表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯緩解高頻刺激誘導(dǎo)的雌性小鼠慢性原發(fā)性疼痛

唐 源，金冬梅，揭英桃，林震嘉，熊 媖，彭湘格，周利君，談 智

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理教研室//中山大學(xué)疼痛研究中心，廣東廣州 510080；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510120）

慢性疼痛困擾著全球三分之一的人口，是威脅人類(lèi)身心健康的重要原因之一，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致勞動(dòng)能力的喪失［1-2］。WHO 2018 年正式將慢性疼痛認(rèn)定為一種疾病，2019 年ICD-11 新劃分的慢性疼痛第一大類(lèi)——慢性原發(fā)性疼痛（chronic primary pain，CPP），是指排除其他類(lèi)型慢性疼痛的一個(gè)或多個(gè)解剖區(qū)域、持續(xù)或反復(fù)發(fā)作超過(guò)3 個(gè)月的疼痛，伴有顯著的情緒情感異常（如焦慮、憤怒、沮喪或情緒低落）和（或）功能障礙［3］。故此，已建立的多種神經(jīng)損傷或炎性刺激引起的慢性疼痛模型并不適合慢性原發(fā)性疼痛的機(jī)制研究。2019 年我們采用無(wú)明顯神經(jīng)損傷的中強(qiáng)度高頻刺激（high-frequency stimulation，HFS）創(chuàng)建了首個(gè)小鼠慢性原發(fā)性疼痛模型［4］。因此，在此模型上進(jìn)行深入的機(jī)制研究將為有限的臨床防治手段提供新的靶點(diǎn)和策略。天然化合物在藥物研究中的地位和意義越來(lái)越受到人們的重視。不少文獻(xiàn)已證實(shí)藥用植物和膳食補(bǔ)充劑可提供有效且安全的止痛效果。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯［（-）-epigallocatechin gallate，EGCG］是從綠茶中提取的多酚類(lèi)物質(zhì)中含量最高的一類(lèi)兒茶素類(lèi)單體，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤生長(zhǎng)及神經(jīng)保護(hù)等作用，能防治多種慢性疾病，如癌癥［5］、心血管疾?。?］和神經(jīng)退行性疾病［7］。近年來(lái)一些臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究提示EGCG 還具有良好的鎮(zhèn)痛作用［8］。鞘內(nèi)（或腹腔）注射EGCG可緩解大鼠（或小鼠）脊神經(jīng)結(jié)扎（spinal nerve ligation，SNL）［9-10］、坐骨神經(jīng)縮窄損傷（chronic constriction injury，CCI）［11-12］、坐骨神經(jīng)鉗夾損傷［13］、髓核突出壓迫神經(jīng)根［14］等神經(jīng)病理性疼痛。但EGCG 是否可緩解非神經(jīng)損傷的慢性原發(fā)性疼痛尚未有研究。因此，本研究旨在觀(guān)察EGCG 能否緩解HFS 誘導(dǎo)的慢性原發(fā)性疼痛中的痛覺(jué)敏化并初步探討機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性C57BL/6J 小鼠34 只，8～10 周齡（18～20）g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（廣州）生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2016-0029；使用許可證：SYXK（粵）2017-0081。小鼠置于SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為（20～26）℃，相對(duì)濕度為40%～70%，且所有籠具、飼料、飲水、墊料均嚴(yán)格消毒。動(dòng)物使用協(xié)議和動(dòng)物處理程序獲得了中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)（IACUC）的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（SE8120，索萊寶公司）；異氟烷（瑞沃德公司）；von-Frey（Aesthesio，Danmic公司）；Rabbit anti-c-Fos（2250，CST公司）；Mouse anti-NeuN（ab104224，abcam 公司）；Goat anti-CGRP（NBP3-00520，Novus 公司）；Goat anti-Iba1（ab5076，abcam 公司）；Mouse anti-GFAP（3670，CST 公司）；Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 555（A31572，Life Technologies 公司）；Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488（A21202，Life Technologies 公司）；Donkey anti-Goat Alexa Fluor 555（A31570，Life Technologies 公司）；Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488（A21206，Life Technologies 公司）；Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647（A31571，Life Technologies 公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon公司）。

1.3 高頻電刺激的模型建立與EGCG給藥

將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組，溶劑（生理鹽水）+HFS 組，EGCG（10、20、50、200 μmol/L）+HFS 組（每組4～5 只小鼠）。HFS 模型的建立：使用吸入性麻醉劑（1～3）%異氟烷將小鼠麻醉后剃去左側(cè)腿部毛發(fā)，在腘窩處鈍性分離皮膚和肌肉暴露出坐骨神經(jīng)，將雙鉑電極置于坐骨神經(jīng)下給予HFS（10 V，100 Hz，波寬0.5 ms，4串，每串持續(xù)1 s，間隔10 s）刺激以建立慢性原發(fā)性疼痛模型，最后將小鼠傷口縫好后放回原籠位飼養(yǎng)。整個(gè)手術(shù)過(guò)程動(dòng)作輕柔，避免過(guò)度牽拉或損傷坐骨神經(jīng)。

EGCG 給藥：參考文獻(xiàn)依照參考文獻(xiàn)中EGCG給藥劑量，我們將ECGG 直接溶于生理鹽水并配置成4 個(gè)濃度梯度（10、20、50 和200 μmol/L），在平行于髂后上棘處的脊柱內(nèi)以10 μL 體積進(jìn)行單次鞘內(nèi)給藥（溶劑或EGCG），待1 h 后再做上述的HFS刺激。

鞘內(nèi)注射的具體操作：使用（1～3）%異氟烷吸入性麻醉劑將小鼠麻醉后，左手固定好鼠身，用右手拇指指甲在平行于髂后上棘處按壓觸知凸起的棘突，在下方的棘突間隙用10 μL 微量注射器與脊柱上方成20 度角斜度進(jìn)針，明顯的突然甩尾是成功進(jìn)入硬膜內(nèi)空間的標(biāo)志。

1.4 機(jī)械痛閾的測(cè)試

每次測(cè)試前將小鼠提前30 min 置于測(cè)試網(wǎng)架上以適應(yīng)測(cè)試環(huán)境，使用von-Frey（0.02～2.0 g）纖維絲進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試過(guò)程中至少由2 名實(shí)驗(yàn)員在不知道分組情況下盲測(cè)，且重復(fù)5 次刺激后爪中的至少有一次長(zhǎng)達(dá)3 s 的縮爪行為則記為一次陽(yáng)性結(jié)果。小鼠痛閾變化率=（ln2 -ln mechanical pain threshold）/（ln2 -ln0.02）×100，痛閾抑制率（%analgesic efficiency）=（HFS 痛閾變化率-EGCG 預(yù)處理組痛閾變化率）/HFS痛閾變化率×100。

1.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

小鼠腹腔注射10%烏拉坦后，經(jīng)左心室灌注20 ml 0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液快速?zèng)_凈血液后再灌注40 ml 40 g/L 多聚甲醛溶液進(jìn)行前固定。將取下的腰段脊髓（L4-L6）后固定（3～4）h 再轉(zhuǎn)至30%蔗糖溶液脫水沉底；再用冰凍切片機(jī)（Leica 公司）將脊髓切成18 μm 薄組織片。組織片先用驢血清常溫封閉1 h 后，加入CGRP、Iba1 等抗體4 ℃孵育18 h 左右；再用磷酸鹽緩沖液清洗3 次后加入對(duì)應(yīng)的二抗常溫孵育1 h，然后再次清洗3 次后滴加抗熒光淬滅劑封片，拍攝。各組腰段脊髓每組一粒切在同一玻片上再一起進(jìn)行免疫熒光染色；而且拍照時(shí)，c-Fos、CGRP、Iba1、GFAP 信號(hào)都分別在同一曝光條件拍攝；最后再使用Image J 軟件在相同亮度、對(duì)比度情況下進(jìn)行相對(duì)光密度（relative optical density，RelOD）分析。用Image J 細(xì)胞計(jì)數(shù)插件統(tǒng)計(jì)10倍熒光片中脊髓背角c-Fos+、Iba1+及GFAP+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。免疫熒光統(tǒng)計(jì)中每組3 只動(dòng)物，每只以最強(qiáng)2～3 張片為計(jì)，其中RelOD 以Sham 組均值為100%標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，為正態(tài)分布的計(jì)量結(jié)果。圖1 行為學(xué)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)采用雙因素方差分析（two-way ANOVA），用最小顯著差（least significance difference，LSD）比較每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的各組數(shù)據(jù)。圖2～4 使用單因素方差分析（One-way ANOVA）處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用one-way ANOVA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用Tukey HSD法進(jìn)行兩兩比較，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但方差不齊時(shí)采用Welch′s ANOVA，最后用Tamhane′sT2進(jìn)行兩兩比較。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 軟件分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG劑量依賴(lài)性緩解HFS誘發(fā)的痛覺(jué)過(guò)敏

為了觀(guān)察EGCG 是否可以緩解HFS 誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng)，我們采用10 μL 不同濃度的EGCG（10、20、50 和200 μmol/L）或溶劑（生理鹽水）單次鞘內(nèi)注射1 h后再進(jìn)行假手術(shù)或HFS刺激。機(jī)械痛行為學(xué)結(jié)果顯示10 V HFS 能引起顯著且持續(xù)1 W以上的機(jī)械痛敏，而EGCG 可劑量依賴(lài)性緩解HFS刺激引起的痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng)：10 μmol/L EGCG 對(duì)機(jī)械撤足閾值（mechanical withdrawal threshold，PWT）沒(méi)有明顯影響，20 μmol/L EGCG 能輕微增加PWT，50、200 μmol/L 劑量時(shí)達(dá)到最佳治療效果（P＜0.000 1），且維持鎮(zhèn)痛效應(yīng)至少長(zhǎng)達(dá)7 d（圖1A）。進(jìn)一步分析對(duì)HFS 痛閾抑制效率的結(jié)果顯示（圖2B），10 μmol/L 濃度EGCG 對(duì)疼痛的抑制率僅在第3 d 達(dá)（20.47±4.58）%（P＜0.05），20 μmol/L EGCG在HFS 刺激后對(duì)疼痛抑制達(dá)到（44.82±3.58）%（P＜0.000 1），而50、200 μmol/L 對(duì)HFS誘導(dǎo)的機(jī)械痛抑制率分別可達(dá)（70.75±1.97）%、（68.63.75±2.86）%（P＜0.000 1；圖1B）。這兩個(gè)濃度鎮(zhèn)痛效果并無(wú)明顯差異（P＞0.05），表明50 μmol/L 已是鎮(zhèn)痛最佳濃度，其最大鎮(zhèn)痛效率為84.95%。痛行為學(xué)結(jié)果表明預(yù)先單次EGCG 鞘內(nèi)注射能劑量依賴(lài)性緩解HFS誘導(dǎo)機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏。

圖1 EGCG鞘內(nèi)預(yù)處理對(duì)小鼠HFS誘導(dǎo)機(jī)械痛覺(jué)異常的影響Fig.1 Effects of intrathecal EGCG on HFS-induced mechanical allodynia

2.2 EGCG降低脊髓背角神經(jīng)元的興奮性

脊髓背角投射神經(jīng)元興奮性增加是痛覺(jué)過(guò)敏持續(xù)的重要原因，而即早基因c-Fos 表達(dá)可作為神經(jīng)功能活動(dòng)的標(biāo)志物。因此，為進(jìn)一步驗(yàn)證EGCG對(duì)痛行為學(xué)的影響，我們通過(guò)免疫熒光染色法觀(guān)察EGCG 對(duì)脊髓背角神經(jīng)元c-Fos 表達(dá)的影響。如圖2 所示，與假手術(shù)組相比，HFS 模型7 d 后的小鼠脊髓背角c-Fos 表達(dá)顯著上升（P＜0.000 1）。免疫熒光雙染結(jié)果顯示c-Fos表達(dá)在神經(jīng)元中（綠色NeuN標(biāo)識(shí)），而50 μmol/L EGCG 處理組則明顯下調(diào)（P＜0.000 1）。以上結(jié)果表明EGCG 可有效抑制脊髓背角神經(jīng)元興奮性的增加；這從痛覺(jué)一級(jí)突觸后神經(jīng)元層面證實(shí)EGCG 對(duì)小鼠慢性原發(fā)性疼痛的鎮(zhèn)痛效果顯著。

圖2 EGCG預(yù)處理對(duì)HFS刺激7天后同側(cè)脊髓背角c-Fos表達(dá)的影響Fig.2 Effect of EGCG pretreatment on c-Fos expression in the ipsilateral spinal dorsal horn at 7 day after HFS stimulation

2.3 EGCG 降低HFS 引起的脊髓背角CGRP 增加

研究證實(shí)CGRP 介導(dǎo)多種慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展；我們前期研究也證明CGRP 陽(yáng)性的神經(jīng)末梢在HFS 模型腰段（L4-L6）脊髓背角中顯著增加。因此，我們也觀(guān)察EGCG 對(duì)HFS 模型高表達(dá)CGRP 的影響。如圖3 免疫熒光結(jié)果所示，與HFS 7 d 模型組CGRP 高表達(dá)相比，EGCG 預(yù)處理可顯著降低脊髓背角CGRP 的熒光強(qiáng)度（P＜0.000 1）。這一結(jié)果從突觸前層面進(jìn)一步證實(shí)EGCG 對(duì)慢性原發(fā)性疼痛的抑制效果。

圖3 EGCG預(yù)處理對(duì)HFS刺激后脊髓CGRP纖維終末的影響Fig.3 The changes of spinal CGRP fiber terminal after HFS with or without EGCG pretreatment

2.4 EGCG 減少脊髓背角中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活

大量研究顯示脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞的激活及其炎癥反應(yīng)也介導(dǎo)慢性疼痛的發(fā)病過(guò)程，而EGCG 也有抑制神經(jīng)炎癥的作用。因此，我們還將觀(guān)察EGCG 對(duì)HFS 模型脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞的影響情況。如圖4A、C 免疫熒光圖所示，與對(duì)照組相比，HFS 7 d 模型中脊髓背角中由Iba1 標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.000 1），而EGCG 預(yù)處理組小膠質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性數(shù)量減少（P＜0.000 1）。同時(shí)，與對(duì)照組對(duì)比，HFS 模型組脊髓背角GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目增加（P＜0.05），而EGCG預(yù)處理后則數(shù)目減少（P＜0.05），但各組平均熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異（圖4B、D）。以上結(jié)果表明EGCG 可抑制HFS 引起的脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞（尤其小膠質(zhì)細(xì)胞）激活。

圖4 EGCG對(duì)脊髓背角中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.4 The effects of EGCG on the number of microglia and astrocytes in spinal dorsal horn

3 討論

慢性疼痛是困擾患者的一大頑疾，其主要表現(xiàn)為痛覺(jué)超敏（痛閾降低）、痛覺(jué)過(guò)敏（疼痛反應(yīng)增強(qiáng)）和自發(fā)性疼痛；發(fā)病機(jī)制除涉及疼痛處理的外周和中樞敏化外，還包括神經(jīng)免疫炎癥［15］。最新的慢性疼痛分類(lèi)包括三個(gè)方面：傷害性疼痛（nociceptive pain 來(lái)自組織損傷）、神經(jīng)性疼痛（neuropathic pain來(lái)自神經(jīng)損傷）與可塑性疼痛（nociplastic pain，來(lái)自敏感神經(jīng)系統(tǒng)）。但不同疼痛類(lèi)型可能存在機(jī)制上的重疊，故此分類(lèi)也并不全面；因此許多專(zhuān)家認(rèn)為疼痛分類(lèi)是一個(gè)連續(xù)統(tǒng)一體［1］。新增加的可塑性疼痛是指癥狀更為廣泛或強(qiáng)烈的多灶性疼痛以及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病衍生的癥狀，如疲勞、睡眠、記憶、和情緒問(wèn)題［16］。雖然造成這種疼痛的機(jī)制尚不完全清楚，但人們認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中痛覺(jué)處理的增強(qiáng)以及疼痛調(diào)節(jié)的改變起著重要作用。慢性原發(fā)性疼痛是無(wú)明確誘因且不能更好地用其他繼發(fā)性慢性疼痛來(lái)解釋的一類(lèi)常見(jiàn)而特殊的慢性疼痛，主要包括五種類(lèi)型：慢性彌漫性疼痛、復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征、慢性原發(fā)性頭痛或口面部疼痛（如慢性偏頭痛、三叉神經(jīng)自主性疼痛、慢性灼口痛）、慢性原發(fā)性?xún)?nèi)臟痛（如腸易激綜合征）、慢性原發(fā)性肌肉骨骼疼痛［3］。神經(jīng)損傷后傳入神經(jīng)的簇狀自發(fā)放電水平明顯增加，即異位放電（ectopic discharge），被認(rèn)為是其慢性疼痛的重要原因［17］。多項(xiàng)研究表明，雖然偏頭痛、三叉神經(jīng)自主性痛沒(méi)有明確誘因，但均存在持續(xù)的神經(jīng)異位放電現(xiàn)象［18］。這為HFS 誘導(dǎo)慢性原發(fā)性疼痛模型提供了一定的理論依據(jù)；也提示慢性原發(fā)性疼痛當(dāng)屬于可塑性疼痛。此外，HFS 誘導(dǎo)的C 纖維誘發(fā)電位長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long term potentiation，LTP）被公認(rèn)為痛覺(jué)過(guò)敏的基礎(chǔ)以及中樞敏化的突觸模型［19］。因此，我們之前研究發(fā)現(xiàn)中強(qiáng)度HFS 誘導(dǎo)的一種小鼠非神經(jīng)損傷性慢性疼痛不僅可用作慢性原發(fā)性疼痛模型［4］，也可以作為可塑性疼痛的模型。

EGCG 是1985 年首次在日本從綠茶中檢測(cè)和化學(xué)鑒定出來(lái)的一類(lèi)兒茶素［20］，具有多種生物活性，如清除活性氧和氮抗氧化作用，抑制一氧化氮（NO）、前列腺素E2、環(huán)氧化酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和白細(xì)胞介素等多種炎癥介質(zhì)的合成［21］。Choi 等［9］首次報(bào)道了鞘內(nèi)注射EGCG（30 μg）可減輕SNL 大鼠的機(jī)械疼痛異常，鎮(zhèn)痛效率達(dá)69.2%，機(jī)制上認(rèn)為可能與阻斷神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）而非iNOS 表達(dá)來(lái)抑制NO 合成有關(guān)。此后較多的研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)或腹腔注射EGCG 可通過(guò)抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞、椎間盤(pán)或關(guān)節(jié)軟骨的炎癥或氧化反應(yīng)來(lái)緩解不同類(lèi)型的大小鼠慢性繼發(fā)性疼痛，如神經(jīng)病理性疼痛（CCI［11］、SNL［10］）、神經(jīng)根性疼痛［14］、骨癌相關(guān)疼痛［22］、骨關(guān)節(jié)炎疼痛［23］。此外，2012 年Renno 等［13］報(bào)道腹腔注射EGCG（50 mg/kg）可通過(guò)減少骨骼肌凋亡基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后肌肉功能恢復(fù)以及機(jī)械、熱感覺(jué)異常的緩解，2014 年［24］又再次發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓損傷急性期或慢性期靜脈滴注EGCG（20 mg·kg-1·h-1，持續(xù)36 h）可調(diào)控脊髓軸突生長(zhǎng)（GAP-43 標(biāo)識(shí)）和膠質(zhì)增生（GFAP 標(biāo)識(shí)），恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能以及改善雙后肢觸覺(jué)異常反應(yīng)和機(jī)械痛覺(jué)閾值。這些研究均證實(shí)在復(fù)雜的繼發(fā)性疼痛情況下，EGCG 可主要通過(guò)神經(jīng)外的機(jī)制來(lái)緩解慢性疼痛。

那么EGCG 是否能調(diào)控非神經(jīng)損傷非炎性刺激引起慢性原發(fā)性疼痛或中樞神經(jīng)系統(tǒng)痛覺(jué)處理增強(qiáng)的可塑性疼痛呢？為回答這一疑問(wèn)，本研究采用HFS 誘導(dǎo)的慢性疼痛模型對(duì)此進(jìn)行了初步的探討。與之前慢性繼發(fā)性疼痛相比，我們發(fā)現(xiàn)EGCG單次鞘內(nèi)提前1 h注射能劑量依賴(lài)性翻轉(zhuǎn)HFS引起的機(jī)械痛閾下降，鎮(zhèn)痛作用持續(xù)1 W 以上（圖1A）；此外，最大鎮(zhèn)痛效率可達(dá)到84.95%（圖1B）。機(jī)制上，我們分別從脊髓背角突觸后、突觸前以及膠質(zhì)細(xì)胞激活三個(gè)方面進(jìn)行了機(jī)制探討。我們發(fā)現(xiàn)EGCG 能顯著抑制HFS 誘導(dǎo)的同側(cè)脊髓背角神經(jīng)元c-Fos 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及熒光強(qiáng)度的增加（圖2），還能降低CGRP+感覺(jué)神經(jīng)末梢（圖3）。此外，與以往研究一致［11-12］，EGCG 還能抑制脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活（圖4），尤以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞顯著。已知EGCG 具有強(qiáng)烈的抗氧化作用［10，21］，而脊髓背角神經(jīng)元［25］或膠質(zhì)細(xì)胞［26］中活性氧（reactive oxygen species，ROS）是神經(jīng)性疼痛的關(guān)鍵分子。據(jù)此，我們推測(cè)EGCG 緩解慢性原發(fā)性疼痛也可能與其抗氧化作用有關(guān)。綜上所述，除抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活外，低劑量的EGCG 在慢性原發(fā)性疼痛中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用可能與直接抑制髓背角神經(jīng)元興奮性和突觸前CGRP+終末數(shù)量有關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)之前報(bào)道鞘內(nèi)注射EGCG緩解神經(jīng)病理性疼痛的劑量都非常高，如CCI模型中［11］，EGCG 大鼠給藥是1 mg/kg，10 μL，術(shù)前1 d至術(shù)后3 d每天一次，約等于小鼠劑量140 μg；SNL模型中［10］EGCG 大鼠給藥為10 μg，約等于小鼠劑量7 μg。反而本研究中50 μmol/L 10 μL EGCG 緩解小鼠慢性原發(fā)性疼痛的劑量相當(dāng)于229.19 ng，只有之前劑量的（0.16～3.27）%。以上結(jié)果不僅表明EGCG 對(duì)慢性原發(fā)性疼痛的鎮(zhèn)痛效果更為顯著，也提示低劑量的EGCG可能直接通過(guò)影響痛覺(jué)的神經(jīng)傳導(dǎo)通路來(lái)起作用。

2004 年Tachibana 等發(fā)現(xiàn)生理濃度的EGCG（0.1～1.0）μmol/L通過(guò)其受體67 ku層粘連蛋白受體（67 ku Laminin receptor，67LR）能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［27］。本研究初步證實(shí)EGCG對(duì)雌性小鼠HFS誘導(dǎo)慢性原發(fā)性疼痛的預(yù)防作用。那么EGCG的上述鎮(zhèn)痛作用是否由67LR介導(dǎo)？對(duì)雄性小鼠是否也有相似的作用？此外，EGCG 是否還具有治療作用以及其具體的分子機(jī)制等問(wèn)題還待進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究初步證明低劑量的EGCG 可通過(guò)局部抑制突觸前、突觸后以及膠質(zhì)細(xì)胞三個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)緩解HFS 誘導(dǎo)的慢性原發(fā)性疼痛。因此，EGCG 有望成為治療慢性原發(fā)性疼痛的潛在藥物，具有良好的臨床轉(zhuǎn)化前景。