槐芩軟膏介導(dǎo)NF-kB信號(hào)通路對(duì)小鼠痔瘡模型肛緣水腫及創(chuàng)面愈合的影響*

趙俊卿 范榮榮 竇龍濤 房 磊 李少榮 彭 冀 王 茜

(1.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院普外二科，邢臺(tái) 054000)(2.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院藥品調(diào)劑科,邢臺(tái) 054000) (3.邢臺(tái)市內(nèi)丘縣人民醫(yī)院外四科,邢臺(tái) 054000)(4.河北中醫(yī)學(xué)院,石家莊 050200)

痔瘡是一種常見(jiàn)的由肛管血管墊的支持結(jié)構(gòu)、靜脈叢、動(dòng)靜脈吻合支發(fā)生病變或下移及齒線遠(yuǎn)側(cè)靜脈叢病理性擴(kuò)張或血栓形成導(dǎo)致的臨床多發(fā)病[1]。痔瘡發(fā)病過(guò)程中伴隨著大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，形成局部炎性反應(yīng)灶，引發(fā)壞死潰爛等。痔瘡主要臨床癥狀表現(xiàn)為肛周疼痛、瘙癢以及肛緣水腫[1-2]。目前臨床上輕度患者治療方法主要是采用藥物治療，而針對(duì)病情嚴(yán)重的內(nèi)痔和混合痔患者，手術(shù)切除是常用的治療方式[3]。雖然手術(shù)治療能有效緩解病情，但是手術(shù)后肛緣水腫、疼痛以及切口愈合慢等嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此，探究新型輔助痔瘡手術(shù)治療進(jìn)而改善患者預(yù)后的藥物受到了廣泛關(guān)注。近些年研究表明，中藥在痔瘡的治療過(guò)程中展現(xiàn)較好的療效[4]?；避塑浉啵涑煞质腔苯?炒)、赤芍、牡丹皮、當(dāng)歸、防風(fēng)、枳殼、黃芩、制川烏。具有清熱止血，消腫止痛的功效，是一種常用痔瘡治療藥物，用于Ⅰ、Ⅱ期內(nèi)痔或混合痔治療。但是槐芩軟膏對(duì)痔瘡術(shù)后肛周疼痛及水腫的影響尚不得知。本研究在小鼠痔瘡模型上，探究痔術(shù)后使用槐芩軟膏治療對(duì)肛緣水腫和創(chuàng)面愈合的作用效果及機(jī)制，為臨床上痔術(shù)后槐芩軟膏的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

10周齡雄性ICR小鼠30只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，槐芩軟膏(山東中大千方制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20150074)；hs-CRP、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(R&D System公司)；Hemoglobin ELISA試劑盒(Abcam公司)；山羊血清(中杉金橋有限公司)；兔抗小鼠Ly6G抗體和大鼠抗小鼠F4/80抗體(Abcam公司)；兔抗小鼠IkBα、兔抗小鼠磷酸化IkBα、兔抗小鼠p65抗體、兔抗小鼠GAPDH抗體、兔抗小鼠Lamin B1抗體(Abcam公司)；ECL發(fā)光液(賽默飛世爾公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠痔瘡模型及治療方法：在30只10周齡雄性ICR小鼠肛門內(nèi)0.5 cm處推注0.05 mL 20%乙酸溶液。24 h后，具有肛周腫脹、白色潰爛面現(xiàn)象的小鼠即為造模成功小鼠[2]，總共24只。造模成功小鼠被隨機(jī)分成兩組，即對(duì)照組和治療組，每組12只。治療組小鼠在肛周組織使用低濃度高錳酸鉀溶液清洗，然后涂抹槐芩軟膏，每日1次，連續(xù)7 d；對(duì)照組小鼠給予低濃度高錳酸鉀清洗。

1.2.2小鼠肛緣水腫及創(chuàng)面愈合面積評(píng)估：末次給藥24 h后，對(duì)小鼠肛緣水腫進(jìn)行打分，無(wú)水腫為0分，勉強(qiáng)可見(jiàn)為1分，邊緣高于皮膚為2分，明顯腫脹為3分；創(chuàng)面愈合率參照參考文獻(xiàn)[5]測(cè)量創(chuàng)傷面積，并計(jì)算創(chuàng)面愈合率。愈合率=(原始創(chuàng)面面積-當(dāng)前創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積。

1.2.3ELISA檢測(cè)hs-CRP、IL-6、TNF-α 水平及hemoglobin含量：末次給藥24 h后，分別取治療組和對(duì)照組小鼠外周血及肛緣組織。采用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血漿中hs-CRP、IL-6、TNF-α水平及組織中血紅蛋白hemoglobin含量，具體方法參照hs-CRP、IL-6、TNF-α，hemoglobin ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4Real-time：PCR檢測(cè)肛緣組織IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平：末次給藥24 h后，取兩組小鼠肛緣組織。使用RIPA裂解液裂解組織，采用Trizol法提取組織中RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用qPCR小鼠肛緣組織IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平。IL-6 qPCR引物：上游5′-AGCCAGACGAGGCATGTT TA-3′，下游5′-TGGCTGGAGCTTGACACAAA-3′；TNF-α qPCR引物：上游5′-AGGCGGGCTAGTTAGCATTC-3′，下游5′-GGCCTTGGATGATAATGCAC-3′。

1.2.5肛緣組織HE染色和免疫熒光：末次給藥24 h后，取兩組小鼠(每組12只)肛緣組織。采用10%甲醛溶液固定組織24 h，然后將固定的組織脫水，石蠟包埋，制備石蠟切片。將制備的石蠟切片進(jìn)行HE染色和免疫熒光染色。取石蠟切片，脫蠟、固定，山羊血清進(jìn)行封閉，然后分別使用抗Ly6G抗體和抗F4/80抗體對(duì)組織中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行染色，洗片后再使用二抗室溫孵育1 h；DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，每個(gè)樣本選取10個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞面積灰度值，然后取10個(gè)視野平均值，統(tǒng)計(jì)每組炎性細(xì)胞所占面積。

1.2.6Western blot檢測(cè)肛緣組織IkBα及NF-kB p65水平：末次給藥24 h后，取兩組小鼠肛緣組織，使用核蛋白提取試劑盒對(duì)肛緣組織漿蛋白和核蛋白進(jìn)行分離提取。收集提取液，加入蛋白上樣緩沖液，SDS-PAGE跑膠、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)印蛋白的膜用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，之后抗小鼠IkBα抗體(1∶1 000)、小鼠磷酸化IkBα抗體、抗小鼠GAPDH(1∶1 000)抗體、抗小鼠NF-kB p65抗體(1∶1 000)及抗小鼠Lamin B1抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育12 h，然后使用HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，最后加入ECL發(fā)光液曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 槐芩軟膏對(duì)小鼠肛水腫及創(chuàng)面愈合的影響

治療7 d后，治療組小鼠肛緣水腫評(píng)分相比于對(duì)照組顯著降低，創(chuàng)面愈合面積及愈合率相比于對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 槐芩軟膏對(duì)小鼠肛水腫及創(chuàng)面愈合的影響Table 1 Effects of Huaiqin ointment on anal edema and wound healing in mice

2.2 槐芩軟膏治療對(duì)小鼠外周血中炎性因子的影響

治療7 d后，治療組小鼠血漿中hs-CRP、IL-6、TNF-α水平相比于對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血漿hs-CRP、IL-6、TNF-α水平變化Table 2 Changes of plasma hs-CRP, IL-6 and TNF-α levels in each group

2.3 槐芩軟膏治療對(duì)小鼠模型肛緣組織中血紅蛋白以及炎性因子表達(dá)的影響

治療7 d后，結(jié)果顯示，治療組肛緣組織中血紅蛋白Hemoglobin表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；real-time PCR顯示治療組肛緣組織中炎性因子IL-6、TNF-α mRNA水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠模型治療后肛緣組織血紅蛋白以及炎性因子水平變化Table 3 Changes of hemoglobin and inflammatory factors in anal border tissue after treatment in each group

2.4 槐芩軟膏治療對(duì)小鼠模型肛緣組織病理學(xué)影響

治療7 d后，病理染色結(jié)果顯示，治療組肛緣組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著少于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 槐芩軟膏治療對(duì)小鼠模型肛緣組織病理學(xué)的影響Fig.1 Effect of Huaiqin ointment on histopathology of anal margin in mouse model

2.5 槐芩軟膏治療對(duì)小鼠模型肛緣組織中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

小鼠治療7 d后，免疫熒光染色顯示治療組肛緣組織中中性粒細(xì)胞(圖2A～B)和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2C～D)顯著少于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：A. 中性粒細(xì)胞免疫熒光代表圖，藍(lán)色：細(xì)胞核，綠色：中性粒細(xì)胞；B. 中性粒細(xì)胞面積定量結(jié)果；C. 巨噬細(xì)胞免疫熒光代表圖，藍(lán)色：細(xì)胞核，紅色：巨噬細(xì)胞；D. 巨噬細(xì)胞面積定量結(jié)果。與對(duì)照組比較，*P<0.01Note：A. Neutrophil immunofluorescence diagram, blue: nucleus, green: neutrophil; B. Quantitative results of neutrophil area; C. Macrophage immunofluorescence representative diagram, blue: nucleus, red: macrophage; D. Quantitative results of macrophage area. Compared with the control group,*P<0.01圖2 槐芩軟膏治療對(duì)小鼠模型肛緣組織中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響Fig.2 Effect of Huaiqin ointment treatment on neutrophil and macrophage infiltration in anal border tissue of mouse model

2.6 槐芩軟膏治療對(duì)小鼠模型肛緣組織NF-kB信號(hào)通路的影響

小鼠治療7 d后，Western blot顯示治療組肛緣組織中IkBα磷酸化及核內(nèi)NF-kB p65水平顯著少于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

注：A. 組織IkBa磷酸化及核內(nèi)NF-kB p65含量；B. Western blot條帶定量結(jié)果，與對(duì)照組比較，*P<0.01Note: A. Phosphorylation of tissue IkBα and nuclear NF-kB p65 content; B. Quantitative results of Western blot bands,*P<0.01 compared with the control group圖3 槐芩軟膏治療對(duì)小鼠模型肛緣組織IkBα磷酸化及核內(nèi)NF-kB p65含量的影響Fig.3 Effects of Huaiqin ointment treatment on the phosphorylation of IkBα and the content of nuclear NF-kB p65 in anal border tissue of mouse model

3 討論

痔瘡是臨床常見(jiàn)的肛腸疾病，根據(jù)痔核發(fā)生的位置可將其分為內(nèi)痔、外痔和混合痔。針對(duì)病情嚴(yán)重的痔瘡患者，手術(shù)是主要治療方式，但是手術(shù)后患者發(fā)生的肛緣水腫給患者帶來(lái)巨大的精神痛苦，且肛緣組織水腫充血嚴(yán)重減緩了手術(shù)切口的愈合、增加感染機(jī)會(huì)[6]。因此，痔術(shù)后使用合理有效藥物治療進(jìn)而緩解手術(shù)引發(fā)的肛緣水腫是十分有意義的。由于肛門齒線附近的豁膜下層細(xì)小的動(dòng)脈和靜脈以直接吻合方式相連接而形成洞狀靜脈，而且痔外靜脈叢與痔內(nèi)靜脈叢的細(xì)小分支也是互通的，所以痔手術(shù)伴隨著對(duì)血管、淋巴管的離斷及對(duì)局部組織的機(jī)械性創(chuàng)傷，造成局部炎性反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)齒線附近的淋巴、血液回流受阻進(jìn)而引發(fā)水腫[7-8]。因此，活血化瘀、抑制炎性反應(yīng)是用于痔術(shù)后治療用藥的主要特征。

槐芩軟膏，其成分是槐角(炒)、赤芍、牡丹皮、當(dāng)歸、防風(fēng)、枳殼、黃芩、制川烏。本研究使用槐芩軟膏對(duì)模擬痔術(shù)小鼠模型術(shù)后肛緣水腫及創(chuàng)面愈合的作用效果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)使用槐芩軟膏治療7 d后，小鼠的肛緣水腫評(píng)分和創(chuàng)面愈合情況相比于對(duì)照組得到顯著改善。由于水腫組織血管通透性增加，會(huì)出現(xiàn)血液滲出現(xiàn)象，血液滲出現(xiàn)象跟水腫嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此，我們通過(guò)檢查肛緣組織中血紅蛋白含量來(lái)檢測(cè)肛緣組織水腫的嚴(yán)重程度[9]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)槐芩軟膏治療能夠顯著降低肛緣組織中血紅蛋白含量，表明槐芩軟膏治療能夠顯著改善模型小鼠肛緣水腫現(xiàn)象。槐角具有清熱瀉火、涼血止血，黃芩瀉火解毒、止血、清熱燥濕等功效；赤芍、牡丹皮、當(dāng)歸、黃芩均具有清熱涼血、活血散瘀等功效[10-12]。因此，促進(jìn)肛緣組織血管血液流通可能是槐芩軟膏改善痔術(shù)后肛緣水腫的主要機(jī)制。

炎性反應(yīng)在痔瘡發(fā)病過(guò)程、痔術(shù)后肛緣水腫的恢復(fù)及創(chuàng)面愈合過(guò)程中扮演重要角色。研究表明，痔瘡患者血清中炎性因子水平與患者痔瘡病情呈正相關(guān)[13-14]。由于手術(shù)創(chuàng)傷，痔術(shù)后患者機(jī)體處于炎性反應(yīng)狀態(tài)，痔瘡病情本身可引起出血、感染而促發(fā)炎性反應(yīng)，手術(shù)引起的創(chuàng)傷可進(jìn)一步加劇炎性反應(yīng)程度[15]。hs-CRP是急性期反應(yīng)蛋白，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)或感染時(shí)會(huì)急速上升；IL-6、TNF-α是常見(jiàn)的炎性反應(yīng)細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，在痔瘡及痔術(shù)后患者體內(nèi)hs-CRP、IL-6和TNF-α顯著升高[15]。本研究發(fā)現(xiàn)使用槐芩軟膏治療，可以顯著降低小鼠血漿中hs-CRP、IL-6和TNF-α水平，進(jìn)一步研究顯示槐芩軟膏能夠顯著減少肛緣組織中炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn)并降低組織中炎性因子IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平，表明槐芩軟膏治療可以降低患者痔術(shù)后體內(nèi)炎性反應(yīng)。NF-kB信號(hào)通路在炎性反應(yīng)中扮演重要角色，其控制轉(zhuǎn)錄的DNA和細(xì)胞因子產(chǎn)生。靜默狀態(tài)下NF-kB分子與IkB分子結(jié)合在一起，分布在細(xì)胞漿中，當(dāng)機(jī)體受到刺激后，IkB分子會(huì)發(fā)生磷酸化，磷酸化后的IkB與NF-kB分子分離，繼而NF-kB分子進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控生物學(xué)活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-kB信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)水腫組織及創(chuàng)面中的炎性反應(yīng)，阻礙組織水腫恢復(fù)及創(chuàng)面愈合[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)槐芩軟膏治療顯著抑制肛緣組織中IkB磷酸化及核內(nèi)NF-kB亞基p65水平，表明槐芩軟膏可能是通過(guò)抑制NF-kB信號(hào)通路抑制水腫組織的炎性反應(yīng)。

綜上所述，槐芩軟膏治療能夠顯著改善小鼠痔術(shù)模型肛緣水腫，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其分子機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-kB信號(hào)通路的激活進(jìn)而抑制肛緣組織中炎性反應(yīng)。本研究為槐芩軟膏在痔術(shù)后的使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。