彌可保預(yù)防長春新堿誘導(dǎo)的病理性疼痛的機(jī)制

黃睿臻，徐 勁，魏緒紅

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理教研室//疼痛研究中心，廣東廣州 510080）

長春新堿和鉑類藥物等癌癥化療藥物的使用常常會引起外周神經(jīng)病變（chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN）。CIPN 主要表現(xiàn)為本來不引起疼痛的機(jī)械刺激及冷熱刺激所誘發(fā)的疼痛［1］。CIPN 限制化療藥物的使用并嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量［2］，目前尚沒有較好的治療方法。因此，我們需要另一種新的有效的治療或預(yù)防CIPN的策略。病人腓腸神經(jīng)活檢和動物實驗發(fā)現(xiàn)，化療導(dǎo)致外周傳導(dǎo)觸壓覺的有髄傳入纖維丟失［3］，這可以解釋化療病人觸壓覺遲鈍。但是，肢體末梢麻木伴有劇烈疼痛的機(jī)制則不清楚。眾所周知，慢性疼痛是由C 纖維傳導(dǎo)的，而C 纖維又分為肽能和非肽能兩大類，前者表達(dá)IB4，投射到脊髓背角Ⅱ板層的內(nèi)側(cè)，而后者表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、神經(jīng)生長因子受體TrkA和P物質(zhì)，投射到脊髓背角Ⅰ板層和Ⅱ板層的外側(cè)，直接與背角表達(dá)神經(jīng)激肽-1 受體（neurokinin-1 receptor，NK-1R）的神經(jīng)元形成突觸［4］。NK-1R 陽性神經(jīng)元投射到高位中樞（丘腦和臂旁核）。研究表明，選擇性地去除脊髓背角NK-1R 陽性投射神經(jīng)元可防止炎性痛和神經(jīng)病理性疼痛［5］。我們之前的研究表明，長春新堿可引起脊髓背角CGRP 非肽能C 纖維芽生，但不能引起IB4肽能C 纖維芽生，這一變化可能是引起化療后疼痛產(chǎn)生的重要原因［6］。彌可保（甲鈷胺，McB）是包含鈷元素的一種維生素B12，對神經(jīng)組織有很強(qiáng)的親和作用。彌可保對神經(jīng)系統(tǒng)有著重要的功能，如，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)［7］。彌可保也可以顯著提高DNA 甲基化，并已有報道其可以調(diào)節(jié)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛［8］、神經(jīng)損傷［9］、慢性壓迫性神經(jīng)損傷所引起的痛覺過敏［10］或帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛［11］。目前彌可保用于治療糖尿病引起的周圍神經(jīng)病變［12］。但另一項研究報道，彌可保對腰椎狹窄引起的疼痛無效［13］。我們之前的研究報道，彌可保能防止長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，但其機(jī)制目前仍不清楚。脊髓背角C 纖維誘發(fā)電位被認(rèn)為是神經(jīng)病理性疼痛的突觸模型，在本部分內(nèi)容中，我們將研究預(yù)防性給予彌可保對長春新堿誘導(dǎo)的脊髓背角C 纖維誘發(fā)電位的影響，并進(jìn)一步觀察彌可保對脊髓背角核因子κB（NF-κB）信號通路激活的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗采用成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，180～200 g，購于中山大學(xué)實驗動物中心，動物的使用協(xié)議和動物處理程序獲得了中山大學(xué)實驗動物管理與使用委員會（IACUC）的批準(zhǔn)。動物被分籠飼養(yǎng)并能夠自由獲取標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物食物和水，室溫保持在（25 ± 1）℃，濕度保持在50%～60%，并處于12 h白天-黑夜循環(huán)照明的環(huán)境。所有的動物被隨機(jī)分配到不同的處理組。

1.2 藥品

長春新堿（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，中國）用無菌生理鹽水配成50 μg/mL，密封、遮光保存于4 ℃；以每天0.1 mg/kg 的劑量對大鼠腹腔注射上述長春新堿溶液，連續(xù)給藥10 d，每天1次［6］以建立化療藥物誘導(dǎo)的疼痛模型。彌可保注射液（0.5 mg/mL，衛(wèi)材株式會社，日本）密封、遮光保存于4 ℃。因化療性藥物誘導(dǎo)的疼痛治療難度大于預(yù)防性給藥，我們選擇于腹腔注射長春新堿造模前的15 d開始預(yù)先使用上述彌可保注射液對大鼠進(jìn)行預(yù)防性給藥，以1 mg/kg［14］的劑量每隔一天腹腔注射給藥1次，直到最后1 次長春新堿給藥后的第9 d（即第1次給長春新堿后19 d），如兩個藥物需要同一天給藥，則彌可保在長春新堿注射之前30 min給藥。具體給藥方式見圖1。

圖1 大鼠實驗分組給藥及其實驗情況Fig.1 The drug administration in different groups of rats and the experimental timeline

1.3 50%機(jī)械刺激撤足閾值測定

于測試前3 d將大鼠放置于透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境，每次20 min 以上，每天1 次。正式測試時待大鼠安靜后，采用Chaplan 等［15］提出的Up-Down 方法，選10 根強(qiáng)度呈對數(shù)遞增方式的纖維毛（von Frey hairs，3.84，4.08，4.17，4.31，4.56，4.74，4.93，5.07，5.18，5.46，Aesthesio，Italy）分別對大鼠后肢左右腳足心部進(jìn)行刺激，每次刺激持續(xù)時間為6～8 s。大鼠出現(xiàn)快速撤足和（或）舔足反應(yīng)則為撤足反應(yīng)陽性，如無出現(xiàn)則為撤足反應(yīng)陰性。以對數(shù)值3.84（壓力0.692 g）刺激強(qiáng)度為初始刺激強(qiáng)度，若撤足反應(yīng)為陰性則選用相鄰遞增的刺激強(qiáng)度的纖維毛繼續(xù)刺激，若撤足反應(yīng)為陽性則選擇相鄰遞減的刺激強(qiáng)度給予刺激。50%機(jī)械刺激撤足閾值的計算算式：50%機(jī)械刺激撤足閾值（50% Paw withdrawal threshold，式中Xf為最末次測試von Frey hair的對數(shù)值；k值可根據(jù)撤足反應(yīng)模式查表（Chaplan 等［15］提出的Up-Down 方法）得出；δ為10 根von Frey hair 間對數(shù)差值的均值。

1.4 電生理記錄和坐骨神經(jīng)刺激

在第19 d 分別取生理鹽水組、長春新堿組、長春新堿+彌可保組、生理鹽水+彌可保組的大鼠，每組5～7 只用烏拉坦（1.5 g/kg）腹腔注射麻醉；在腰4～6 間行椎板切除術(shù)，暴露脊髓腰膨大部位。游離左側(cè)坐骨神經(jīng)，使用雙極氯化銀電極刺激坐骨神經(jīng)。除用于記錄的脊髓節(jié)段外，暴露的神經(jīng)組織均用37 ℃石蠟油覆蓋。應(yīng)用本實驗室常規(guī)方法記錄脊髓背角C 纖維誘發(fā)電位，記錄方法如文獻(xiàn)所述［16］。通過氯化銀電極電刺激游離的坐骨神經(jīng)以誘發(fā)脊髓背角場電位。玻璃微電極（電阻0.5～1 MΩ）進(jìn)行細(xì)胞外記錄，用電控的微量推進(jìn)器（Narishige scientific instrument laboratory）將電極深度控制在脊髓表面以下300～500 μm。用數(shù)/模轉(zhuǎn)換器（ADC-42.PICO）以10 kHz 的速度處理和儲存數(shù)據(jù)。以C 纖維誘發(fā)電位的幅度作為參數(shù)。單方波（1～20 V，0.5 ms）刺激分離的左側(cè)坐骨神經(jīng)誘發(fā)脊髓背角場電位，記錄曲線穩(wěn)定后靜置15 min，隨后分別以1 V、2.5 V、5 V、7.5 V、10 V、12.5 V、15 V、20 V、26 V 的刺激強(qiáng)度，每個刺激強(qiáng)度刺激坐骨神經(jīng)3次，每次刺激間隔1 min，以記錄不同刺激強(qiáng)度對C纖維誘發(fā)場電位幅度的影響，坐骨神經(jīng)的刺激點到脊髓背角的記錄點距離約為10 cm。

1.5 免疫熒光實驗

分別取生理鹽水組、長春新堿造模組、長春新堿+彌可保組、生理鹽水+彌可保組的大鼠，經(jīng)腹腔注射烏拉坦（1.5 g/kg）麻醉后，剪開胸腔，灌注針經(jīng)心尖垂直插入左心室至主動脈，快速灌注生理鹽水300 mL，再用40 g/L 的多聚甲醛300 mL 灌注，解剖大鼠取出脊髓腰膨大段，再放入40g/L 的多聚甲醛中后固定1 h，隨后轉(zhuǎn)入30%蔗糖中脫水3 d。標(biāo)本經(jīng)蔗糖脫水后進(jìn)行冰凍切片（LEICA CM1900），脊髓切片厚度為25 μm，4 ℃短暫保存。收集脊髓冰凍切片后用0.01mol/L PBS 洗3 次，每次10 min，然后室溫下用免疫染色封閉液（Beyotime Biotechnology，China）作用于切片1 h。隨后加入對應(yīng)的一抗，分別為anti-calcitonin gene related peptide，anti-CGRP（1：200；rabbit；CST，USA），anti-phosphorylated NF-κB p65（Ser311；1：200；rabbit；Abcam，UK），anti-IL-10（1：100；rabbit；Abcam，UK），anti-NeuN（1：200；mouse；Abcam，UK），anti-GFAP（1：600；rabbit；Abcam，UK），anti-Iba-1（1：500；rabbit；Abcam，UK），搖床4℃孵育12 h，洗去一抗，用0.01M PBS 漂洗，每次10 min，共3 次，加入與一抗對應(yīng)的二抗，分別為Cy3-conjugated（1：400；Jackson ImmunoResearch，USA），Alexa 488-conjugated（1：500；Jackson ImmunoResearch，USA），避光室溫下慢搖1 h，隨后洗去二抗，再用0.01mol/L PBS 洗4次，每次10 min，隨機(jī)挑選切片貼于防黏附載玻片上，滴上含防熒光猝滅劑的封片液（Southern Biotech，USA）并用蓋玻片輕輕封片，防止氣泡產(chǎn)生。將制作好的玻片于4 ℃下避光晾干后立即于熒光顯微鏡（Leica DFC350 FX camera，Heidelberg，Germany）下觀察并拍照。組織切片免疫熒光染色結(jié)果的半定量分析使用Image Pro 軟件，計算每張切片上免疫陽性區(qū)域而獲得。隨機(jī)挑選5～6張切片的拍照結(jié)果，導(dǎo)入Image Pro 軟件分析陽性區(qū)域大小，用陽性區(qū)域的面積比上脊髓背角的總面積；以及計數(shù)脊髓背角神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，分別用p-p65 陽性細(xì)胞數(shù)比上神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目。

1.6 Western blot實驗

在第1、3、7、14 d 時，分別取生理鹽水組、長春新堿組的大鼠，每組5～7只用烏拉坦（1.5 g/kg）腹腔注射麻醉動物麻醉后，解剖大鼠并快速取出腰膨大段脊髓置于液氮中冷凍，然后加入SDS裂解液（Sigma-Aldrich，USA）（10 μL/mg）和蛋白磷酸酶抑制劑（Roche，Switzerland）勻漿并超聲破碎，13 600×g4 ℃離心后取上清液，上清用SDS-PAGE進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜（Sigma-Aldrich，USA）上。1%BSA室溫（Sigma-Aldrich，USA）封閉1 h，然后再在4℃環(huán)境下 與一抗（phosphorylated NF-κB p65；Ser311；rabbit；1：1 000；Abcam；UK or NF-κB p65；rabbit；1：1 000；Abcam；UK or β-actin；rabbit；1：1 000；Abcam；UK）一起輕搖孵育過夜。第2 天用TBST 洗4 遍，隨后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（goat anti-rabbit IgG，1：10 000；Abcam，UK）孵育1 h，TBST洗4遍，經(jīng)ECL發(fā)光液（Shanghai Epizyme Biomedical Technology，China）顯色曝光，再經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon，China）內(nèi)置CCD 攝像頭拍攝顯影條帶，使用Image-Pro Plus 軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。對每個目的條帶進(jìn)行總灰度值的分析，并用β-actin的總灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

通過graphpad 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（means ± SEM）表示。首先用Shapiro-Wilk 檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，P＞0.05被認(rèn)為符合正態(tài)分布。二組計量資料的均數(shù)比較，如果每一組資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性，組間比較采用t檢驗，反之用秩和檢驗；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。多組數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）繼以Tukey 檢驗。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 連續(xù)腹腔注射長春新堿引起機(jī)械痛敏

與手術(shù)前基礎(chǔ)值比較，腹腔注射長春新堿（vincristine，VCR，0.1mg·kg-1/day，1 次/天，連續(xù)注射10 d）引起大鼠雙側(cè)后肢50%機(jī)械刺激撤足閾值顯著下降。如圖2 A 所示，注射長春新堿后第4 d，同側(cè)后肢的50% 機(jī)械刺激撤足閾值已由術(shù)前的25.67 g 降至6.52 g（Mann-WhitneyU檢驗，Z=-2.032，P=0.042），之后持續(xù)維持在比較低的水平，術(shù)后19 d 時仍然維持在低水平（Mann-WhitneyU檢驗，Z=-2.023，P=0.043），對側(cè)后肢的50%機(jī)械刺激撤足閾值的變化與同側(cè)后肢類似，說明腹腔注射長春新堿可引起大鼠雙側(cè)后肢長時間的機(jī)械痛覺過敏。

2.2 彌可保抑制長春新堿引起的脊髓背角病理性突觸可塑性的發(fā)生

C 纖維介導(dǎo)的突觸傳遞效率的增強(qiáng)與疼痛密切相關(guān)，其表現(xiàn)為脊髓背角C 纖維誘發(fā)場電位幅值的增大。如圖2 B，我們發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比，長春新堿造模組大鼠在第19 d時（從第一次給長春新堿算起），脊髓背角C 纖維誘發(fā)場電位幅值在給予坐骨神經(jīng)5 V 或10 V 單次電刺激時均顯著增大。值得注意的是，坐骨神經(jīng)給予5 V 的單次電刺激時，長春新堿造模組的大鼠可被誘發(fā)C 纖維誘發(fā)場電位（0.018 ± 0.008）mV，而生理鹽水對照組、生理鹽水+彌可保組和長春新堿+彌可保組幾乎不能誘發(fā)C-纖維誘發(fā)場電位。如圖2 C，當(dāng)刺激強(qiáng)度從5 V 逐漸增大到12.5 V 時，同一強(qiáng)度的刺激在長春新堿組大鼠誘發(fā)的C 纖維誘發(fā)場電位的幅值明顯大于生理鹽水組。與生理鹽水組相比，當(dāng)刺激強(qiáng)度為12.5 V 時，長春新堿組大鼠誘發(fā)的C 纖維誘發(fā)場電位的幅值明顯增大（Z=-2.371，P=0.016）；而長春新堿+彌可保組大鼠C纖維誘發(fā)場電位幅值明顯小于長春新堿組（Z=-2.611，P=0.008），單獨給予彌可保組大鼠C 纖維誘發(fā)場電位幅值也明顯小于長春新堿組（Z=-2.627，P=0.009）。以上結(jié)果說明長春新堿處理可能導(dǎo)致了C 纖維介導(dǎo)的突觸傳遞效率的增強(qiáng)；而預(yù)防性給予彌可保能夠緩解長春新堿的上述作用，單獨使用彌可保也能降低C 纖維誘發(fā)場電位的幅值，說明彌可?？赡軐φ游锏幕A(chǔ)痛閾也有影響。

圖2 腹腔注射長春新堿引起大鼠雙側(cè)后肢50%機(jī)械刺激撤足閾值顯著下降和各組大鼠C纖維誘發(fā)場電位的記錄情況Fig.2 Intraperitoneal injection of vincristine decreased the 50%paw withdrawal threshold in bilateral hindpaw in rats and the C-fiber evoked field potential recordings

2.3 彌可保抑制長春新堿引起的脊髓背角CGRP纖維芽生

如圖3 所示，與生理鹽水組（圖3 A）相比，長春新堿給藥第19 d 時，大鼠脊髓背角CGRP 陽性纖維的數(shù)目明顯增多（圖3 C，E；Z=-2.611，P=0.008），而給予彌可保（長春新堿給藥前15 d 即開始給藥，持續(xù)到最后一次長春新堿給藥結(jié)束后9 d）可顯著減少脊髓背角CGRP 的纖維數(shù)目（圖3 D，E；Z=-2.611，P=0.008），提示抑制CGRP 纖維芽生可能是抑制脊髓背角C 纖維誘發(fā)電位長時程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。彌可保慢性處理對正常大鼠脊髓背角CGRP 陽性纖維的數(shù)目無顯著影響（圖3 B，E；Z=-1.984，P=0.056）。

圖3 腹腔注射彌可?？梢种崎L春新堿引起的脊髓背角CGRP陽性C纖維增多Fig.3 Intraperitoneal injection of McB inhibited the sprouting of CGRP positive C-fibers in the spinal dorsal horn induced by vincristine

2.4 彌可保防止長春新堿引起的脊髓背角NF-κB信號通路的激活

NF-κB 由p65 或p50 組成。p65 作為NF-κB 通路的主要部分，p-p65 表達(dá)的增加反映了NF-κB 的激活，NF-κB p65 激活之前需要磷酸化將其錨定到細(xì)胞核中特定的目標(biāo)基因。NF-κB 也被報道可以調(diào)節(jié)一些致炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而在CIPN 中發(fā)揮重要作用［6］。因此我們用蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光方法觀察了彌可保對脊髓背角p-p65 表達(dá)的影響，以此觀察對NF-κB 通路激活的影響。Western Blot 結(jié)果表明，長春新堿造模組第14 d 時大鼠脊髓背 角p-p65 的表達(dá) 顯著增加（圖4A，F(xiàn)（4，20）=16.90，P＜0.000 1；單因素方差分析繼以Tukey′s 多重比較）。免疫熒光雙染結(jié)果顯示，p-p65 在NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元（圖4 B，D，K）、Iba1 標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞（圖4 E，G，K）及GFAP 標(biāo)記的星型膠質(zhì)細(xì)胞都有表達(dá)（圖4 H，J，K）。與生理鹽水組（圖4 L）相比，長春新堿造模組大鼠在第19 d 時p-p65 表達(dá)增加（圖4 M）。以上結(jié)果表明無論是神經(jīng)元還是膠質(zhì)細(xì)胞的NF-κB 通路在給予長春新堿后都被激活。進(jìn)一步的實驗表明，給予彌可?？娠@著減少長春新堿（第19 d）脊髓背角神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)p-p65 的表達(dá)（圖4 K-N，Mann-WhitneyU檢驗，Z=-2.611，P=0.008），說明彌可保抑制了NFκB通路的激活。

圖4 腹腔注射彌可?？梢种崎L春新堿引起的脊髓背角p-p65表達(dá)增多Fig.4 Intraperitoneal injection of McB inhibited the up-regulation of p-p65 in the spinal dorsal horn induced by vincristine

IL-10 作為一種抗炎細(xì)胞因子，也可以抑制如IL-1β、TNF-α 和IL-6 等多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［17］。我們觀察到與生理鹽水組相比（圖5 A，D），長春新堿組給藥后第19 d 時脊髓背角IL-10 的表達(dá)顯著降低（圖5 B，D，Mann-WhitneyU檢驗，Z=-2.611，P=0.009），而給予彌可保組大鼠其脊髓背角抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)明顯上調(diào)（圖5 C，D，Mann-WhitneyU檢驗，Z=-2.402，P=0.0159）。在生理鹽水組，免疫熒光雙染顯示IL-10 只表達(dá)在神經(jīng)元（圖5 E-G），在星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖5 H-J）及小膠質(zhì)細(xì)胞（圖5 K-M）沒有觀察到IL-10的表達(dá)。

圖5 預(yù)先給予彌可?？赡孓D(zhuǎn)長春新堿引起的脊髓背角IL-10表達(dá)減少Fig.5 Pretreatment with McB reversed the decrease of IL-10 in the spinal dorsal horn after vincristine treatment

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)預(yù)防性使用彌可保顯著抑制了長春新堿誘導(dǎo)的脊髓背角C 纖維誘發(fā)場電位的增大。同時，彌可保抑制了脊髓背角CGRP 纖維的增多及NF-κB 通路的激活，并且增加了IL-10的表達(dá)。這些結(jié)果表明，彌可保通過抑制NF-κB通路的激活及糾正炎性細(xì)胞因子失衡防止中樞敏感化。

傷害性刺激可導(dǎo)致坐骨神經(jīng)C 纖維與脊髓背角形成的突觸傳遞效率顯著增強(qiáng)。表現(xiàn)為脊髓背角神經(jīng)元的興奮性持續(xù)性增高，即形成了中樞敏感化，這可能是產(chǎn)生持續(xù)性疼痛的重要原因之一［18］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)腹腔注射彌可保（維生素B12 的一種活性結(jié)構(gòu)）可防止長春新堿誘導(dǎo)的脊髓背角C 纖維誘發(fā)電位LTP，提示彌可?？赏ㄟ^防止中樞敏感化起作用。除此之外，長春新堿處理也可引起外周敏感化［19］，即導(dǎo)致初級傳入纖維的自發(fā)活動（異位放電）［20］，這也是引起神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵因素［21］。最近的一項研究表明，彌可保可以顯著地抑制CCD 大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的異位自發(fā)放電［22］。在本研究中，彌可保為腹腔注射，其可以通過血液循環(huán)到達(dá)全身各處組織，包括背根神經(jīng)節(jié)，因此彌可保也有可能通過防止外周敏感化起作用。

化療藥物長春新堿的使用常常會導(dǎo)致病理性疼痛。傳導(dǎo)慢性疼痛的C 纖維分為表達(dá)IB4非肽能纖維和表達(dá)CGRP 肽能兩大類。我們之前的研究表明，長春新堿可引起脊髓背角CGRP 肽能C 纖維芽生，但不能引起IB4非肽能C 纖維芽生。這一變化可能是引起化療后疼痛產(chǎn)生的重要原因［6］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)彌可?？梢苑乐笴GRP 肽能C纖維芽生。這可能是彌可保減弱痛覺過敏的重要原因。

NF-κB 通路的激活可以使致炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β 和IL-6 等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄增多，其被證明參與了長春新堿誘導(dǎo)的痛覺過敏和痛覺異常的發(fā)展［23］。因此，減少炎性因子的生成被認(rèn)為是防止病理性疼痛的有效手段，彌可保和天竺葵的合用已被報道可以通過減少TNF-α 的生成減緩泰素誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變［24］。而我們之前的Western blot 實驗也表明彌可保可減少TNF-α 在脊髓背角的表達(dá)量［14］。在本研究中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，彌可?？梢栽诩顾璞辰且种芅F-κB p65的磷酸化，提示彌可?？赏ㄟ^抑制NF-κB 減少致炎細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-10 是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，在給予長春新堿后其表達(dá)顯著下調(diào)，而彌可保則可以增加IL-10 的表達(dá)。與之一致的是，鞘內(nèi)注射IL-10 基因治療藥物可以抑制泰素誘導(dǎo)的機(jī)械觸誘發(fā)痛敏［25］。以上結(jié)果提示彌可?？赡芡ㄟ^平衡致炎與抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，改善神經(jīng)元生存的局部微環(huán)境，進(jìn)而抑制神經(jīng)病理性疼痛。

除了彌可保單獨使用外，其通常還與維生素E等其他藥物聯(lián)合使用［26］。在2 型糖尿病引起的周圍神經(jīng)病變中，彌可保、α-硫辛酸和普瑞巴林的聯(lián)合使用比單獨使用普瑞巴林提供了更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用［27］。因此彌可保與其他藥物聯(lián)合使用可能比單獨應(yīng)用更加有效。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與生理鹽水處理相比較，單獨慢性給予彌可保可顯著下調(diào)刺激C 纖維誘發(fā)場電位的幅度，說明彌可保本身對正常狀態(tài)下C纖維與脊髓背角感覺細(xì)胞的突觸傳遞可能有抑制作用，提示其對治療急性疼痛可能也有效。但在之前的相關(guān)研究中，我們發(fā)現(xiàn)單獨使用彌可保對正常大鼠對脊髓后角相關(guān)炎性指標(biāo)IL-10 及TNF-α 的表達(dá)并無顯著影響［13］，在本研究中單獨使用彌可保對正常大鼠CGRP 表達(dá)也無顯著影響。綜合判斷，我們推測彌可保抑制正常情況下突觸傳遞的功能可能不是通過抑制脊髓背角炎性指標(biāo)所進(jìn)行的。有研究報道高濃度彌可?？梢苑€(wěn)定局部細(xì)胞膜內(nèi)外離子通道，降低細(xì)胞膜內(nèi)外離子濃度差，減少動作電位產(chǎn)生，從而抑制異位放電［22］。我們推測彌可?？赡芡ㄟ^抑制突觸前動作電位的發(fā)放進(jìn)而抑制了C 纖維神經(jīng)遞質(zhì)，包括谷氨酸和ATP 向脊髓背角的釋放，具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步實驗探討。

綜上所述，本研究證明預(yù)防性使用彌可?？娠@著抑制長春新堿誘導(dǎo)的脊髓背角C 纖維誘發(fā)場電位的增大。同時，彌可保抑制了脊髓背角CGRP 纖維的芽生及NF-κB 通路的激活，并且增加了IL-10的表達(dá)。