• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    L-瓜氨酸生產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

    2016-06-02 09:23:51吳石金戴安迪浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院浙江杭州310014
    發(fā)酵科技通訊 2016年2期
    關(guān)鍵詞:瓜氨酸

    吳石金,戴安迪(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江杭州310014)

    ?

    L-瓜氨酸生產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

    吳石金,戴安迪
    (浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江杭州310014)

    摘要:通過(guò)選擇性培養(yǎng)基初篩(利用精氨酸雙水解酶篩選培養(yǎng)基)和復(fù)篩(高效液相色譜法測(cè)定L-瓜氨酸質(zhì)量濃度),從杭州市勾莊地區(qū)西瓜大棚的土壤中篩選獲得45株產(chǎn)L-瓜氨酸菌株。其中一株細(xì)菌(菌株編號(hào)11)轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)L-瓜氨酸的能力最強(qiáng),產(chǎn)生的L-瓜氨酸濃度最高,0.344 g濕菌,在60 mL轉(zhuǎn)化體系中轉(zhuǎn)化一天,可將20 g/L的底物L(fēng)-精氨酸轉(zhuǎn)化為9.31 g/L的L-瓜氨酸。對(duì)11號(hào)菌株分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定,初步鑒定該菌株為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。

    關(guān)鍵詞:L-瓜氨酸;糞腸球菌;篩選鑒定

    L-瓜氨酸(L-citrulline)是人體尿素循環(huán)中的一種代謝中間產(chǎn)物,有利尿作用,臨床上常與L-精氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸等共同用于治療高氨血癥[1]。近年來(lái),眾多國(guó)內(nèi)外研究表明L-瓜氨酸還具有很多其他重要的生理功能,如清除有害的自由基、抗氧化、穩(wěn)定血壓、指示異體排斥效應(yīng)[2-3],瓜氨酸還可松弛血管,增強(qiáng)男性性功能,以及治療性功能障礙[4]。

    目前,生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法主要有生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法、提取法和酶法。發(fā)酵法生產(chǎn)L-瓜氨酸的缺點(diǎn)是產(chǎn)率低[5];化學(xué)法生產(chǎn)的產(chǎn)品中含有L-瓜氨酸的旋光對(duì)映體D-瓜氨酸[6];提取法的生產(chǎn)工藝相對(duì)困難,產(chǎn)品很難純化,因此成本比較高;酶法的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)條件溫和,產(chǎn)品中無(wú)D型旋光對(duì)映體產(chǎn)生[11]。酶法生產(chǎn)L-瓜氨酸是一種效率高、成本低的生產(chǎn)方法,將在瓜氨酸生產(chǎn)中起到重要作用[7-9]。已有報(bào)道利用銅綠假單胞菌[10]、惡臭假單胞菌[11]、乳酸乳球菌[12]等提取精氨酸脫亞胺酶,轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸,但瓜氨酸產(chǎn)量低,工藝也尚不成熟。轉(zhuǎn)化能較強(qiáng)的菌株將在未來(lái)瓜氨酸生產(chǎn)中扮演重要角色。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

    土壤樣品:杭州市勾莊地區(qū)西瓜大棚土壤表層5~10 cm的沃土以及大棚旁邊溝渠中的水樣適量。西瓜根系纖弱,耐干不耐濕,所以培育的土壤多為旱地,瓜氨酸具有一定的耐旱作用,能產(chǎn)生瓜氨酸菌株能在旱地較好的生存,故選取西瓜大棚土壤作為取樣來(lái)源。

    1.1.2主要試劑

    L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma試劑公司;L-精氨酸購(gòu)于上海藍(lán)季生物公司;乙腈(色譜純,美國(guó)天地有限公司);2,4-二硝基氟苯購(gòu)于豪普斯生物試劑公司;其余試劑均為分析純。

    1.1.3培養(yǎng)基與試劑

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,pH 7.4,115℃滅菌30 min。

    篩選培養(yǎng)基:蛋白胨1 g/L,NaCl 5 g/L,KH2PO40.3 g/L,L-精氨酸10 g/L,酚紅0.01 g/L,pH 6.7,固體培養(yǎng)基另加瓊脂20 g/L,115℃滅菌30 min。

    種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,牛肉膏5 g/L,NaCl 3 g/L,KH2PO42 g/L,pH 7.2,115℃滅菌30 min。

    發(fā)酵基本培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/ L,NaCl 10 g/L,L-精氨酸2 g/L,pH 7.2,115℃滅菌30 min。

    轉(zhuǎn)化液成分:pH 6.0的底物精氨酸質(zhì)量濃度為20 g/L,0.4 mol/L的NaAc-HAc緩沖液,115℃滅菌30 min。

    衍生劑試劑:Na2CO3-NaHCO3緩沖液的配制,準(zhǔn)確稱(chēng)取Na2CO3和NaHCO3,制成0.5 mol/L Na2CO3和0.5 mol/L NaHCO3溶液,用Na2CO3調(diào)NaHCO3的pH值為9.0,即制得Na2CO3-NaHCO3緩沖液。

    2,4-二硝基氟苯乙腈液的配制:準(zhǔn)確量取2,4-二硝基氟苯,制得體積分?jǐn)?shù)為1.5%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液。

    K2HPO4-KH2PO4緩沖液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取K2HPO4和KH2PO4,制成0.1 mol/L的K2HPO4和KH2PO4溶液,互調(diào)pH值至7.0,即制得K2HPO4-KH2PO4緩沖液。

    流動(dòng)相A的配制:含1%N,N-二甲基甲酰胺(體積分?jǐn)?shù))的0.05 mol/L NaAc和HAc緩沖溶液。分別準(zhǔn)確配制0.05 mol/L的NaAc和HAc溶液,用HAc調(diào)NaAc溶液的pH值至6.4,然后加入溶液體積1%的N,N-二甲基甲酰胺,用0.45 μm水相膜過(guò)濾。流動(dòng)相B的配制:V(乙腈):V(水)=3:1,用0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾。

    1.2儀器與設(shè)備

    雙層全溫恒溫培養(yǎng)搖床;D-3752型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)ThermoFisher;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱,上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠;YXQ-LS-S型全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋,上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠;GE-100型DNA水平電泳儀;Mastercycler型聚合酶反應(yīng)儀,德國(guó)Eppendorf;Gel Dac XR+型凝膠成像系統(tǒng),美國(guó)BIO-RAD;光學(xué)顯微鏡,日本尼康;分光光度計(jì),美普達(dá)儀器公司;恒溫水浴鍋,萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠;Agilent 1260高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司。

    1.3實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1樣品的處理

    將從菌源地采樣得來(lái)的樣品分別溶于無(wú)菌生理鹽水中,置于30℃搖床1 h混勻。

    1.3.2初篩[13-14]

    取上述土壤懸濁液溶于無(wú)菌水中,梯度稀釋?zhuān)?0-4、10-5、10-63種稀釋度,取0.2 mL涂布于固體篩選平板上,倒置放入30℃恒溫培養(yǎng)箱,充分培養(yǎng)。若菌落能產(chǎn)生精氨酸脫亞胺酶,脫去精氨酸的亞氨基,同時(shí)生成瓜氨酸和氨,氨成堿性,會(huì)使培養(yǎng)基中添加的酚紅指示劑變成紅色,形成紅色的變色圈。

    每日定時(shí)觀察上述平板上菌株的生長(zhǎng)情況,若發(fā)現(xiàn)周?chē)屑t色變色圈菌落,立即挑取菌落在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)純化,經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)特征觀察和鏡檢,初步認(rèn)定為純種,各自用甘油凍存保藏,并編號(hào)。將上述保藏菌株接于液體篩選培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性,以不加精氨酸的液體篩選培養(yǎng)基作為對(duì)照。保留所有陽(yáng)性菌株,編號(hào)保藏。

    1.3.3復(fù)篩[15]

    通過(guò)初篩得到的菌株分別接種到液體種子培養(yǎng)中,37℃,180 r/min培養(yǎng)12 h獲得均勻的種子,然后以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量分別接到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃,180 r/min培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌液6 000 r/min離心10 min,用滅菌生理鹽水洗滌菌體1~2次,轉(zhuǎn)入0.4 mol/L醋酸緩沖液中(底物精氨酸質(zhì)量濃度為20 g/L,pH 6),反復(fù)吹打均勻,裝液量60 mL,置于37℃,180 r/min搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中瓜氨酸質(zhì)量濃度。

    瓜氨酸衍生化方法:轉(zhuǎn)化液10 000 r/min離心5 min,取1 mL放入10 mL的棕色容量瓶中(衍生物見(jiàn)光易分解),加入配制好的Na2CO3-NaHCO3緩沖液1 mL,再加入1 mL的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液后搖勻,60℃水浴加熱1 h后,用K2HPO4-KH2PO4緩沖液定容。衍生化后的樣品10 000 r/min離心5 min,取0.6 mL入棕色液相瓶中待用。

    高效液相色譜法檢測(cè)條件設(shè)置:使用Agilent XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm)。流動(dòng)相A為含1%(體積分?jǐn)?shù))N,N-二甲基甲酰胺的0.05 mol/ L NaAc和HAc緩沖溶液,流動(dòng)相B為乙腈-水,進(jìn)樣量5 μL。實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫,流動(dòng)相A和B的體積比為:初始A與B的體積比為3:1,10 min 后A與B的體積比為2:3,13 min時(shí)A與B的體積比增至1:19,17 min時(shí)A與B的體積比還原為3:1,20 min洗脫結(jié)束。流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量5μL,二極管陣列(DAD)檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

    瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制:精確稱(chēng)取瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自Sigma公司)10 mg,用去離子水溶解并定容至5 mL,質(zhì)量濃度為2 g/L。衍生化定容,按照上述液相檢測(cè)方法,分別進(jìn)樣2、4、6、8、10 μL,平行進(jìn)樣5次,記錄瓜氨酸的峰面積。以瓜氨酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

    1.3.4菌株鑒定[16-17]

    1)細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征及生化鑒定

    將菌株接種到牛肉膏蛋白胨平板和液體培養(yǎng)物中,培養(yǎng)24 h后分別作革蘭染色,光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察其形態(tài),并對(duì)11號(hào)菌株進(jìn)行生化鑒定。

    2)分子生物學(xué)鑒定

    采用16S rDNA序列分析法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。用OMEGA公司的基因組提取試劑盒(E.Z.N. A.TM Bacterial DNA Kit)快速提取菌株基因組DNA。以基因組DNA為模板,以通用引物F27和R1492為引物進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。

    通用引物序列具體如下所示:

    F27:5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

    R1492:5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′

    PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:96℃預(yù)變性5 min,95℃變性45 s,58℃退火45 s,72℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán)。72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物交由GENEWIZ公司測(cè)序,進(jìn)行16S rDNA基因序列比對(duì)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1瓜氨酸HPLC檢測(cè)圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

    分別進(jìn)樣衍生劑和瓜氨酸衍生后產(chǎn)物,由液相圖譜圖1(a)可知衍生劑的出峰時(shí)間大約為5.768 min,由圖1(b)可知瓜氨酸衍生物的出峰時(shí)間內(nèi)大概為5.159 min左右。

    以瓜氨酸濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),回歸系數(shù)R2=0.997,線(xiàn)性關(guān)系良好。圖1(c)為瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

    圖1 瓜氨酸HPLC檢測(cè)圖譜及瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

    2.2初篩

    將土壤樣品溶于無(wú)菌水梯度稀釋后涂布于固體篩選培養(yǎng)基上,倒置于30℃培養(yǎng)箱中充分培養(yǎng),挑選出菌落周?chē)a(chǎn)生紅色變色圈的菌株,劃線(xiàn)純化,經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)特征觀察和鏡檢,初步認(rèn)定為純種的菌株有168株。將上述菌株接于液體篩選培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性,以不加精氨酸的液體篩選培養(yǎng)基作為對(duì)照,排除本身代謝產(chǎn)物呈堿性的菌株,共有45株呈陽(yáng)性,為初篩對(duì)象。

    2.3復(fù)篩

    將初篩出來(lái)的45株接入50 mL種子液中,活化后按照1.3.3中的方法進(jìn)行復(fù)篩,轉(zhuǎn)化液離心取上清,衍生化后HPLC測(cè)定瓜氨酸質(zhì)量濃度,結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 不同菌株瓜氨酸質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果比較

    菌株  瓜氨酸質(zhì)量濃度/(g·L-1) 菌株  瓜氨酸質(zhì)量濃度/(g·L-1)29 2.81 38 1.49 30 1.57 39 0.54 31 0.45 40 0.36 32 0.31 41 0.21 33 5.20 42 3.58 34 0.02 43 0.35 35 3.91 44 6.08 36 1.34 45 0.26 37 4.54

    由表1可知,經(jīng)HPLC檢測(cè),11號(hào)菌株轉(zhuǎn)化液中瓜氨酸質(zhì)量濃度最大,遠(yuǎn)高于其他菌株。因此選擇11號(hào)菌作為目的菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。11號(hào)菌轉(zhuǎn)化液HPLC檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖2(5.190 min為瓜氨酸衍生物出峰,5.717 min為精氨酸衍生物出峰,5.891 min為剩余衍生劑出峰)。

    圖2 11號(hào)菌轉(zhuǎn)化液HPLC檢測(cè)圖譜

    2.4菌株鑒定

    2.4.1形態(tài)及生化鑒定

    菌體在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中形態(tài):菌落呈圓形,邊緣整齊,凸起,菌落呈白色半透明見(jiàn)圖3(a)。革蘭氏染色后菌體球狀呈陽(yáng)性見(jiàn)圖3 (b),陰性桿菌為實(shí)驗(yàn)室保藏的氣單胞菌。透射電鏡(負(fù)染)下見(jiàn)圖3(c),菌體呈球狀,未見(jiàn)鞭毛。根據(jù)16S rDNA的比對(duì)結(jié)果確定菌株所在的屬,配合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》研究菌株的生化特征,菌株生化特征見(jiàn)表2。

    表2 菌株11生理生化試驗(yàn)

    2.4.2分子生物學(xué)鑒定

    16S rDNA區(qū)域序列同源性分析是一種常用的細(xì)菌分子鑒定方法。菌株的16S rDNA片段擴(kuò)增后測(cè)序得到一個(gè)長(zhǎng)為1 447 bp的序列,16S rDNA以及Marker的瓊脂糖電泳見(jiàn)圖4(泳道M 為Marker,泳道1為PCR產(chǎn)物)。將所得有效序列在NCBI中進(jìn)行BLAST同源序列搜索,根據(jù)搜索結(jié)果,選取相似性較高的菌種的相關(guān)序列進(jìn)行分析。利用MEGA5軟件中的Neighbor-Joining法對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析,以漫游菌屬(Vagococcus Collins NCBI登錄號(hào)為NR_118902.1)為外群,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),Bootstrap values為100(圖5)。分析結(jié)果表明,菌株11與糞腸球菌遺傳距離最近,同源性高達(dá)99%,因此初步鑒定11為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。

    圖3 菌株11形態(tài)觀察

    圖4 菌株11 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳凝膠成像圖

    圖5 菌株11系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

    3 討 論

    瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸,有著非常廣泛的應(yīng)用前景。11號(hào)菌株在較為簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件下就具有較強(qiáng)的精氨酸生產(chǎn)能力,為酶法生產(chǎn)瓜氨酸工業(yè)化的研究夯實(shí)基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)11號(hào)菌株的形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定,認(rèn)定該菌株為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。初步研究表明,菌株11可將20 g/L的精氨酸轉(zhuǎn)化為9.31 g/L的瓜氨酸,轉(zhuǎn)化率為46.28%。國(guó)內(nèi)對(duì)于糞腸球菌酶法生產(chǎn)瓜氨酸的報(bào)道較多,如王瑩等[18]研究了糞腸球菌SK23.001產(chǎn)瓜氨酸的發(fā)酵條件,優(yōu)化后以蔗糖為碳源,大豆蛋白胨和NH4Cl為氮源,接種為3%,裝液量為50 mL/250 mL,起始pH 6.0,溫度37℃,100 g/L精氨酸轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 h,瓜氨酸產(chǎn)量可達(dá)83.06 g/L。李成付等[19]對(duì)復(fù)合誘變后的糞腸球菌NJ402進(jìn)行了精氨酸脫亞胺酶酶學(xué)性質(zhì)研究,經(jīng)SephadexG-75凝膠柱層析純化后,其比酶活為8.151 U/mg。張鵬等[20]用海藻酸鈉對(duì)糞鏈球菌Streptococcus faecalis CGMCC1866進(jìn)行固定化,每升反應(yīng)液能產(chǎn)生瓜氨酸112~165 g/L。本文篩得的11號(hào)菌株并未表現(xiàn)出如此之高的瓜氨酸產(chǎn)量,可能是由于碳氮源等發(fā)酵條件,底物濃度等轉(zhuǎn)化條件不適宜,導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢,瓜氨酸產(chǎn)量偏低。若后續(xù)能對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變,酶定向改造,探索其發(fā)酵、轉(zhuǎn)化等因素的最優(yōu)條件,提高瓜氨酸產(chǎn)量,可能在酶法生產(chǎn)瓜氨酸領(lǐng)域有更廣闊的應(yīng)用前景。

    參考文獻(xiàn):

    [1]張克旭.氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1992.

    [2]曾小峰,艾脈興,甘曉丹,等.抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測(cè)在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的意義[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2002,15(5):281-285

    [3]鄭春福,林建銀. L-精氨酸和L-瓜氨酸在體外活化巨噬細(xì)胞抗弓形蟲(chóng)感染中的作用[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)病學(xué)雜志,1998,16 (5):326-330.

    [4]王晶,趙晶.一氧化氮的生物學(xué)效應(yīng)[J].中國(guó)基層醫(yī)藥,2003,10(12):1316-1318.

    [5]SHINJI O,MASAO S,SHIMPACHI K,et al. Method of producing citrulline by bacterial fermentation:US 3282794[P]. 1966-11-1.

    [6]PLIMMER R H A. The analysis of proteins. I. The estimation of arginine by decomposition with alkali[J]. Biochemical journal,1916,10(1):115-119.

    [7]曹瑜,李加友,焦慶才.酶法轉(zhuǎn)化制備L-瓜氨酸[J].精細(xì)化工,2005,22(10):759-761.

    [8]李加友,曹瑜,錢(qián)紹松,等.精氨酸脫亞胺酶發(fā)酵條件研究[J].化學(xué)反應(yīng)工程與工藝,2006,22(1):43-47.

    [9]KOZO Y,TADASHI S,TESUY T.用臭味加蛋胞菌桿菌固定化菌體連續(xù)生產(chǎn)L-瓜氨酸[J].工業(yè)微生物,1979(9):66-72.

    [10]OUDJAMA Y,TRICOT C,STALON V,et al. Overexpression,purification,crystallizationandpreliminary X-raycrystallographic analysis of Pseudomonas aeruginosa L-arginine deiminase[J]. Biological crystallography,2002,58(12):2150-2152.

    [11]張媛媛,劉曉蓉,周愛(ài)芳.惡臭假單胞菌產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶發(fā)酵條件及特性的研究[J].中國(guó)釀造,2011,232(7):54-56.

    [12]KIM J E,JEONG D W,LEE H J. Expression,purification,and characterization of arginine deiminase from Lactococcus lactis ssp. lactis ATCC 7962 in Escherichia coli BL21[J]. Protein expression and purification,2007,53(1):9-15.

    [13]李加友.高產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶菌株的篩選鑒定和發(fā)酵特性研究[J].食品科技,2010,35(5):11-18.

    [14]方佳茂.一株產(chǎn)L-瓜氨酸微生物菌株的鑒定[J].發(fā)酵科技通訊,2010,39(2):16-19.

    [15]牟,袁其朋,翁南梅,等.高效液相色譜分析L-瓜氨酸的研究[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào),2004,31(3):110-113.

    [16]東秀珠.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

    [17]黎滿(mǎn)香,林榮高,薛立群,等.湖南豬源糞腸球菌的分離鑒定及16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,31(9):1290-1294.

    [18]王瑩,張濤,江波,等.糞腸球菌SK23.001產(chǎn)瓜氨酸發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技,2012,24(33):233-241.

    [19]李成付,李凱,李加友,等.糞腸球菌精氨酸脫亞胺酶酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(6):846-850.

    [20]張鵬,張淑榮,劉春巧,等.固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法:CN1948464A[P]. 2006-11-24.

    (責(zé)任編輯:朱小惠)

    Screening and identification of L-citrulline producing strains

    WU Shijin,DAI Andi
    (College of Biotechnology and Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

    Abstract:Forty-five L-citrulline producing strains were preliminarily screened from Hangzhou watermelon greenhouse soil using arginine dihydrolase selective medium and their productivities were determined by HPLC. The strain of NO.11 had the highest ability to convert L-arginine to L-citrulline. 20 g/L L-arginine was converted into 9.31 g/L L-citrulline in 60 mL reaction mixture in one day with 0.344 g wet cells. The strain was identified as Enterococcus faecalis by morphology observation,physiological and biochemical characterization and molecular biological identification. Keywords:L-citrulline;Enterococcus faecalis;screening

    作者簡(jiǎn)介:吳石金(1971—),男,江西贛州人,教授,博士,研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與應(yīng)用分子生物學(xué),E-mail:wujan28@zjut. edu.cn.

    基金項(xiàng)目:浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(GB14021050070)

    收稿日期:2015-12-04

    中圖分類(lèi)號(hào):Q93

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1674-2214(2016)02-0088-06

    猜你喜歡
    瓜氨酸
    蔬菜作物中瓜氨酸代謝調(diào)控研究進(jìn)展
    瓜氨酸化與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎
    醬油發(fā)酵過(guò)程中融合魏斯氏乳酸菌促進(jìn)瓜氨酸的積累
    類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜抗環(huán)瓜氨酸肽表位表達(dá)與肽?;彼崦搧啺泵?基因的相關(guān)性分析
    血漿L-瓜氨酸和L-精氨酸濃度分析方法建立及應(yīng)用
    不同生態(tài)條件下西瓜果實(shí)瓜氨酸含量比較研究
    瓜氨酸與臨床相關(guān)疾病的研究進(jìn)展
    類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎瓜氨酸化反應(yīng)研究的最新進(jìn)展
    蛋白質(zhì)瓜氨酸化及其在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的意義
    吃西瓜降血壓 靠譜
    久久精品国产a三级三级三级| 999精品在线视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 黄片播放在线免费| 国产高清国产精品国产三级| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产激情久久老熟女| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品免费大片| 欧美国产精品一级二级三级| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 精品午夜福利在线看| 777米奇影视久久| 欧美中文综合在线视频| svipshipincom国产片| 成人漫画全彩无遮挡| 看免费av毛片| 国产免费视频播放在线视频| 嫩草影院入口| 老司机深夜福利视频在线观看 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲中文av在线| 丝袜美腿诱惑在线| 午夜福利免费观看在线| 天天添夜夜摸| 国产成人精品无人区| 亚洲精品自拍成人| 婷婷色综合大香蕉| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日韩精品有码人妻一区| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 免费观看a级毛片全部| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲av福利一区| 欧美国产精品一级二级三级| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 一二三四中文在线观看免费高清| 中文字幕高清在线视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 美女福利国产在线| av女优亚洲男人天堂| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 天天影视国产精品| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产黄色免费在线视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产一区亚洲一区在线观看| 在线观看国产h片| 午夜福利视频精品| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲国产成人一精品久久久| 涩涩av久久男人的天堂| 国产又色又爽无遮挡免| 国产男女超爽视频在线观看| 十八禁人妻一区二区| 欧美日韩成人在线一区二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产亚洲欧美精品永久| 精品第一国产精品| 午夜福利影视在线免费观看| 韩国高清视频一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产一区二区激情短视频 | 国产免费又黄又爽又色| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日本一区二区免费在线视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 99热全是精品| 久热这里只有精品99| 精品免费久久久久久久清纯 | a 毛片基地| 亚洲av综合色区一区| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产av精品麻豆| bbb黄色大片| 午夜免费鲁丝| 国产日韩欧美视频二区| 一区二区三区激情视频| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美在线一区亚洲| 国产成人精品久久久久久| 久久久久久久久久久免费av| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久久久精品国产欧美久久久 | 黄片无遮挡物在线观看| 多毛熟女@视频| 老司机在亚洲福利影院| 午夜影院在线不卡| 国产精品av久久久久免费| 久久久久精品久久久久真实原创| 精品少妇久久久久久888优播| 秋霞在线观看毛片| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 超碰97精品在线观看| 久热爱精品视频在线9| 亚洲国产看品久久| 成年美女黄网站色视频大全免费| 日韩大片免费观看网站| 又黄又粗又硬又大视频| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲熟女精品中文字幕| av网站在线播放免费| 色播在线永久视频| 亚洲精品国产区一区二| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 男女免费视频国产| 爱豆传媒免费全集在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 少妇精品久久久久久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜影院在线不卡| 国产福利在线免费观看视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 中文字幕高清在线视频| 亚洲av综合色区一区| 欧美黑人精品巨大| 大陆偷拍与自拍| 国产成人91sexporn| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲国产精品国产精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩欧美精品免费久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 黄频高清免费视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 超碰成人久久| 免费少妇av软件| 欧美日韩综合久久久久久| av福利片在线| 91老司机精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 午夜福利乱码中文字幕| 伊人亚洲综合成人网| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲熟女毛片儿| 99国产精品免费福利视频| 亚洲天堂av无毛| 亚洲成人手机| 精品亚洲成a人片在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产色婷婷99| 久久99一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| a 毛片基地| kizo精华| 婷婷色麻豆天堂久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| netflix在线观看网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 性少妇av在线| 一区二区三区乱码不卡18| 天天影视国产精品| 欧美xxⅹ黑人| 女人精品久久久久毛片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲av国产av综合av卡| √禁漫天堂资源中文www| 最近手机中文字幕大全| 在线观看人妻少妇| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美精品一区二区免费开放| 中国国产av一级| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久人人97超碰香蕉20202| 1024香蕉在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 免费av中文字幕在线| 日韩免费高清中文字幕av| 婷婷成人精品国产| 国产av一区二区精品久久| 精品免费久久久久久久清纯 | 永久免费av网站大全| 亚洲美女黄色视频免费看| 777米奇影视久久| 一本久久精品| 久久久久久人人人人人| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| av卡一久久| 青春草国产在线视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 精品一区在线观看国产| 国产精品免费视频内射| 免费少妇av软件| 久久久久久久久久久免费av| 69精品国产乱码久久久| 在线观看国产h片| 国产精品一区二区精品视频观看| 在线观看免费视频网站a站| 精品国产乱码久久久久久男人| 看非洲黑人一级黄片| 国产99久久九九免费精品| 国产精品久久久久久精品古装| kizo精华| 视频在线观看一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产亚洲欧美精品永久| 国产 精品1| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久性视频一级片| 久久午夜综合久久蜜桃| 另类精品久久| 黄色视频不卡| 欧美日韩一级在线毛片| 99久久99久久久精品蜜桃| 极品少妇高潮喷水抽搐| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲伊人久久精品综合| 日韩欧美精品免费久久| 精品亚洲成国产av| 国产熟女欧美一区二区| 桃花免费在线播放| 好男人视频免费观看在线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美激情高清一区二区三区 | 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品国产露脸久久av麻豆| 日韩制服骚丝袜av| 最近手机中文字幕大全| 日韩电影二区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜激情久久久久久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲,欧美精品.| 午夜av观看不卡| 9191精品国产免费久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 制服诱惑二区| 美国免费a级毛片| 热99久久久久精品小说推荐| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产97色在线日韩免费| 国产精品免费视频内射| 国产成人精品福利久久| 亚洲综合色网址| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 国产高清国产精品国产三级| 国产在线一区二区三区精| 日韩av在线免费看完整版不卡| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 电影成人av| 两个人看的免费小视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲中文av在线| 午夜激情久久久久久久| 18禁动态无遮挡网站| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 波多野结衣av一区二区av| 欧美日韩成人在线一区二区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 熟女av电影| av福利片在线| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 午夜免费观看性视频| 成人手机av| av在线播放精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 永久免费av网站大全| 丁香六月欧美| 考比视频在线观看| 精品一区二区免费观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久精品国产a三级三级三级| 9热在线视频观看99| 丁香六月天网| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黑人欧美特级aaaaaa片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 老司机影院毛片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲熟女毛片儿| 女人久久www免费人成看片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 尾随美女入室| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 夫妻午夜视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久精品久久久久久久性| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久影院123| 国产在线一区二区三区精| 成年美女黄网站色视频大全免费| av一本久久久久| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲成人av在线免费| 国产成人啪精品午夜网站| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产激情久久老熟女| 亚洲专区中文字幕在线 | 咕卡用的链子| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产 一区精品| 免费日韩欧美在线观看| 免费看不卡的av| 成人国产麻豆网| 亚洲欧美一区二区三区国产| 大香蕉久久网| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 两性夫妻黄色片| 一级毛片我不卡| 日韩一区二区视频免费看| 丝袜美腿诱惑在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 黑人猛操日本美女一级片| 飞空精品影院首页| 欧美激情高清一区二区三区 | 男女床上黄色一级片免费看| 久久这里只有精品19| 最近的中文字幕免费完整| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产男女内射视频| 韩国av在线不卡| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲伊人色综图| 1024视频免费在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 青春草视频在线免费观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲中文av在线| 国产男女内射视频| 美女视频免费永久观看网站| 丝袜美腿诱惑在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 又黄又粗又硬又大视频| 久久av网站| 成人国产av品久久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 嫩草影院入口| 少妇被粗大的猛进出69影院| 极品人妻少妇av视频| 亚洲三区欧美一区| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 色综合欧美亚洲国产小说| 97在线人人人人妻| 成人国产麻豆网| 蜜桃国产av成人99| 日韩大码丰满熟妇| 九色亚洲精品在线播放| 51午夜福利影视在线观看| 热re99久久国产66热| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久婷婷青草| xxx大片免费视频| 亚洲国产精品国产精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 免费看av在线观看网站| 亚洲av中文av极速乱| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 丝袜美足系列| 女性生殖器流出的白浆| 人人澡人人妻人| 美女午夜性视频免费| 久久这里只有精品19| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产伦人伦偷精品视频| 观看美女的网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品免费大片| 亚洲第一av免费看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 超碰成人久久| 大陆偷拍与自拍| 亚洲成人手机| 在线天堂中文资源库| 午夜免费鲁丝| 亚洲精品一二三| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产av精品麻豆| 我的亚洲天堂| 成人午夜精彩视频在线观看| 日日撸夜夜添| 老汉色∧v一级毛片| 男女下面插进去视频免费观看| 在线观看免费高清a一片| 赤兔流量卡办理| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日韩av不卡免费在线播放| 午夜日韩欧美国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人国语在线视频| 中文字幕制服av| 视频在线观看一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 伦理电影免费视频| 国产野战对白在线观看| 只有这里有精品99| 久热爱精品视频在线9| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久 成人 亚洲| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产野战对白在线观看| av福利片在线| 少妇人妻精品综合一区二区| 精品福利永久在线观看| 悠悠久久av| 中文天堂在线官网| 在线观看免费高清a一片| 亚洲专区中文字幕在线 | 九色亚洲精品在线播放| 51午夜福利影视在线观看| 99九九在线精品视频| 在线精品无人区一区二区三| www.精华液| 精品视频人人做人人爽| 日本wwww免费看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久午夜综合久久蜜桃| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线观看免费日韩欧美大片| 97人妻天天添夜夜摸| 男女免费视频国产| 婷婷色综合www| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲视频免费观看视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 美女中出高潮动态图| 色婷婷av一区二区三区视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲熟女精品中文字幕| 啦啦啦啦在线视频资源| 婷婷色麻豆天堂久久| 高清欧美精品videossex| 免费高清在线观看日韩| 国产av国产精品国产| 国产伦理片在线播放av一区| 国产亚洲欧美精品永久| 国产又爽黄色视频| 久久久久视频综合| 男女午夜视频在线观看| 日本色播在线视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 美女国产高潮福利片在线看| 国产av码专区亚洲av| 大片免费播放器 马上看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 在线观看三级黄色| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品国产乱码久久久久久小说| 悠悠久久av| 精品国产乱码久久久久久小说| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久久久久久久久久久大奶| 9热在线视频观看99| 天天操日日干夜夜撸| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美激情高清一区二区三区 | 美女脱内裤让男人舔精品视频| 午夜91福利影院| 老汉色av国产亚洲站长工具| 91老司机精品| 日本黄色日本黄色录像| 久久精品久久精品一区二区三区| 尾随美女入室| 丰满乱子伦码专区| 蜜桃在线观看..| 精品一区在线观看国产| 久久久精品免费免费高清| 亚洲综合色网址| 青春草视频在线免费观看| 国产精品国产三级专区第一集| 超碰成人久久| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲国产精品999| 国产高清国产精品国产三级| 久久久欧美国产精品| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产毛片在线视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲,欧美精品.| 色视频在线一区二区三区| 久久鲁丝午夜福利片| xxxhd国产人妻xxx| 国产男女超爽视频在线观看| 不卡av一区二区三区| 亚洲精品视频女| 999精品在线视频| 久久这里只有精品19| 国产免费又黄又爽又色| av一本久久久久| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久99一区二区三区| 亚洲三区欧美一区| 操出白浆在线播放| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 多毛熟女@视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 午夜91福利影院| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产乱人偷精品视频| 午夜久久久在线观看| 深夜精品福利| netflix在线观看网站| 飞空精品影院首页| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲成人一二三区av| 视频区图区小说| 午夜福利视频在线观看免费| svipshipincom国产片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 波多野结衣一区麻豆| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美人与善性xxx| av卡一久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美黑人精品巨大| 日韩av免费高清视频| 国产av一区二区精品久久| 精品第一国产精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产在线视频一区二区| 国精品久久久久久国模美| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品日本国产第一区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 性色av一级| 视频区图区小说| 国产乱人偷精品视频| 亚洲成国产人片在线观看| 成年动漫av网址| 成人国产麻豆网| 精品一区二区三卡| 色视频在线一区二区三区| 五月开心婷婷网| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产福利在线免费观看视频| 一区二区三区激情视频| 亚洲av成人精品一二三区| 天天影视国产精品| 丰满乱子伦码专区| 99re6热这里在线精品视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产成人精品久久久久久| 久久人人爽人人片av| 国产国语露脸激情在线看| 在线观看一区二区三区激情| xxx大片免费视频| 1024香蕉在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 最近中文字幕2019免费版| 下体分泌物呈黄色| 国产黄频视频在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产成人91sexporn| 国产av一区二区精品久久| 看免费av毛片| 亚洲欧美精品自产自拍|