慢性晝夜節(jié)律紊亂實(shí)驗(yàn)動物造模及其致病機(jī)制研究進(jìn)展*

劉薇薇 于 洋 聞德亮

(中國醫(yī)科大學(xué)健康科學(xué)研究院，沈陽 110122)

生物鐘或稱晝夜節(jié)律，是生物體以適應(yīng)環(huán)境周期性變化而形成的內(nèi)在節(jié)律。當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時，身體可以通過感知外部線索(主要是光)來重新調(diào)整自己的生物鐘。生物鐘主要包括中央生物鐘和外圍生物鐘。中央生物鐘位于下丘腦的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)，被認(rèn)為是晝夜節(jié)律的主要起搏器，通過感知環(huán)境中的光并整合信息形成24 h晝夜節(jié)律。此外，位于SCN的中央生物鐘通過激素或突觸將信號傳遞給外周生物鐘，控制身體的晝夜節(jié)律。外周生物鐘廣泛分布在腸道、胰腺、心臟、肝、骨骼肌和腎等組織中，在晝夜節(jié)律中部分受中樞生物鐘控制，同時它有自己的振蕩器來調(diào)節(jié)各種組織器官的功能[1-3]。大多數(shù)生物鐘成分是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，研究最廣泛的時鐘基因包括Bmal1(brain and muscle arnt like protein1，Bmal1)、Clock(circadian locomotor output cycles kaput，Clock)、Per1/2/3(Periods1/2/3，Per)和Cry1/2(Cryptochromes1/2，Cry)[4]。除了光，膳食營養(yǎng)[5-6]，睡眠[7]和運(yùn)動[8]都會影響生物鐘的調(diào)節(jié)作用。已知晝夜節(jié)律紊亂會導(dǎo)致包括代謝性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展，而其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，本文總結(jié)了多個晝夜節(jié)律紊亂實(shí)驗(yàn)動物模型便于相關(guān)研究的開展及機(jī)制深入探討。

1 晝夜節(jié)律紊亂動物模型構(gòu)建

1.1 核心生物鐘基因敲除的干預(yù)模型

哺乳動物生物鐘由幾個核心的時鐘基因組成，包括Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2，它們的蛋白質(zhì)產(chǎn)物對于晝夜節(jié)律的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)至關(guān)重要[4]，任何核心時鐘基因的敲除都會破壞晝夜節(jié)律生理機(jī)能，進(jìn)而導(dǎo)致晝夜節(jié)律紊亂。采用晝夜核心基因敲除來構(gòu)造晝夜節(jié)律紊亂模型如：(1)Per突變倉鼠模型：如第一個被鑒定為晝夜節(jié)律突變體的哺乳動物是Per突變體倉鼠，與野生型24 h節(jié)律相比，它的晝夜節(jié)律為20 h[9]；(2) 肝細(xì)胞特異性Bmal1基因敲除小鼠模型和同窩小鼠對照研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1肝細(xì)胞特異性基因敲除小鼠表現(xiàn)為肝糖原合成功能紊亂[10]；(3) 化學(xué)試劑或藥物誘導(dǎo)Bmal1缺失小鼠模型，小鼠接受每天3次4 mg 他莫昔芬的腹腔注射，會導(dǎo)致Bmal1的缺失小鼠模型；(4) 通過物理射線方式誘導(dǎo)Bmal1缺失小鼠模型，使用伽馬射線照射可得到Bmal1功能喪失小鼠突變體[11]。Bmal1-/-的小鼠會改變葡萄糖和胰島素的分泌[12-13]，增加循環(huán)脂肪酸的濃度，從而導(dǎo)致肝和骨骼肌中形成異位脂肪[14]，因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，可選擇不同手段針對不同的晝夜核心時鐘基因進(jìn)行動物造模。

1.2 光照位移誘導(dǎo)中央生物鐘紊亂模型

SCN中央生物鐘是整個生物鐘的核心部分，處于獨(dú)立自我維持振蕩器層次結(jié)構(gòu)的頂部，光是SCN中央生物鐘最主要的外部影響因素[1]。光信息直接從含有內(nèi)在光敏性黑視蛋白的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞通過視網(wǎng)膜下丘腦束到達(dá)SCN, 然后通過神經(jīng)、體液和系統(tǒng)信號的組合將信息傳遞到大腦和身體的其余部分，帶動外周時鐘[15]。外部光照條件頻繁變化會損害中央分子生物鐘適應(yīng)穩(wěn)定節(jié)奏的能力，因此可采用不同光照位移誘導(dǎo)中央生物鐘紊亂來構(gòu)造慢性晝夜節(jié)律紊亂小鼠模型：(1) 單純光照前移模型：如在Thaiss實(shí)驗(yàn)中，通過嚴(yán)格明暗循環(huán)照明，使8～9周的C57BL/6J小鼠具有穩(wěn)定的晝夜節(jié)律，然后進(jìn)行每3 d 8 h的光照相位的位移，模擬8 h的時差情況[16]；(2) 混合類型光照位移模型：Herrero的實(shí)驗(yàn)[17]中分3組進(jìn)行不同方式的光照位移，高級組每5 d相位提前6 h，延遲組每5 d相位延遲6 h，高級-延遲組每5 d交替進(jìn)行6 h 的相位提前和延遲。結(jié)果顯示，3組中只有高級組的血清葡萄糖、胰島素和瘦素水平最先下降，同時高級組的運(yùn)動活動節(jié)律表現(xiàn)出最大改變，組織學(xué)檢查顯示脂質(zhì)積聚，并顯示棕色脂肪白色化，通過分析棕色脂肪與白色脂肪相關(guān)代謝物以及基因的表達(dá)顯示高級組小鼠有明顯肥胖趨勢。由此說明不同的光線強(qiáng)度與波長也可能引起不同程度的時鐘紊亂。

1.3 改變食物種類誘導(dǎo)晝夜節(jié)律紊亂模型

高脂肪飲食(high fat diet，HFD)可調(diào)控晝夜節(jié)律基因、調(diào)節(jié)時鐘轉(zhuǎn)錄因子的核受體和參與下丘腦、肝和大腦中燃料利用的時鐘控制基因的表達(dá)，因此可通過高脂肪飲食進(jìn)行時鐘紊亂動物造模。如將4周齡的小鼠隨機(jī)分為普通飲食和高脂肪飲食(45%熱量來自脂肪，20% 熱量來自蛋白質(zhì)，以及35%熱量來自碳水化合物)，喂食6周，結(jié)果表明，高脂肪飲食可以延長小鼠自由活動的時間，同時減弱了飲食行為的晝夜模式，與正常飲食小鼠相比，高脂飲食小鼠在光照期間攝食增加而黑暗期間攝食減少，機(jī)制分析認(rèn)為高脂飲食破壞了外周時鐘基因表達(dá)和功能核激素受體的24 h表達(dá)模式，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)核受體和下游代謝通路在肝與脂肪細(xì)胞的外周生物鐘中不再同步，證明高脂飲食造成晝夜節(jié)律紊亂[18]。

1.4 改變進(jìn)食行為影響晝夜節(jié)律紊亂模型

調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律振蕩器不僅存在于SCN中，也存在于大多數(shù)外周組織中，可以通過限時進(jìn)食誘導(dǎo)外圍節(jié)律振蕩。使用10至16周齡的小鼠[19]，保持每天12 h正常光照時間，將小鼠隨機(jī)分為白天喂食(早上6點(diǎn)到下午6點(diǎn)進(jìn)食)，夜間喂食(下午6點(diǎn)到第2天早上6點(diǎn)進(jìn)食)。發(fā)現(xiàn)限制進(jìn)食會特別影響肝晝夜節(jié)律和膽固醇7α羥化酶、糖原合成酶、糖原磷酸化酶mRNA的積累，并對除肝以外其他臟器，如腎、心臟、胰腺等器官生物鐘也產(chǎn)生了影響。而對SCN的體內(nèi)電生理記錄測量分析發(fā)現(xiàn)，SCN起搏器的相位沒有任何改變。因此，改變進(jìn)食時間會導(dǎo)致外圍晝夜節(jié)律振蕩器與中央SCN起搏器分離，并且不對中央起搏器產(chǎn)生影響。

2 晝夜節(jié)律紊亂參與生理信號調(diào)控

2.1 晝夜節(jié)律系統(tǒng)參與維持能量穩(wěn)態(tài)

大約10% 的哺乳動物轉(zhuǎn)錄組顯示晝夜節(jié)律振蕩[20]。在已鑒定的節(jié)律基因中，許多基因在協(xié)調(diào)營養(yǎng)代謝方面具有特定作用[21]。例如，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和胰高血糖素受體，以及參與糖代謝和膽固醇生物合成的多種酶，代謝相關(guān)的激素，如胰高血糖素、胰島素、生長素釋放肽、瘦素和皮質(zhì)酮都會有節(jié)奏地表達(dá)和振蕩[22]。下丘腦內(nèi)有節(jié)律性控制促食欲信號，包括神經(jīng)肽Y、甘丙肽和阿片黑素前體等協(xié)調(diào)代謝信號的關(guān)鍵區(qū)域。

2.2 生物鐘核心基因的破壞影響新陳代謝

Bmal1-/-小鼠增加循環(huán)脂肪酸的濃度，導(dǎo)致在肝和骨骼肌中形成異位脂肪。當(dāng)Bmal2-/-的Bmal-/-小鼠的節(jié)律性得到恢復(fù)時，胰島素分泌與活動模式也會相繼恢復(fù)[23]。此外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中回補(bǔ)Bmal1可以恢復(fù)運(yùn)動活動節(jié)律，但不會改變新陳代謝的節(jié)奏[24]。這表明外周組織中的破壞對于代謝變化很重要。Per2基因的單一破壞會改變葡萄糖穩(wěn)態(tài)，擾亂進(jìn)食和糖皮質(zhì)激素節(jié)律，并導(dǎo)致體質(zhì)量顯著增加[25]。

2.3 外周組織中時鐘功能的喪失影響新陳代謝

改變肝和骨骼肌中的時鐘基因表達(dá)會損害葡萄糖加工并改變胰島素分泌[26]。胰腺Bmal1的缺失會降低其胰島素分泌能力，這與小鼠活動或進(jìn)食節(jié)律變化無關(guān)。肝特異性Bmal1缺失小鼠在禁食階段表現(xiàn)出低血糖、過度的葡萄糖清除和肝葡萄糖調(diào)節(jié)基因的節(jié)律性表達(dá)喪失[27-28]。脂肪細(xì)胞中Bmal1的缺失會改變?nèi)粘＿M(jìn)食節(jié)律并導(dǎo)致肥胖[29]。

3 晝夜節(jié)律紊亂引起疾病的發(fā)病機(jī)制

3.1 晝夜節(jié)律紊亂對中樞神經(jīng)類疾病的影響

晝夜節(jié)律紊亂的直接表現(xiàn)是睡眠的改變，研究發(fā)現(xiàn)Cry1與核心生物鐘基因的顯性編碼變異相關(guān)，轉(zhuǎn)錄抑制Clock和Bmal1表達(dá)，Cry1基因突變會導(dǎo)致延長晝夜節(jié)律的周期，從而導(dǎo)致延遲睡眠障礙[30]。晝夜節(jié)律和睡眠障礙也是各種神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志，如阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病[31]。Bmal1缺失小鼠呈現(xiàn)顯著的神經(jīng)退行性疾病表型，包括嚴(yán)重的自發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、氧化損傷增加、突觸變性、腦功能連接受損、學(xué)習(xí)和記憶受損、海馬神經(jīng)發(fā)生改變和癲癇閾值降低[32]。相關(guān)機(jī)制可能有以下幾個方面: (1) 破壞晝夜節(jié)律功能可能會使大腦更容易遭受氧化損傷，從而加劇氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元死亡。(2) 由于生物鐘紊亂引起的炎性反應(yīng)，促使星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞容易發(fā)生神經(jīng)變性。(3) 晝夜節(jié)律時鐘振蕩使蛋白質(zhì)的蛋白酶體降解，也表現(xiàn)出相應(yīng)的振蕩節(jié)律，生物鐘節(jié)律紊亂同時也抑制了大腦通過自噬清除病原性蛋白質(zhì)、預(yù)防神經(jīng)變性的功能[33]。

3.2 晝夜節(jié)律紊亂對心血管類疾病的影響

在心臟中，大約13%的基因和8%蛋白質(zhì)的表達(dá)具有節(jié)律性[34]。每天心肌細(xì)胞依次經(jīng)歷3個階段：(1) ATP 生成階段以促進(jìn)活動期的收縮功能；(2) 活動期結(jié)束時的營養(yǎng)儲存階段；(3) 生長/修復(fù)階段/ 睡眠期[35]。動物分子鐘的中斷會導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管疾病，例如，小鼠中的Bmal1敲除會導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病，降低每搏輸出量和射血分?jǐn)?shù)，并導(dǎo)致小鼠心力衰竭[36]。生物鐘還通過調(diào)節(jié) Kruppel樣因子15的節(jié)律，將心臟中的離子平衡控制在健康范圍內(nèi)，缺乏或過度都會增加室性心律失常易感性[37]。

3.3 晝夜節(jié)律紊亂對胰腺的損傷

研究發(fā)現(xiàn)胰島中的時鐘中斷會導(dǎo)致胰島素釋放不足和2型糖尿病。在離體胰腺分化的β細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)被抑制的晝夜節(jié)律信號會嚴(yán)重阻斷肽胞吐作用并導(dǎo)致胰島素釋放不足[38]。此外，晝夜節(jié)律紊亂會加重糖尿病患者基礎(chǔ)胰島素分泌障礙[39]。在飲食誘導(dǎo)肥胖下，β細(xì)胞特異性過表達(dá)Bmal1，會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)出現(xiàn)增強(qiáng)的胰島生物鐘振幅，改善肥胖及相關(guān)代謝性疾病[40]。

3.4 晝夜節(jié)律紊亂對肝的損傷

線粒體動力學(xué)(特別是分離融合和線粒體自噬)受晝夜節(jié)律的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器Bmal1調(diào)控[41]。當(dāng)生物鐘的Bmal1功能喪失會導(dǎo)致肝中的線粒體腫脹，無法適應(yīng)不同的營養(yǎng)條件，并伴隨呼吸減弱和氧化應(yīng)激升高，進(jìn)一步發(fā)展為脂肪肝與胰島素抵抗。生物鐘紊亂還會加劇乙醇介導(dǎo)的肝糖原代謝紊亂，同時也表明長期飲酒會擾動肝生物鐘破壞糖原代謝各個方面的時間依賴性變化，加速脂肪肝的發(fā)展[42]。

3.5 晝夜節(jié)律紊亂對腸道的損傷及腸道菌群失調(diào)的影響

晝夜節(jié)律會導(dǎo)致多種消化系統(tǒng)疾病。研究發(fā)現(xiàn)損傷的腸道組織再生依賴于Bmal1，Bmal1可調(diào)控TNF-α和p21等的合成與表達(dá)，Bmal1缺失會導(dǎo)致腸道的持續(xù)惡化[43]。腸道菌群是寄居在人體腸道內(nèi)的微生物群，人體腸道內(nèi)寄生的細(xì)菌數(shù)目40萬億個，基因總數(shù)約為人自身基因數(shù)目的150倍。自主神經(jīng)系統(tǒng)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)胃腸道生物學(xué)過程，如免疫激活、腸道通透性、腸道微生物豐度等[44]。晝夜節(jié)律失調(diào)導(dǎo)致腸上皮屏障的破壞[45]。此外，腸上皮屏障完整性也受氧化應(yīng)激、飲食成分、腸道微生物群和微生物代謝物的影響。腸道中的酶活性和營養(yǎng)吸收能力會隨著晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)而變化。Thaiss通過對小鼠進(jìn)行每3 d光照相移的改變，模擬人們經(jīng)歷8 h時差改變，同時每4 h采集糞便進(jìn)行16 s以及宏基因組學(xué)測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷光照位移小鼠糞便菌群的種類與豐富度發(fā)生顯著改變，隨后將糞便移植到無菌小鼠體內(nèi)觀察發(fā)現(xiàn)小鼠體質(zhì)量明顯增加，證明了節(jié)律紊亂通過微生物而影響機(jī)體代謝過程從而引起菌群的改變[16]。從結(jié)構(gòu)上看，黏液層密度的晝夜波動也會影響與黏膜相關(guān)的微生物群落的組成，黏液層越靠近結(jié)腸末端越致密，其厚度有節(jié)律性波動[46]。微生物群通過晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子NFIL3調(diào)節(jié)身體成分，NFIL3控制晝夜節(jié)律脂質(zhì)代謝程序性表達(dá)并調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞中的脂質(zhì)吸收和輸出，其晝夜節(jié)律振蕩的幅度由微生物群通過先天淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞生物鐘控制。對于特異性NFIL3敲除小鼠擾亂了腸道菌群對于脂質(zhì)攝取的調(diào)節(jié)和儲存，從而引起肥胖、糖尿病和心血管疾病等代謝疾病的發(fā)生[47]。

4 小結(jié)

事實(shí)上，機(jī)體的大多數(shù)代謝過程都受到晝夜振蕩的影響，現(xiàn)代社會許多外部環(huán)境的影響加劇了晝夜節(jié)律的紊亂，對人們的健康產(chǎn)生嚴(yán)重后果。通過構(gòu)建相關(guān)實(shí)驗(yàn)小鼠模型我們建立起了在生物鐘與代謝紊亂之間的分子聯(lián)系，在研究晝夜紊亂、疾病與腸道菌群相互影響的疾病機(jī)制研究中，可以結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等多組學(xué)研究方法，找出與疾病相關(guān)的上下游機(jī)制，并找出影響代謝的靶細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物，通過相應(yīng)抗生菌或益生菌的應(yīng)用來減輕慢性晝夜紊亂給機(jī)體帶來的影響。