瓜氨酸化與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

趙靜，李鴻斌，王靜

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性滑膜炎為主要病變的自身免疫性疾病，體內(nèi)存在多種抗瓜氨酸肽抗體(anti-citrullinated peptide antibodies，ACPAs)[1]，RA除有關(guān)節(jié)癥狀外，還可以并發(fā)關(guān)節(jié)外癥狀。瓜氨酸化可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生APCAs，APCAs是RA診斷、預(yù)測(cè)病情進(jìn)展和預(yù)后轉(zhuǎn)歸的重要指標(biāo)。ACPAs在RA中作用于多種細(xì)胞，介導(dǎo)免疫損傷機(jī)制。有研究表明，吸煙、空氣污染等環(huán)境因素可使肺上皮細(xì)胞發(fā)生瓜氨酸化[2]，提示蛋白瓜氨酸化是細(xì)胞內(nèi)損傷的一個(gè)早期標(biāo)記。研究證實(shí)瓜氨酸化與自噬、中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETosis)及凋亡相關(guān)，并參與RA的發(fā)病機(jī)制[3]。本文對(duì)其進(jìn)行綜述。

1 瓜氨酸化

瓜氨酸化是一種生理性轉(zhuǎn)錄后修飾，在依賴(lài)Ca+的肽?；彼崦搧啺访?peptidylarginine deiminase，PAD)催化下，使精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸。蛋白質(zhì)修飾能形成新的表位，產(chǎn)生不同于自身抗原的新抗原，可促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞(APC)對(duì)新抗原的識(shí)別和表達(dá)，從而提高蛋白質(zhì)的免疫原性。

1.1 瓜氨酸化對(duì)抗原性的改變

瓜氨酸化可對(duì)APC、T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原識(shí)別產(chǎn)生影響，瓜氨酸化修飾可以使蛋白形成新的表位，瓜氨酸化抗原暴露增加，可促進(jìn)APC對(duì)瓜氨酸化抗原的攝取和識(shí)別，在攜帶HLA-DR B1 SE的RA中T細(xì)胞和B細(xì)胞可以識(shí)別瓜氨酸化抗原[4]。RA中B細(xì)胞可作為APC，通過(guò)與B細(xì)胞表面受體結(jié)合識(shí)別瓜氨酸化抗原，促進(jìn)T細(xì)胞分化成熟為記憶性T細(xì)胞，活化的T細(xì)胞可促進(jìn)B細(xì)胞釋放ACPAs。自身反應(yīng)性B細(xì)胞膜表面ACPAs與瓜氨酸化特定抗原結(jié)合，可進(jìn)一步促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生各種致炎因子和ACPAs，對(duì)RA的病情進(jìn)展起著至關(guān)重要的作用[5- 6]。此外，記憶型B細(xì)胞亞群表達(dá)RANKL，參與調(diào)節(jié)RA的骨穩(wěn)態(tài)和生成破骨細(xì)胞。RA滑膜中有大量CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)，研究證實(shí)從RA中分離出的瓜氨酸特異性T細(xì)胞主要為T(mén)h1和Th17表型，Th1細(xì)胞激活巨噬細(xì)胞作為APC，釋放干擾素-γ、白介素- 2(IL- 2)和TNF-α等促炎細(xì)胞因子。Th17細(xì)胞刺激RA滑膜成纖維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，還通過(guò)分泌IL-17促進(jìn)血管滑膜翳生長(zhǎng)和破骨細(xì)胞分化。Th17細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)的平衡對(duì)于維持免疫耐受至關(guān)重要[7]。Treg通過(guò)直接接觸或分泌TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子，抑制靶向T細(xì)胞或抑制APC的功能，從而抑制免疫應(yīng)答[8]。研究證明，RA 患者Treg數(shù)量減少和功能缺失使Th17/Treg細(xì)胞失衡，導(dǎo)致效應(yīng)性T細(xì)胞(Teff)過(guò)度活化促發(fā)過(guò)度免疫炎癥[9-10]。瓜氨酸化抗原促進(jìn)APC表達(dá)的HLA-DR B1 SE識(shí)別T細(xì)胞上T細(xì)胞受體，使T細(xì)胞活化，從而進(jìn)一步活化B細(xì)胞，使其釋放ACPAs參與RA的發(fā)病，激活的T細(xì)胞可促進(jìn)破骨細(xì)胞活化，使其釋放RANKL，參與RA骨質(zhì)破壞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子，參與RA的炎癥反應(yīng)。

1.2 瓜氨酸化自身抗原的致病性

瓜氨酸化蛋白和ACPAs可以誘導(dǎo)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎。瓜氨酸化絲集蛋白可促進(jìn)RA單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)發(fā)生增殖，而未經(jīng)瓜氨酸化修飾的絲集蛋白則不能引起RA PBMC發(fā)生增殖反應(yīng)。瓜氨酸化蛋白和HLA-DR B1共同表位(shared epitope，SE)都是關(guān)節(jié)炎發(fā)病的必需因素，有研究表明，瓜氨酸化纖維蛋白原可誘發(fā)HLA-DRB1*0401轉(zhuǎn)基因大鼠模型產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎癥狀，使用未瓜氨酸化修飾的纖維蛋白原和瓜氨酸化纖維蛋白原均不能誘發(fā)無(wú)SE野生鼠產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎癥狀[11]。肽?；彼崦搧啺访皋卓箘┛梢詼p輕膠原誘導(dǎo)的RA大鼠模型關(guān)節(jié)炎癥狀，進(jìn)一步說(shuō)明了ACPAs和瓜氨酸化在RA中的致病性[12]。

1.3 肽酰基精氨酸脫亞胺酶

肽?；彼崦搧啺访?peptidylarginine deiminase，PAD)可催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，需要Ca2+輔助活化。PAD有5個(gè)亞型，在不同組織中表達(dá)并具有不同的功能，其中PAD2和PAD4研究較多，PAD2主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、造血干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是維持大腦可塑性所必需的，在多發(fā)性硬化癥中表達(dá)增高[13]。PAD4主要表達(dá)于脾、分泌腺、嗜酸性細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[14]，PAD4催化瓜氨酸化，可改變趨化因子的生理功能和中性粒細(xì)胞胞外誘捕(NETs)的形成，并可促進(jìn)RA產(chǎn)生新的自身抗原，PAD4可能存在自主瓜氨酸化，對(duì)RA具有預(yù)測(cè)和診斷價(jià)值[15]。

1.4 抗瓜氨酸肽抗體

抗瓜氨酸肽抗體(anti-citrullinated peptide antibodies，ACPAs)是識(shí)別瓜氨酸化抗原而發(fā)生交叉反應(yīng)的一類(lèi)抗體。機(jī)體感染微生物后釋放PAD酶會(huì)使局部組織蛋白發(fā)生瓜氨酸化修飾，局部修飾的瓜氨酸化蛋白會(huì)促使機(jī)體發(fā)生一系列免疫反應(yīng)，它通過(guò)激活A(yù)PC提呈抗原，進(jìn)一步活化特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞，產(chǎn)生大量ACPAs，產(chǎn)生的ACPAs可識(shí)別病原體修飾的瓜氨酸化蛋白和機(jī)體自身修飾的瓜氨酸蛋白，從而形成免疫復(fù)合物，激活炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子引起組織損傷。研究表明，絕大多數(shù)的RA患者血清中可檢測(cè)到ACPAs[16]，ACPAs是RA的早期診斷標(biāo)記物，并可用于預(yù)測(cè)病情進(jìn)展。ACPAs的研究歷程從Nienhuis等[17]首先發(fā)現(xiàn)了抗核周因子，證實(shí)其診斷RA具有較高的特異性，隨后發(fā)現(xiàn)了抗角蛋白抗體、抗纖維蛋白原、波形蛋白、α烯醇化酶、抗環(huán)胍氨酸肽等抗體[18]，它們都屬于ACPAs家族成員。van Beers等[19]發(fā)明了一個(gè)詞組“瓜氨酸組”，是指整個(gè)瓜氨酸蛋白，在RA血清和滑膜液中共鑒定出53種。

目前臨床應(yīng)用最多的是抗環(huán)胍氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibodies，CCP)，抗CCP抗體檢測(cè)試劑目前有3代，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮著不同的作用?？笴CP 2抗體對(duì)于RA的診斷特異性更高，抗CCP 2抗體也可出現(xiàn)在自身免疫性肝病和肺結(jié)核中，靶抗原通常是非瓜氨酸化抗原肽?？笴CP 3抗體對(duì)于未分化炎性關(guān)節(jié)炎發(fā)展為RA以及類(lèi)風(fēng)濕因子陰性的RA預(yù)測(cè)價(jià)值更高[20]?？笴CP抗體被美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)列為RA的分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[21]。研究證實(shí)，ACPAs可在RA關(guān)節(jié)炎癥狀出現(xiàn)的數(shù)年前即可檢測(cè)到，并與疾病進(jìn)展迅速和疾病低緩解率相關(guān)，ACPAs越多者，提示會(huì)發(fā)生更多的侵蝕性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，也是關(guān)節(jié)影像學(xué)進(jìn)展的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[22- 24]。患者體內(nèi)短期內(nèi)出現(xiàn)較多ACPAs，提示其進(jìn)展為RA的風(fēng)險(xiǎn)率增高，進(jìn)一步說(shuō)明RA存在瓜氨酸化表位識(shí)別擴(kuò)展現(xiàn)象[25- 26]。綜上所述，APCAs在RA 中具有診斷和預(yù)后判斷，同時(shí)也具有致病作用。

2 瓜氨酸化的影響因素

2.1 遺傳因素

RA的發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為是遺傳易感者在環(huán)境影響和免疫機(jī)制等多種因素相互作用共同導(dǎo)致RA，RA易感者常攜帶HLA-DR B1*0401、*0404等位基因型，其抗原結(jié)合的主要序列是位于其β鏈第70- 74位的共同表位(SE)，SE具有發(fā)展為RA的高風(fēng)險(xiǎn)，自身抗原與HLA-DR B1 SE結(jié)合，提呈給T細(xì)胞，進(jìn)一步活化B細(xì)胞，產(chǎn)生ACPAs，參與RA的發(fā)病機(jī)制。HLA-DR B1 SE是ACPAs產(chǎn)生的危險(xiǎn)因素，但不是RA進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[20，27- 28]。

2.2 環(huán)境因素

吸煙可誘導(dǎo)產(chǎn)生瓜氨酸化蛋白。在吸煙合并間質(zhì)性肺炎的RA患者的肺泡灌洗液發(fā)現(xiàn)有瓜氨酸化修飾的自身抗原[29]。吸煙和矽塵是RA的危險(xiǎn)因素，也是攜帶HLA-DR B1 SE RA產(chǎn)生ACPAs的危險(xiǎn)因素[30]。研究證實(shí)吸煙的RA患者疾病活動(dòng)度評(píng)分更高，更容易出現(xiàn)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，并且關(guān)節(jié)破壞進(jìn)展快、治療反應(yīng)差，也是預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素[31]。吸煙者PAD2表達(dá)升高，可導(dǎo)致肺組織瓜氨酸化抗原暴露增加，激活樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞，產(chǎn)生ACPAs[4]。

2.3 牙齦卟啉單胞菌

牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgingivalis，Pg)感染在RA中發(fā)揮作用。Pg是引起牙周炎(periodontitis，PD)的主要致病菌，其表達(dá)的PAD酶又稱(chēng)為PPAD，可引起微生物和宿主蛋白發(fā)生瓜氨酸化。PPAD不依賴(lài)Ca2+，需要在高PH值中活化，以肽結(jié)合或者游離形式存在[15]。PPAD催化產(chǎn)生的瓜氨酸蛋白與PAD催化的瓜氨酸蛋白具有高度的相似性，都可激活特異性T細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)B細(xì)胞分化成熟，產(chǎn)生ACPAs。盡管PD和RA在病因?qū)W不同，前者是感染，后者是自身免疫，但兩者可能具有相似的致病機(jī)理和對(duì)骨組織破壞的免疫學(xué)路徑，兩者均可促進(jìn)釋放促炎因子和基質(zhì)金屬蛋白酶及活性氧，從而引起關(guān)節(jié)周?chē)M織和牙周組織的破壞及侵蝕[32]。Pg引起的關(guān)節(jié)炎很大程度上取決于Th17/Treg細(xì)胞失衡，可能是由TLR和IL-1引起的Th17活化，產(chǎn)生IL-17Ra信號(hào)傳導(dǎo)，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)加重關(guān)節(jié)炎癥，并導(dǎo)致局部關(guān)節(jié)破壞[4]。

3 瓜氨酸化對(duì)RA自身炎癥的作用機(jī)制

RA患者細(xì)胞內(nèi)、外瓜氨酸化蛋白積聚，是形成ACPAs的抗原驅(qū)動(dòng)。ACPAs與瓜氨酸化抗原相互作用形成免疫復(fù)合物(ICs)，ICs與巨噬細(xì)胞的FcγR結(jié)合，激活巨噬細(xì)胞釋放降解酶和活性氧，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，參與RA的自身炎癥過(guò)程。RA患者滑膜內(nèi)形成的ICs和沉積在軟骨表面的ICs是引起中性粒細(xì)胞活化和滑膜炎癥的重要介質(zhì)，中性粒細(xì)胞活化后產(chǎn)生脫顆粒，并釋放降解酶及活性氧導(dǎo)致局部軟骨和組織破壞。激活的可溶性受體和細(xì)胞因子以及滑膜細(xì)胞的活化、增殖和侵襲均參與RA關(guān)節(jié)的損傷。細(xì)胞活化釋放的IL- 8和白三烯B4等趨化因子，在滑膜中可招募更多的中性粒細(xì)胞參與，進(jìn)一步級(jí)聯(lián)放大RA炎癥過(guò)程。ACPAs與RA骨質(zhì)破壞相關(guān)，表現(xiàn)為骨侵蝕發(fā)展更快，骨皮質(zhì)和骨小梁的結(jié)構(gòu)變化更為顯著。在RA中，ACPAs通過(guò)激活經(jīng)典途徑和替代途徑活化補(bǔ)體，與補(bǔ)體共同作用發(fā)揮免疫募集效應(yīng)，促使趨化炎性細(xì)胞、增加血管通透性、促進(jìn)吞噬作用以及釋放促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，這一過(guò)程不僅可導(dǎo)致組織損傷，而且進(jìn)一步促進(jìn)瓜氨酸化[33- 34]。在環(huán)境因素作用下，組織細(xì)胞異常的細(xì)胞死亡途徑如自噬、凋亡和NETosis又進(jìn)一步增加了瓜氨酸化抗原的暴露[35]。

4 瓜氨酸化與細(xì)胞死亡

真核細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)生的凋亡、自噬、NETosis都涉及到瓜氨酸化。瓜氨酸化通常發(fā)生在正在凋亡的細(xì)胞，凋亡細(xì)胞Ca2+內(nèi)流激活PAD酶，催化肽基精氨酸修飾轉(zhuǎn)變?yōu)殡幕习彼?，?dǎo)致細(xì)胞蛋白發(fā)生降解，形成的凋亡小體被巨噬細(xì)胞吞噬。凋亡的異常調(diào)節(jié)或者凋亡物質(zhì)的無(wú)效清除會(huì)導(dǎo)致死亡細(xì)胞聚集和細(xì)胞核抗原暴露，從而更容易打破自我耐受，RA滑膜細(xì)胞受損形成的凋亡是產(chǎn)生炎癥過(guò)程中的關(guān)鍵點(diǎn)[36]。生理情況下存在自噬，生長(zhǎng)因子缺乏或細(xì)胞衰老等病理情況下，機(jī)體通過(guò)自我吞噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡，自噬參與RA瓜氨酸化過(guò)程中APC的提呈。

NET產(chǎn)生的過(guò)程，稱(chēng)為NETosis，是細(xì)胞內(nèi)死亡的特定過(guò)程，它與壞死和凋亡不同，細(xì)菌、活化的血小板、脂多糖、佛波脂、真菌等刺激物都可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NET，NET富含抗微生物分子，具有捕殺細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲(chóng)等防御作用，也可產(chǎn)生導(dǎo)致組織損傷的病理作用。瓜氨酸化對(duì)于NETosis是必不可少的，參與RA中NET的形成，RA患者的中心粒細(xì)胞更容易形成NETs，并且在RA的滑膜液中發(fā)現(xiàn)了瓜氨酸化組蛋白[37- 38]。NET參與RA發(fā)病機(jī)制主要體現(xiàn)幾個(gè)方面，其一是NET可能是體內(nèi)新抗原的重要來(lái)源和自身抗原被修飾的場(chǎng)所，包括瓜氨酸化自身抗原。其二是NETosis過(guò)于旺盛和NET清除障礙，被修飾的自身抗原清除延遲，持續(xù)性刺激產(chǎn)生免疫炎癥，從而使疾病慢性化[39]。其三是NET的中性粒細(xì)胞胞內(nèi)顆粒成分包括中性粒細(xì)胞趨化因子、細(xì)胞因子及蛋白酶以非特異性形式產(chǎn)生免疫損傷[40- 41]。

5 瓜氨酸化對(duì)RA非免疫細(xì)胞的作用

FLS和破骨細(xì)胞是參與RA發(fā)病機(jī)制的重要細(xì)胞，F(xiàn)LS是RA中最常見(jiàn)的血管翳-軟骨連接處的細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)降解分子，遷移和侵襲關(guān)節(jié)軟骨，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞。研究報(bào)道，瓜氨酸波形蛋白或纖連蛋白可抑制RA FLS細(xì)胞凋亡，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子分泌[42]。ACPAs與FLS表面瓜氨酸抗原相互作用通過(guò)磷酸肌醇3激酶介導(dǎo)機(jī)制促進(jìn)FLS遷移[43]。破骨細(xì)胞在RANKL和M-CSF誘導(dǎo)下從單核巨噬細(xì)胞譜系分化而來(lái)，是RA發(fā)生骨破壞的主要機(jī)制。ACPAs可以直接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，TNF-α也是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和骨吸收的重要因子。ACPAs與FLS和破骨細(xì)胞表面瓜氨酸抗原相互作用會(huì)促進(jìn)FLS遷移和增加破骨細(xì)胞分化[42]，體內(nèi)存在的RF會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)ACPAs相關(guān)的破骨細(xì)胞活化作用。

綜上所述，遺傳、環(huán)境和免疫等多因素相互作用共同導(dǎo)致RA，瓜氨酸化修飾在RA中具有潛在的致病作用，瓜氨酸化修飾可以使蛋白形成新的表位，可促進(jìn)APC對(duì)瓜氨酸化抗原的攝取和識(shí)別，活化T細(xì)胞、促使B細(xì)胞成熟釋放ACPAs。ACPAs在體內(nèi)作用于多種細(xì)胞介導(dǎo)免疫機(jī)制參與RA的發(fā)病，ACPAs是RA診斷、預(yù)測(cè)和轉(zhuǎn)歸的重要指標(biāo)。瓜氨酸化在炎癥組織中廣泛存在，并與凋亡、自噬和NETosis過(guò)程相關(guān)，在RA發(fā)病機(jī)制中起重要作用。