝條剪成至少帶2個(gè)頂芽的小段后，再用70%乙醇浸泡40 s。用無(wú)菌水清洗干凈后，以0.1%HgCl 2滅菌6～7 min，再用無(wú)菌水反復(fù)清洗4次。在超凈工作臺(tái)上，把小段莖尖頂端的生長(zhǎng)點(diǎn)（一般帶有1～2個(gè)葉原基）剝離后，插入芽誘導(dǎo)X 1～X 3號(hào)培養(yǎng)基中，X 1：MS+6-BA 1.0 mg/L;X 2：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;X 3：MS。接種15 d后觀察生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)。

1.4.2 脫毒苗的增殖培養(yǎng)。

選取健壯無(wú)菌叢生芽分割成5 mm左右的小段，葉片切成直徑為4 mm左右大小的塊，接種到M 1～M 3號(hào)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，M 1：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;M 2：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;M 3：1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+CW 2.0 mg/L。培養(yǎng)基為120 ℃滅菌30 min。每瓶接種數(shù)目一致（4～6個(gè)），置于光照培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察叢生芽增殖和長(zhǎng)勢(shì)情況。

1.4.3 脫毒苗的生根培養(yǎng)與病毒檢測(cè)。

選取脫毒成功的越南紫薯增殖苗，切成帶有2～3片嫩葉且2～3 cm的小段，移至Z 1～Z 3號(hào)生根培養(yǎng)基中，Z 1：1/2MS+NAA 0.5 mg/L;Z 2：1/2 MS+NAA 0.3 mg/L;Z 3：1/2MS。每瓶接種數(shù)目一致，培養(yǎng)20 d，觀察生根情況。當(dāng)小苗在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)到7～9 cm時(shí)可進(jìn)行煉苗和移栽。每株至少摘取1片生根培養(yǎng)后的葉片進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，然后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳及UVITEC成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。若無(wú)對(duì)應(yīng)FMV病毒外殼蛋白目標(biāo)條帶，即可判斷經(jīng)過(guò)莖尖脫毒的株系脫毒成功，并將未脫毒成功的株系淘汰。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

獲得總RNA溶液后，凝膠電泳檢測(cè)其完整性，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，18S、28S條帶清晰，且28S條帶為18S的2倍，通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其OD值在1.8～2.0，說(shuō)明提取的RNA完整性較好，可通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。

2.2 基因克隆

以獲得的cDNA作為模板，設(shè)計(jì)好引物FMV-CP-F和FMV-CP-R，用RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示有1條特異性條帶在336 bp（圖2），說(shuō)明基因片段已經(jīng)獲得。

2.3 PCR檢測(cè)與分析

連接轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性菌落作為目的基因模板，用引物FMV-CP-F和FMV-CP-R配制PCR體系，經(jīng)擴(kuò)增得到300 bp片段（圖3）。

2.4 莖尖脫毒與病毒的檢測(cè)

2.4.1 莖尖誘導(dǎo)。

對(duì)越南紫薯進(jìn)行消毒和催芽后，取莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，15 d后觀察培養(yǎng)情況。由表1可知，X 1培養(yǎng)基誘導(dǎo)率達(dá)到100%，不定芽生長(zhǎng)旺盛，呈深綠色，說(shuō)明誘導(dǎo)效果好;X 2的誘導(dǎo)率雖然達(dá)到970%，但芽呈黃綠色，說(shuō)明X 2的莖尖誘導(dǎo)效果一般;X 3的誘導(dǎo)率為92.5%，芽較弱，說(shuō)明誘導(dǎo)效果欠佳。綜合判斷，X 1培養(yǎng)基中的激素適合不定芽的誘導(dǎo)，莖尖誘導(dǎo)情況見(jiàn)圖4。

2.4.2 增殖培養(yǎng)和病毒檢測(cè)。

為了避免誘導(dǎo)得到的不定芽老化，在其培養(yǎng)一段時(shí)間后，將其及時(shí)分成獨(dú)立的芽苗接種到新鮮的培養(yǎng)基上，使芽苗能夠快速增殖生長(zhǎng)，以滿足生根培養(yǎng)的需求。該試驗(yàn)采用3種不同的培養(yǎng)基對(duì)增殖培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行比較篩選，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，培養(yǎng)基M 3的增殖效果最好，即培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+CW 2.0 mg/L適合越南紫薯苗的增殖，增殖率達(dá)98.9%，且苗生長(zhǎng)健壯。增殖培養(yǎng)情況見(jiàn)圖5。

2.4.3 脫毒檢測(cè)。

從快繁體系中挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的植株，將其移栽至智能溫室中培養(yǎng)，剪取莖尖，提取脫毒苗的總RNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，判斷其是否含有病毒。從圖6可見(jiàn)，條帶1 明亮，為陽(yáng)性對(duì)照，條帶2、3看不到條帶則證明脫毒成功，可將植株2、3繼續(xù)培養(yǎng)，作為獲得無(wú)毒苗的材料。

2.4.4 生根培養(yǎng)。

選取未淘汰的無(wú)毒紫薯苗，在超凈工作臺(tái)上取帶有2～3片嫩葉的短莖轉(zhuǎn)移到Z 1～Z 3培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，越南紫薯嫩苗在Z 1培養(yǎng)基上生根率為100%，且根長(zhǎng)而粗，生根效果理想。而Z 2培養(yǎng)基上的生根率雖然也為100%，但植株長(zhǎng)勢(shì)不好。因此，根誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為Z 1。生根培養(yǎng)情況見(jiàn)圖7。

3 討論

該研究通過(guò)比較不同濃度6-BA、NAA、KT等對(duì)越南紫薯組培快繁的影響，初步建立了越南紫薯的組培快繁體系。根據(jù)該研究結(jié)果可知，不同培養(yǎng)基成分在對(duì)越南紫薯莖尖的誘導(dǎo)、增殖和生根產(chǎn)生了不同效果：在誘導(dǎo)紫薯莖尖產(chǎn)生不定芽時(shí)宜采用MS+6-BA 1.0 mg/L;在進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)宜采用1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+CW 2.0 mg/L;在進(jìn)行生根培養(yǎng)時(shí)宜采用1/2MS+NAA 0.5 mg/L，該組合得到的越南紫薯苗適合煉苗和移栽，單純的1/2MS培養(yǎng)基上紫薯苗雖然也能長(zhǎng)出根，但根較弱，難以吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不適合煉苗和移栽。綜合說(shuō)明培養(yǎng)基中添加激素可以促進(jìn)器官誘導(dǎo)，而不同激素組合對(duì)同一種誘導(dǎo)有不同效應(yīng)。組織培養(yǎng)的過(guò)程中根據(jù)RT-PCR檢測(cè)方法可檢測(cè)脫毒苗是否脫毒成功，檢測(cè)過(guò)程靈敏快捷。

該研究在短時(shí)間內(nèi)可完成越南紫薯植株再生和病毒檢測(cè)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了再生體系的建立，該體系的建立對(duì)越南紫薯快速繁殖和規(guī)?；a(chǎn)有著重要的指導(dǎo)意義。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，我國(guó)每年因甘薯病毒病而造成的損失極大[14]，而高效的莖尖脫毒體系將會(huì)大大降低損失，因此推廣優(yōu)質(zhì)的甘薯品種病毒檢測(cè)體系及莖尖脫毒體系勢(shì)在必行。

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