IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)胃癌增殖能力的影響*

黃亞林 牛世偉 龔紅霞 蘇 韞 張 晗 曾元丁 李菲菲

(1.甘肅省靖遠(yuǎn)縣人民醫(yī)院，白銀 730600)(2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000)(3. 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)(4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州 730000)

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，是造成我國(guó)癌癥死亡的第二大原因[1]。胃癌的典型特征是無限的增殖和異常凋亡[2]。癌細(xì)胞的增殖同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及臨床治療密切相關(guān)。大量研究表明，多條信號(hào)通路與胃癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，如表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)通路[3]、IL-6/JAK/STAT通路[4]、PI3K/Akt/mTOR通路[5]、NF-κB/Bcl-2通路[6]和Shh通路[7]等。其中IL-6/JAK2(Janus proteintyrosine kinase 2)/STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)信號(hào)通路在胃腸道腫瘤發(fā)生過程中高度特異性激活，從促炎、促增殖、促血管生成、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)方面促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。阻斷該通路可能為胃癌的治療提供新的思路。因此，本實(shí)驗(yàn)選用通路特異性阻斷劑阻斷該通路關(guān)鍵靶點(diǎn)，驗(yàn)證通路下游靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)，探討IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞

SPF級(jí)KM小鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量(20.0±2.0)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)【SCXK(甘)2020-0001】。本實(shí)驗(yàn)由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查，倫理審批號(hào)：2020-283。MFC小鼠胃癌細(xì)胞株，批號(hào)為PNS-MC-20【武漢普諾賽生命科技有限公司】。

1.2 主要試劑

AG490和Stattic(Selleck生物科技有限公司)；RPMI 1640 培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Trizol(Ambion公司)；RT-qPCR試劑盒(上海翊圣生物有限公司)；免疫組化(IHC)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔抗鼠IL-6(GenTex公司)；p-JAK2、p-STAT3、c-Myc和Cyclin D1抗體(Immunoway公司)。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及胃癌荷瘤小鼠模型的建立：小鼠MFC胃癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2孵育箱中。將MFC細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并將濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL，小鼠右側(cè)腋下常規(guī)消毒后，接種細(xì)胞懸浮液0.2 mL/只，建立胃癌荷瘤小鼠模型。接種5～7 d可觸及結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)直徑長(zhǎng)至大于5 mm時(shí)表示造模成功。

1.3.2動(dòng)物分組及給藥：根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的胃癌荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型組、AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組，每組10只。根據(jù)小鼠和人體表面面積比值0.002 6計(jì)算小鼠給藥劑量，每天AG490為8 mg/kg，Stattic為5 mg/kg。另選12只健康小鼠作為空白組，小鼠的灌胃體積和腹腔注射體積為0.2 mL，給藥周期為14 d，模型組和空白組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)過程中，剔除腫瘤直徑小于5 mm的小鼠4只，腹腔注射給藥時(shí)意外死亡2只。

1.3.3測(cè)定瘤體質(zhì)量及計(jì)算抑瘤率：末次給藥24 h后，頸椎脫臼法犧牲小鼠，摘除瘤體組織稱重并記錄。抑瘤率=(模型組平均瘤質(zhì)量-藥物組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.3.4ELISA檢測(cè)IL-6含量：小鼠眼球取血，分離血清，-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)過程按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清中IL-6的含量。

1.3.5免疫組化染色觀察各組小鼠瘤體組織中蛋白表達(dá)情況：取甲醛固定的組織，石蠟包埋，切片后二甲苯中脫蠟，梯度乙醇脫去二甲苯，3% H2O2甲醇消除內(nèi)源性過氧化氫酶，然后用檸檬酸鈉修復(fù)液對(duì)其進(jìn)行高溫修復(fù)，加入相應(yīng)一抗工作液于4 ℃，冰箱保存，PBS清洗后加入二抗，37 ℃孵育2 h。DAB顯色后用蘇木精染液復(fù)染，乙醇二甲苯脫水后透明，最后封片于顯微鏡下觀察拍片。Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3.6RT-qPCR定量檢測(cè)瘤體組織中各基因的表達(dá)：取瘤體組織100 mg，Trizol法提取總RNA；經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在-80 ℃冰箱中保存。采用SYBR法在CFX96熒光定量PCR儀中檢測(cè)各mRNA表達(dá)，20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過 2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。GAPDH的正向引物序列為5′-gTgCTgAgTATgTCgTggAgTC-3′；反向序列為5′-ACAgTCTTTCTgggTggCAgT-3′；IL-6的正向引物序列為5′-CATCCAgTTgCC TTCTTg-3′，反向序列為5′-TATCCAgTTTggTAg CATCC-3′；JAK2的正向引物序列為5′-ACAATgACAgAAATggAggC-3′，反向序列為5′-ACAggCgTAATACCACAAgC-3′；STAT3的正向引物序列為5′-TgTTggAgCAgCAtTCTTC-3′，反向序列為5′-ggTCACAgACTggTTgTTTC-3′；c-Myc的正向引物序列為5′-gAgATgATgACCgAgTTACTTg-3′，反向序列為5′-AACCgCTCCACATACAgTC-3′；Cyclin D1的正向引物序列為5′-ggATgAgAA CAAgCAgAC-3′，反向序列為5′-TAgCAggAgAggAAg TTg-3′。

1.3.7蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)組織IL-6、p-JAK2、p-STAT3、c-Myc和CyclinD1蛋白表達(dá)：取適量瘤體組織提取蛋白，按照BCA法檢測(cè)蛋白濃度，煮沸變性，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。配制SDS-PAGE膠，電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，于一抗稀釋液中4 ℃冰箱過夜。TBST清洗后于常溫?fù)u床二抗孵育2 h，ECL顯色曝光，使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，與內(nèi)參進(jìn)行比較，分析相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)干預(yù)對(duì)胃癌荷瘤小鼠瘤體質(zhì)量及抑瘤率的影響

與模型組比，AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠的瘤體質(zhì)量顯著下降(P<0.01)，抑瘤率分別為40.11%、37.14%，見表1。

表1 各組小鼠瘤體質(zhì)量及抑瘤率Table 1 Tumor mass and tumor inhibition rate of mice

2.2 ELISA檢測(cè)胃癌荷瘤小鼠血清中IL-6表達(dá)情況

與空白組比，模型組小鼠血清中IL-6含量升高(P<0.01)；與模型組比，AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠血清中IL-6含量下降(P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-6水平的比較Table 2 Comparison of IL-6 levels in serum of

2.3 免疫組化檢測(cè)胃癌荷瘤小鼠瘤體組織中蛋白表達(dá)情況

與模型組比，AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠瘤體組織中IL-6、JAK2、STAT3、c-Myc和Cyclin D1的陽性表達(dá)顯著下降(P<0.05，P<0.01)，見圖1，表3。

注：A.模型組；B.AG490 阻斷劑組；C.Stattic阻斷劑組Note: A.Model group;B. AG490 blocker group;C.Stattic blocker group圖1 各組小鼠瘤體組織中IL-6、JAK2、STAT3、c-Myc和Cyclin D1含量表達(dá)Fig.1 The expression of IL-6, JAK2, STAT3, c-Myc and Cyclin D1 in tumor tissues of each group of mice

表3 免疫組化檢測(cè)各組小鼠瘤體組織中蛋白表達(dá)情況Table 3 Immunohistochemical detection of protein expression in tumor tissues of mice in each

2.4 RT-qPCR檢測(cè)胃癌荷瘤小鼠瘤體組織中基因表達(dá)情況

與模型組相比，AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠的IL-6、JAK2、STAT3、c-Myc和Cyclin D1 mRNA表達(dá)均降低(P<0.01)，見表4。

表4 RT-qPCR檢測(cè)各組小鼠瘤體組織中基因表達(dá)情況Table 4 RT-qPCR detection of gene expression in tumor tissues of mice in each

2.5 Western blot檢測(cè)胃癌荷瘤小鼠瘤體組織中蛋白表達(dá)情況

與模型組相比，AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠IL-6、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、c-Myc和Cyclin D1蛋白表達(dá)均降低，AG490阻斷劑組JAK2蛋白表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，見圖2，表5。

注：A.模型組；B.AG490 阻斷劑組；C.Stattic阻斷劑組Note: A.Model group；B. AG490 blocker group；C.Stattic blocker group圖2 各組小鼠瘤體組織中蛋白表達(dá)水平Fig.2 Protein expression levels in tumor tissues of mice in each group

3 討論

胃癌具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重威脅人類健康，尋找胃癌的有效治療靶點(diǎn)顯得至關(guān)重要。IL-6參與免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)、造血、骨代謝和胚胎發(fā)育，與慢性炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病和癌癥密切相關(guān)。IL-6可激活下游相關(guān)通路，參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]。有研究[9]證實(shí)JAK2/STAT3信號(hào)通路在miRNA-223-3p調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)產(chǎn)生IL-6通過激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌的遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]。

IL-6是活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，可通過激活JAK增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[11]，JAK是一種蛋白磷酸酶，其作用底物為STAT蛋白，即信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子。目前發(fā)現(xiàn)的JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。STAT激活轉(zhuǎn)位入核后與特定序列DNA片斷結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)。JAK蛋白酪氨酸激酶可在細(xì)胞因子受體與相應(yīng)配體結(jié)合后活化，進(jìn)而激活STATs誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。JAK/STAT信號(hào)通路控制著多種對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的細(xì)胞過程，在癌癥進(jìn)展、炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。在JAK/STAT亞型中，JAK2/STAT3占主要地位。通常是細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或干擾素與其受體結(jié)合，誘導(dǎo)其二聚化與受體接近并被磷酸化活化，再交互催化Tyr磷酸化活化，該活化位點(diǎn)可作為信號(hào)傳導(dǎo)器和轉(zhuǎn)錄激活因子(STATs)的對(duì)接位點(diǎn)，并通過其SH2結(jié)構(gòu)域與它們結(jié)合，結(jié)合后形成同源或異源二聚體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核[12]。STAT3的激活，可促進(jìn)下游多種靶基因,如c-Myc、Cyclin D1的活化，從而調(diào)控腫瘤的增殖及凋亡[13]。AG490是一種酪氨酸激酶受體抑制劑，可特異性阻斷JAK2，Stattic是一種非肽類STAT3小分子阻斷劑，可靶向針對(duì)其SH2結(jié)構(gòu)域，有效抑制STAT3的激活和核易位。阻斷劑的使用為臨床治療胃癌提供了新的思路，單獨(dú)或與其他治療藥物聯(lián)合使用可能成為未來的胃癌治療研究方向。

表5 Western blot檢測(cè)各組小鼠瘤體組織中蛋白表達(dá)情況Table 5 Western blot detection of protein expression in tumor tissues of mice in each

在本研究中，與模型組相比，AG490阻斷劑組、Stattic阻斷劑組小鼠的瘤體質(zhì)量顯著下降，血清中IL-6含量下降，且AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠瘤體組織中的IL-6、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、c-Myc和Cyclin D1蛋白及基因表達(dá)顯著下降，AG490阻斷劑組的JAK2蛋白及基因和Stattic阻斷劑組JAK2基因表達(dá)降低，說明IL-6可激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，阻斷劑通過抑制關(guān)鍵蛋白，進(jìn)而降低下游c-Myc、Cyclin D1基因及蛋白的表達(dá)，從而影響胃癌的生長(zhǎng)及增殖。本實(shí)驗(yàn)使用JAK2和STAT3阻斷劑，證明該通路在胃癌增殖中的作用，為胃癌臨床治療提供新思路。