E3泛素-蛋白連接酶Parkin介導(dǎo)線粒體自噬參與荷瘤小鼠心肌損傷

鄧世杰，李興會(huì)，蔡衛(wèi)斌

（1.廣東省疾病模式動(dòng)物工程技術(shù)研究中心//中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東廣州 510006；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，廣東廣州 510080）

癌癥患者生存率的提高往往伴隨其他系統(tǒng)損傷。癌后心血管病是幸存癌癥患者中易發(fā)和致死原因之一［1］。癌后心血管損傷不僅可由癌癥治療手段引起，腫瘤本身也能直接導(dǎo)致［2-4］。在抗癌治療前，癌癥患者心肌損傷標(biāo)志物如NT-proBNP，MR-proANP 水平升高與死亡率密切相關(guān)［5-6］。因此，研究荷瘤狀態(tài)下心肌損傷的原因顯得尤為重要。心臟是高耗能器官，富含線粒體，心肌細(xì)胞線粒體通過(guò)氧化磷酸化生成ATP 為心臟提供能量。線粒體自噬是一種特異性清除受損線粒體的自噬現(xiàn)象，在正常情況下，心肌細(xì)胞通過(guò)線粒體自噬途徑清除受損線粒體，是機(jī)體控制線粒體質(zhì)量的重要途徑。E3 泛素-蛋白連接酶Parkin（E3 ubiquitin ligase Parkin）是由park2基因編碼的蛋白質(zhì)，最初的研究發(fā)現(xiàn)park2基因缺失能夠引起帕金森病。Parkin 含有465 個(gè)氨基酸殘基、相對(duì)分子質(zhì)量為52 000，其N(xiāo) 端與泛素同源，稱(chēng)為泛素樣結(jié)構(gòu)域。Parkin 廣泛表達(dá)于腦、心臟等組織器官，主要游離在胞質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞受刺激時(shí)，Parkin 會(huì)在線粒體外膜上大量聚集，并與泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素分子一起泛素化修飾受損線粒體外膜蛋白，啟動(dòng)自噬清除異常的線粒體。Parkin 轉(zhuǎn)移到線粒體上是啟動(dòng)線粒體自噬的關(guān)鍵。Parkin 在心臟中表達(dá)水平較高，其介導(dǎo)的線粒體自噬對(duì)于心臟功能維持有重要作用［7，8］。許多研究闡述了Parkin 蛋白在各器官的功能，包括證明PINK1-Mfn2-Parkin 途徑是線粒體質(zhì)量控制的最佳通路之一［9］，Parkin 缺失使得其對(duì)心肌損傷敏感性增加［10］。此外，Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬途徑是完成圍產(chǎn)期心臟發(fā)育的基礎(chǔ)［11］。這些研究均提示，Parkin 與維持心臟生理穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬是否參與荷瘤狀態(tài)下心肌損傷是值得探討的重要科學(xué)問(wèn)題。基于此，本研究將使用移植瘤模型小鼠研究荷瘤狀態(tài)心肌損傷特征與線粒體損傷特征，并使用park2-/-小鼠研究Parkin 與荷瘤狀態(tài)心肌損傷之間的關(guān)系及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試 劑 Masson 染色試劑盒購(gòu)自SolarBio公司，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒與BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于Millipore 公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記（HRP）的抗鼠二抗與抗兔二抗購(gòu)于Cell Signaling Technology 公司，Parkin 抗體、LC3 抗體購(gòu)于Abcam公司，內(nèi)參GAPDH 抗體為BioTech 公司，F(xiàn)luo-3 探針、Rhod-2 探針購(gòu)于翊圣生物，DHE-ROS 探針購(gòu)于南京建成，JC-1 探針購(gòu)于碧云天，B16 黑色素瘤購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，普通小鼠飼料購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，戊巴比妥鈉購(gòu)自Sigma公司。其余試劑均為分析純。

1.1.2 設(shè)備小動(dòng)物超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)型號(hào)為Vevo?3100，qPCR 儀型號(hào)為ABI QuantStudio 6，顯影儀型號(hào)為Bio-Rad Chemidoc MP，透射電子顯微鏡型號(hào)為T(mén)ecnai G2Spirit Twin。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0029），SPF 級(jí)park2-/-小鼠（B6.129S4-Prkntm1Shn/J，Strain #006582）購(gòu)于Jax 實(shí)驗(yàn)室。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和處理嚴(yán)格遵守中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心管理要求。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及相關(guān)操作獲得中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：SYSU-IACUC-2021-000574）。

1.2 方法

1.2.1park2-/-小鼠篩選與鑒定 3周齡小鼠鼠尾酚氯仿法抽提基因組DNA 用于PCR 鑒定。通過(guò)PCR鑒定小鼠基因型，引物序列使用JAX LAB 中B6.129S4-Prkntm1Shn/J（Strain #006582）小鼠的鑒定方法條目。Western Blot 檢測(cè)Parkin 蛋白表達(dá)水平，篩選出park2-/-小鼠子代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與飼喂 動(dòng)物房嚴(yán)格按照《GB14925-2010動(dòng)物實(shí)驗(yàn)間的環(huán)境技術(shù)指標(biāo)》執(zhí)行晝夜明暗交替時(shí)間為12/12 h，室內(nèi)溫度（22±2）℃，濕度（55±5）%，小鼠自由采食和飲水。將12 只C57BL/6J 小鼠和12 只park2-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，分別隨機(jī)分為2 組（group control，group TB），飼養(yǎng)普通飼料（chow diet，CD）直至觀察終點(diǎn)。

1.2.3 小鼠皮下移植瘤模型建立 選取6～8 周齡小鼠進(jìn)行荷瘤前適應(yīng)性喂養(yǎng)。B16 黑色素瘤細(xì)胞復(fù)蘇后穩(wěn)定傳代2 代，待生長(zhǎng)穩(wěn)定后使用濃度為2.5 g/L 的胰蛋白酶消化，離心后棄去上層液體后使用生理鹽水重懸，調(diào)整密度為每毫升5.0 ×106個(gè)細(xì)胞。將小鼠用左手大拇指和食指捏住頸部皮膚，然后將鼠尾用左手無(wú)名指和小指固定于左手大魚(yú)際。將右側(cè)腋窩用體積分?jǐn)?shù)75% 酒精消毒3次。右手持吸有腫瘤細(xì)胞和生理鹽水混合液的注射器，在右側(cè)腋窩的位置進(jìn)針，注意不要突破腹膜，將針頭保持于皮下位置。然后近水平位置將針頭幾乎完全插入皮下，將混有腫瘤細(xì)胞注射入皮下（腫瘤細(xì)胞量約1×106個(gè)），快速退針，左手食指輕壓針孔約1 min 后將小鼠放回飼養(yǎng)籠中。皮下移植瘤操作完成后計(jì)作荷瘤第0 天（Day 0）。對(duì)照組小鼠在相同部位進(jìn)行等體積生理鹽水皮下注射操作。

1.2.4 小鼠心臟超聲檢查操作 喂養(yǎng)至觀察時(shí)間點(diǎn)（Day 14）后，對(duì)各組進(jìn)行小動(dòng)物心臟超聲檢測(cè)其功能學(xué)數(shù)據(jù)分析。使用異氟烷氣體麻醉小鼠后，呈仰臥位固定于超聲動(dòng)物區(qū)，帶上異氟烷面罩。對(duì)探測(cè)區(qū)域涂抹脫毛膏進(jìn)行脫毛處理并暴露皮膚，在動(dòng)物皮膚或探頭上涂抹獸用專(zhuān)用耦合劑。調(diào)整動(dòng)物平板角度與地面呈10 °，使小鼠頭高腳低位，小鼠心率保持450 次/min 以上。垂直探頭使聲束垂直進(jìn)入小鼠胸壁，調(diào)整獲得小鼠心臟超聲圖像，將探頭帶標(biāo)記段左右旋轉(zhuǎn)5°～10°，并旋動(dòng)動(dòng)物平板旋鈕移動(dòng)動(dòng)物x 軸，找到使探頭長(zhǎng)軸與小鼠左室長(zhǎng)軸平行的位置，取得滿(mǎn)意的左心室長(zhǎng)軸圖像。選取左心室長(zhǎng)軸圖像標(biāo)準(zhǔn)為流出道與心尖部清晰且呈直線聯(lián)通、可見(jiàn)開(kāi)閉的二尖瓣。保持上述體位及動(dòng)物心率，探頭帶標(biāo)記端向左旋轉(zhuǎn)90°再次進(jìn)行探測(cè)，調(diào)整動(dòng)物平板旋鈕移動(dòng)y 軸，獲得滿(mǎn)意的左心室短軸圖像。選取左心室短軸圖像的標(biāo)準(zhǔn)為：心腔最大位、可見(jiàn)清晰的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的乳頭肌。

1.2.5 小鼠組織取樣操作 處死前禁食不禁水8 h，稱(chēng)重，使用濃度為30 g/L 的戊巴比妥鈉麻醉。分離心臟組織，剪開(kāi)右心耳，于心尖處使用PBS 灌注至流出液清澈。將心臟剪下后置于PBS 中洗凈擦干，部分置于40 g/L 多聚甲醛固定進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，部分剪塊置于-80 ℃保存。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析 用含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液裂解組織，提取心臟組織總蛋白，并用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。各組蛋白樣品上樣量均為40 μg，SDS-PAGE 電泳分離樣品，240 V 恒流冰上電轉(zhuǎn)120 min，將PVDF 膜置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%BSA 封閉液中室溫封閉1 h。使用相應(yīng)的一抗按照說(shuō)明書(shū)稀釋后4 ℃孵育過(guò)夜。室溫孵育二抗2 h，ECL 發(fā)光法顯影，顯影條帶用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.7 心臟冰凍切片染色 使用40 g/L 多聚甲醛固定心臟組織，梯度蔗糖脫水后使用OCT包埋。切成厚度為5～6 μm的切片放入-80 ℃保存。HE染色前取出切片室溫復(fù)溫30 min，PBS 洗去OCT 后使用蘇木素染色3～10 min。流水沖洗后使用鹽酸乙醇分化3 s，流水沖洗后使用伊紅染色5 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明后封片觀察。Masson染色步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。免疫熒光染色前復(fù)溫30min，洗去OCT，0.1%曲拉通破膜5 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%BSA 封閉1 h，配置相應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，室溫孵育二抗1 h，hoechst封片劑封片觀察。

1.2.8 免疫熒光染色 Fluo-3 探針、Rhod-2 探針、DHE-ROS 探針及JC-1 探針使用方法均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.9 原代心肌細(xì)胞提取及共培養(yǎng) 使用2.5 g/L的胰蛋白酶過(guò)夜消化新鮮收集的乳鼠心臟，輕柔吹打分離新鮮心肌細(xì)胞后六孔板中培養(yǎng)至70%滿(mǎn)，隨即使用孔徑為0.04 μm 的共培養(yǎng)小室架于板孔上方，小室內(nèi)提前培養(yǎng)1 mL 復(fù)蘇后穩(wěn)定傳代2 代的B16 黑色素瘤細(xì)胞，培養(yǎng)密度為2.0×106個(gè)/mL。共培養(yǎng)24 h后收獲心肌細(xì)胞樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

1.3.1 PCR分析基因型 3周齡小鼠鼠尾酚氯仿法抽提基因組DNA用于PCR鑒定小鼠基因型。park2引物序列使用JAX LAB 中B6.129S4-Prkntm1Shn/J（Strain#006582）小鼠的鑒定方法條目。具體引物序列如下：Common：5’-GCAGAATTACAGCAGTTACCTGG-3’，WT：5’-CCTACACAGAACTGTGACCTGG-3’，KO：5’-ATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCG-3’。若park2被完全敲除即純合子，PCR 僅擴(kuò)增出500 bp 條帶；若為雜合子，PCR 擴(kuò)增出500 bp 和250 bp 兩條帶；野生型小鼠，PCR 僅擴(kuò)增出250 bp條帶。

1.3.2 心臟超聲數(shù)據(jù)分析指標(biāo) 檢測(cè)方法參照1.2.3 步驟。采集心臟長(zhǎng)軸左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimensions，LVDs）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimensions，LVDd）、左心室收縮末期容積（left ventricular end-systolic volume，LVVs）、左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVVd）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）、縮短分?jǐn)?shù)（fractional shortening，F(xiàn)S）、左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness，LVAW）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPW）。

1.3.3 蛋白質(zhì)免疫印跡分析 ECL 發(fā)光法顯影，顯影條帶用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算不同組別樣品中Parkin和LC3 Ⅱ/LC3 I的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 心臟冰凍切片染色 鏡下拍攝不同組別小鼠心臟HE染色圖像與Masson染色圖像。

1.3.5 免疫熒光染色 Fluo-3 探針、Rhod-2 探針、DHE-ROS 探針及JC-1 探針使用方法均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。使用熒光顯微鏡對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行拍攝，使用Image J軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.3.6 透射電子顯微鏡拍攝 制樣流程與上機(jī)流程由技術(shù)員操作。圖像采集觀察不同組別小鼠心肌細(xì)胞線粒體數(shù)量、形態(tài)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤小鼠心功能損傷和心肌細(xì)胞線粒體異常

皮下移植瘤Day12 后荷瘤狀態(tài)小鼠及對(duì)照組小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)差異，荷瘤組體質(zhì)量高于對(duì)照組，說(shuō)明腫瘤組織生長(zhǎng)明顯，小鼠總體質(zhì)量增加（12 d：t=2.236，P=0.049；14 d：t=7.050，P=0.000 035；圖1 A）；對(duì)荷瘤狀態(tài)小鼠及對(duì)照組小鼠進(jìn)行心臟功能檢測(cè)，結(jié)果顯示荷瘤Day14 小鼠LVDs 與LVVs 較對(duì)照組增 大（LVDs：t=2.985，P=0.041；LVVs：t=3.391；P=0.028；圖1 C、E），EF 與FS 較對(duì)照組降低（EF：t=4.934，P=0.007 9；FS：t=5.677；P=0.004 8；圖1 G、H），而LVAW 及LVPW 改變無(wú)明顯差異（圖1 I、J），表明荷瘤狀態(tài)引起心臟射血功能下降、心臟收縮功能損傷，而心室壁結(jié)構(gòu)的改變并不明顯；采集心臟組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，鏡下HE 染色及Masson染色顯示荷瘤Day 14小鼠較對(duì)照組小鼠心臟組織形態(tài)無(wú)明顯改變（圖1 K），透射電鏡結(jié)果顯示荷瘤Day 14小鼠心肌細(xì)胞線粒體出現(xiàn)空泡化，空泡化線粒體數(shù)量增多（t=3.240；P=0.032），線粒體大小差異較大，可見(jiàn)新生的長(zhǎng)條狀線粒體（圖1 L）。以上數(shù)據(jù)提示在荷瘤狀態(tài)下，心肌細(xì)胞線粒體發(fā)生損傷，并激活機(jī)體代償性生成線粒體。

圖1 荷瘤小鼠心功能損傷并伴隨心肌線粒體改變Fig.1 Impaired function and mitochondrial alterations of cardiomyocyte in tumor-bearing mice

2.2 荷瘤誘發(fā)心肌細(xì)胞線粒體損傷

JC-1 用于檢測(cè)線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，△Ψm）的熒光探針。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成可發(fā)生紅色熒光的聚合物（polymer）；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1 不能聚集在線粒體基質(zhì)，此時(shí)JC-1 為可發(fā)生綠色熒光的單體（monomer），通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP）是一種氧化磷酸化抑制劑，可使電子傳遞鏈的質(zhì)子濃度梯度解偶聯(lián)，消除線粒體膜電位，損傷線粒體。原代心肌細(xì)胞JC-1 染色結(jié)果顯示，荷瘤共培養(yǎng)心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降（t=5.028；P=0.007 3；圖2 A-B），膜電位穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體出現(xiàn)損傷；心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)游離鈣離子［c（Ca2+）］濃度（圖2 C-D）與心肌細(xì)胞線粒體鈣離子濃度［m（Ca2+）］濃度（圖2 E-F）較對(duì)照組升高［c（Ca2+）：t=8.705；P＜0.000 1；m（Ca2+）：t=8.269；P＜0.000 1）］，荷瘤共培養(yǎng)心肌細(xì)胞出現(xiàn)了鈣超載與線粒體鈣超載現(xiàn)象，提示線粒體出現(xiàn)不可逆損傷；荷瘤狀態(tài)心肌細(xì)胞DHE 平均熒光密度較對(duì)照組升高（t=6.329；P=0.0032；圖2 G-H），荷瘤狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)ROS 含量升高，可能心肌細(xì)胞線粒體損傷有關(guān)。

圖2 荷瘤狀態(tài)心肌細(xì)胞線粒體損傷Fig.2 Mitochondrial damage in cardiomyocytes with tumor-bearing

2.3 荷瘤狀態(tài)下心肌細(xì)胞線粒體相關(guān)因子表達(dá)改變

檢測(cè)荷瘤Day14 小鼠及對(duì)照組心臟組織線粒體生成相關(guān)因子tfam 和nrf1、線粒體融合相關(guān)因子opa1 和mfn2、線粒體分裂相關(guān)因子fis1、線粒體自噬相關(guān)因子park2 等。數(shù)據(jù)顯示，荷瘤小鼠心臟組織中nrf1、opa1、mfn2 及tfam 表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)（nrf1：t=3.210；P=0.032 6；opa1：t=9.860；P=0.000 6；mfn2：t=5.447；P=0.005 5；tfam：t=29.48；P＜0.000 1；圖3 A-C，F(xiàn)），提示荷瘤可刺激線粒體融合過(guò)程，并增加了線粒體合成；此外，荷瘤狀態(tài)下park2 表達(dá)水平上調(diào)（t=6.868；P=0.002 4；圖3 E），心肌細(xì)胞線粒體自噬增強(qiáng)。結(jié)合上述結(jié)果，提示荷瘤可引起心肌損傷激活機(jī)體線粒體自噬進(jìn)程，促進(jìn)線粒體的生成以及受損線粒體的清除。

圖3 荷瘤狀態(tài)心肌細(xì)胞線粒體相關(guān)因子改變Fig.3 Alterations of mitochondria-related factors in cardiomyocytes with tumor bearing

2.4 荷瘤誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體自噬增強(qiáng)

進(jìn)一步分析細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)分子Parkin及LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達(dá)水平。數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組相比，荷瘤Day 14小鼠心臟組織Parkin 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。同時(shí)，在自噬形成時(shí)，胞漿型LC3 水解形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ跟磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變膜型LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。利用Western Blot 檢測(cè)荷瘤小鼠心臟組織LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達(dá)，并分析LC3-Ⅱ/Ⅰ比值。數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組相比，荷瘤小鼠心臟中Parkin 表達(dá)水平升高（t=6.223；P=0.000 8；圖4 AB），同時(shí)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高（t=6.063；P=0.000 9；圖4 A，C），提示荷瘤狀態(tài)可激活機(jī)體線粒體自噬途徑，促進(jìn)受損線粒體清除，維持細(xì)胞內(nèi)部線粒體穩(wěn)定性。Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬與荷瘤狀態(tài)心肌損傷之間存在相關(guān)性。

圖4 荷瘤狀態(tài)心肌細(xì)胞線粒體自噬增強(qiáng)Fig.4 Enhanced mitophagy in cardiomyocytes with tumor bearing

2.5 Park2-/-小鼠荷瘤后心功能下降顯著

為了研究Parkin 與荷瘤心肌損傷之間的關(guān)系，我們建立了park2-/-小鼠荷瘤模型。采用PCR 鑒定和篩選park2-/-小鼠，PCR 產(chǎn)物鑒定方法參照J(rèn)AX LAB 中B6.129S4-Prkntm1Shn/J（Strain #006582）小鼠的鑒定方法條目，具體如下：純合子為500 bp 條帶，雜合子同時(shí)有500 bp 和250 bp 的條帶，野生型小鼠只有250 bp 條帶（圖5 A）。Western Blot 檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，park2-/-小鼠心臟組織Parkin 蛋白水平明顯低于野生型小鼠（t=5.056；P=0.007 2；圖5 B）。免疫熒光共定位結(jié)果顯示park2-/-小鼠心肌細(xì)胞中Parkin蛋白表達(dá)水平低于野生型小鼠（圖5 C-D）。

Park2-/-小鼠荷瘤后（park2-/-+TB）死亡率增加（圖5 E）。對(duì)存活小鼠進(jìn)行小動(dòng)物心臟超聲功能檢測(cè)，結(jié)果顯示正常生理情況下park2-/-小鼠心臟射血功能無(wú)明顯差異（圖5 L-M）；park2-/-+TB 組小鼠LVD 及LVV 均上升（LVDs：t=10.43，P=0.000 5vs.park2-/-mice，t=6.572，P=0.002 8vs.TB mice；LVDd：t=4.857，P=0.004 6vs.park2-/-mice，t=3.945，P=0.010 9vs.TB mice；LVVs：t=5.705，P=0.002 3vs.park2-/-mice，t=6.784，P=0.000 3vs.TB mice；LVVd：t=4.265，P=0.008 0vs.park2-/-mice，t=3.536，P=0.016 6vs.TB mice；圖5 H-K），EF 與FS顯著降低（EF：t=8.650，P=0.000 3vs.park2-/-mice，t=3.063，P=0.028 0vs.TB mice；FS：t=8.032，P=0.000 5vs.park2-/-mice，t=2.805，P=0.037 8vs.TB mice；圖5 L-M），提示park2-/-小鼠在荷瘤狀態(tài)下心臟功能受損更明顯。Parkin 通過(guò)介導(dǎo)線粒體自噬參與對(duì)細(xì)胞內(nèi)受損線粒體的清除，敲除Parkin 加劇了荷瘤狀態(tài)心肌損傷。

圖5 Park2-/-小鼠荷瘤后心功能損傷加重Fig.5 Aggravation of cardiac functional impairment in park2-/-mice with tumor bearing

2.6 Park2-/-小鼠荷瘤后線粒體損傷加劇

對(duì)WT，park2-/-，TB 以及park2-/-+TB 四組使用JC-1 探針進(jìn)行電位檢測(cè)及電鏡觀察。JC-1 探針熒光計(jì)算方法見(jiàn)2.2 項(xiàng)。原代心肌細(xì)胞JC-1 探針染色結(jié)果顯示park2-/-組生理情況下線粒體膜電位出現(xiàn)下降（t=12.24；P=0.000 3vs.WT-Control mice），park2-/-+TB 組小鼠膜電位下降更加顯著（t=5.080，P=0.007 1vs.park2-/-mice，t=6.479，P=0.002 9vs.TB mice；圖6 A-B）；組織電鏡結(jié)果顯示park2-/-小鼠生理情況下線粒體出現(xiàn)明顯空泡化，嵴斷裂等損傷特征，荷瘤后park2-/-小鼠線粒體損傷程度更明顯，可見(jiàn)線粒體空泡化加?。▓D6 C）。

圖6 Park2-/-小鼠荷瘤后線粒體損傷加劇Fig.6 Exacerbated mitochondrial damage in park2-/-mice with tumor bearing

2.7 Park2-/-小鼠線粒體自噬受到抑制

Western Blot 分析數(shù)據(jù)顯示，與Tumor Bearing相比，park2-/-+TB 小鼠心臟組織中Parkin 蛋白缺失（t=10.07；P＜0.000 1；圖7 A-B）。進(jìn)一步分析LC3B Ⅱ和LC3B I 表達(dá)水平，數(shù)據(jù)顯示，與TB 組相比，park2-/-+TB 小鼠心臟LC3 Ⅱ/LC3 I 比值明顯下降（t=5.082；P=0.002 3；圖7 A，C），敲除Parkin，線粒體自噬途徑受抑制，進(jìn)一步提示線粒體自噬參與了荷瘤心肌損傷的病理生理過(guò)程。

圖7 park2-/-小鼠線粒體自噬受到抑制Fig.7 Reduced mitophagy in park2-/-mice

3 討論

E3 泛素-蛋白連接酶Parkin 通過(guò)其介導(dǎo)線粒體自噬的途徑參與多種病理過(guò)程［12，13］。由于心臟是個(gè)高耗能器官，富含線粒體，因此當(dāng)線粒體損傷或功能異常，會(huì)影響心功能發(fā)生改變，這種改變與心血管損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。線粒體自噬是一種特異性清除損傷線粒體的自噬現(xiàn)象，在正常情況下，心肌細(xì)胞通過(guò)線粒體自噬途徑清除受損線粒體，是機(jī)體控制線粒體質(zhì)量的重要途徑。目前已有許多研究闡述Parkin 蛋白對(duì)機(jī)體發(fā)育、特別是心臟發(fā)育過(guò)程中的作用，并有研究指出Parkin 通過(guò)其PINK1-Mfn2-Parkin 途徑介導(dǎo)的線粒體自噬完成心肌細(xì)胞線粒體的轉(zhuǎn)換，使其能量利用由葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅幔?1］。但對(duì)于Parkin 蛋白對(duì)心臟功能的影響目前尚未完全確定，部分研究指出Parkin 缺失在正常成年小鼠中不引起疾病表型，但是在MI 模型中park2-/-小鼠對(duì)損傷的敏感性更強(qiáng)，心功能受損程度更重［14］；另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)park2-/-小鼠在圍產(chǎn)期心臟發(fā)育具有調(diào)控意義，park2-/-或?qū)е轮滤佬缘男募〔“l(fā)生［11］，由此可見(jiàn)，Parkin 蛋白在心臟損傷過(guò)程中具有一定的作用。本研究以荷瘤狀態(tài)下出現(xiàn)的心功能下降為切入點(diǎn)［3］，驗(yàn)證前述報(bào)道中荷瘤狀態(tài)能夠引起心功能下降，移植瘤模型小鼠LVDs 與LVVs 上升，心功能EF 與FS 下降，出現(xiàn)了心功能減退表型，進(jìn)一步病理觀察顯示心肌細(xì)胞線粒體發(fā)生損傷，同時(shí)通過(guò)關(guān)鍵分子分析，發(fā)現(xiàn)以Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬為主的線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)與荷瘤狀態(tài)心肌損傷過(guò)程之間具有明顯相關(guān)性，因此使用park2-/-小鼠進(jìn)一步研究Parkin 與荷瘤狀態(tài)心肌損傷的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Parkin 蛋白缺失時(shí)，荷瘤小鼠死亡率升高，心功能受損更嚴(yán)重，鏡下線粒體損傷加重。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是在荷瘤狀態(tài)下，由于包括ROS增加在內(nèi)的多種原因，心肌細(xì)胞線粒體受損，心功能下降，激活以線粒體自噬為主的線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)，對(duì)受損線粒體進(jìn)行清除與新生線粒體補(bǔ)充來(lái)抑制損傷進(jìn)一步加重；在Parkin 蛋白缺失時(shí)，park2-/-小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬受到抑制，無(wú)法及時(shí)清除受損線粒體，引起受損線粒體逐漸增多，外加異常的活性氧（ROS）［2，10，15］產(chǎn)生等多種原因引起心肌細(xì)胞損傷加重，從而引起心功能受損加劇。

此外，盡管部分研究提出Parkin 蛋白的缺失在成年小鼠中不引起疾病表型，但PINK1-Mfn2-Parkin途徑在介導(dǎo)線粒體自噬的過(guò)程中起著非常重要的作用［16］，并且在park2-/-成年小鼠中，線粒體表現(xiàn)得更為小而排列混亂，并且隨著時(shí)間推移會(huì)出現(xiàn)異常的密集電子包裹體［11，14］。結(jié)合先前對(duì)Parkin 的研究，Parkin 蛋白在維持正常的線粒體形態(tài)以及防止異常的活性氧（ROS）產(chǎn)生中具有重要作用［2］。并且在成熟個(gè)體內(nèi)，即使Parkin 蛋白的表達(dá)缺失，也能通過(guò)其他的補(bǔ)償機(jī)制進(jìn)行更復(fù)雜的線粒體質(zhì)量控制。而在發(fā)育期內(nèi)，Parkin 作為線粒體轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵分子，對(duì)于心臟發(fā)育具有重要調(diào)控意義［11］。胚胎期心臟對(duì)生物能的要求較低，因此與成年期心臟以脂肪酸和氨基酸為能量底物不同，胚胎期心臟通過(guò)保留這些脂肪酸和氨基酸成分，用以提供發(fā)育所需的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)成分。因此，在胎兒心臟中，ATP 主要是通過(guò)代謝葡萄糖產(chǎn)生的。出生后的心肌細(xì)胞代謝模式轉(zhuǎn)變對(duì)游離脂肪酸的傾向性［17］，在此時(shí)期，心臟基因表達(dá)的特征性變化促成了使用葡萄糖的胎兒線粒體被“重新編程”為可代謝脂肪酸的成熟線粒體［11，18，19］。結(jié)合腫瘤本身特殊的代謝模式（Warburg 效應(yīng)），我們不能否認(rèn)腫瘤特殊的代謝模式會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生影響，引起心肌細(xì)胞代謝改變。因此，特殊的代謝模式可能引起心肌細(xì)胞內(nèi)功能受損的結(jié)構(gòu)腫脹的線粒體大量堆積無(wú)法清除，無(wú)法負(fù)擔(dān)大量用于心臟搏動(dòng)的能量消耗，引起心功能損害。但荷瘤狀態(tài)心肌損傷、Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬與心肌細(xì)胞代謝改變?nèi)咧g的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。