L-纈氨酸代謝工程研究進(jìn)展

蘇躍穩(wěn)，張　昕，王　?。执髮W(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022）

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L-纈氨酸代謝工程研究進(jìn)展

蘇躍穩(wěn)，張昕，王健
（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022）

摘要：L-纈氨酸屬于支鏈氨基酸，是人體八種必需氨基酸之一，廣泛用于食品、醫(yī)藥、飼料、化妝品等領(lǐng)域。由于其含有特殊的生理功能，市場(chǎng)需求較大，使得L-纈氨酸的生產(chǎn)備受關(guān)注。代謝工程有著理性思維的設(shè)計(jì)，在氨基酸生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。主要闡述了L-纈氨酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶及其代謝調(diào)控，綜述了L-纈氨酸合成的代謝工程研究現(xiàn)狀，并對(duì)利用代謝工程原理進(jìn)行L-纈氨酸生產(chǎn)菌的理性設(shè)計(jì)提出展望。

關(guān)鍵詞：L-纈氨酸；發(fā)酵；生物合成；途徑工程

L-纈氨酸是生命體不可或缺的必需氨基酸，在人體代謝中占重要地位。L-纈氨酸可作為人類(lèi)和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充產(chǎn)品，也可作為藥物、化妝品的保濕成分、抗生素以及除草劑［1-3］。此外，L-纈氨酸還可作為飼料添加劑，能改善免疫機(jī)能［4］，2013年對(duì)其需求量已經(jīng)增至2 500 t［5］。目前，大多數(shù)企業(yè)采用對(duì)生產(chǎn)菌進(jìn)行誘變改造菌種，然而由于菌種遺傳背景不明，產(chǎn)量較難提高。研究者運(yùn)用代謝工程技術(shù)構(gòu)建L-纈氨酸的生產(chǎn)菌，明顯提高了其產(chǎn)量。

1　纈氨酸合成途徑中涉及的關(guān)鍵酶

谷氨酸棒狀桿菌的生物合成途徑如圖1所示。L-纈氨酸合成的重要前體是丙酮酸，經(jīng)四步反應(yīng)合成纈氨酸。L-纈氨酸合成受多個(gè)關(guān)鍵酶控制，其中大部分L-纈氨酸合成酶基因已經(jīng)得到克?。阂阴Ｈ樗岷铣擅福ˋHAS，由ilvBN基因編碼），乙酰羥酸異構(gòu)還原酶（AHAIR，由ilvC基因編碼），二羥酸脫水酶（DHAD，由ilvD基因編碼），支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（TA，由ilvE基因編碼）。同時(shí)胞內(nèi)的L-纈氨酸由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體BrnFE（由brnFE基因編碼）運(yùn)至細(xì)胞外［6-11］。

圖1　在谷氨酸棒狀桿菌中L-纈氨酸的生物合成途徑

2　L-纈氨酸合成的代謝工程研究

通過(guò)理性設(shè)計(jì)代謝工程的育種策略，利用代謝工程手段對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有目的的修飾，設(shè)計(jì)菌株的分解代謝、合成代謝的多步級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這樣能最大限度提高L-纈氨酸的產(chǎn)量，并減少副產(chǎn)物的生成，從而避免誘變育種可能對(duì)菌體產(chǎn)生的不良影響。

2.1 L-纈氨酸中心代謝途徑

對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的生物合成分析表明，菌體攝取葡萄糖經(jīng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生L-纈氨酸主要經(jīng)歷糖酵解途徑（EMP）、磷酸戊糖途徑（HMP）、三羧酸循環(huán)途徑（TCA）等。HMP途徑主要提供還原力NADPH，作用于L-纈氨酸合成的乙酰羥基酸異構(gòu)還原酶的催化反應(yīng)，是L-纈氨酸合成的關(guān)鍵途徑。由于在發(fā)酵過(guò)程中ATP大部分是以熱能形式消耗掉的，而ATP的合成需要NADPH，從而造成NADPH的流失，所以從遺傳改造和發(fā)酵方面控制，降低TCA循環(huán)途徑的代謝流，有效提高L-纈氨酸的產(chǎn)量。

2.2增加前體物質(zhì)的供應(yīng)

丙酮酸的流向較為廣泛，主要有三羧酸循環(huán)、L-纈氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸等的合成，還有一些有機(jī)酸，如乳酸、乙酸等。丙酮酸是L-纈氨酸合成的重要前體物質(zhì)，降低丙酮酸的旁路消耗，可以提高L-纈氨酸的產(chǎn)量［12］。根據(jù)代謝分析模擬敲除aceF基因和mdh基因，滅活丙酮酸脫氫酶復(fù)合體和蘋(píng)果酸脫氫酶，從而減少丙酮酸流失，使其更多地流向L-纈氨酸的合成途徑，提高L-纈氨酸的產(chǎn)量。目前研究多集中于優(yōu)化其細(xì)胞內(nèi)的可用性，一種是敲除多個(gè)D-泛酸鈣的合成基因panBC，結(jié)果造成輔酶A限制丙酮酸脫氫酶反應(yīng)的有效性，從而使丙酮酸濃度提高30倍，最終提高L-纈氨酸產(chǎn)量。對(duì)谷氨酸棒狀菌ΔilvAΔpanBC（pJC4ilvBNCD）進(jìn)行代謝控制分析，根據(jù)動(dòng)態(tài)細(xì)胞代謝數(shù)據(jù)建造動(dòng)力學(xué)路徑模型，推測(cè)丙酮酸供應(yīng)仍受限制，提高丙酮酸產(chǎn)量以及L-纈氨酸途徑基因需要過(guò)表達(dá)，才能達(dá)到較為平衡高產(chǎn)。在L-纈氨酸合成途徑中二羥酸脫水酶反應(yīng)最快，而乙酰羥酸異構(gòu)還原酶、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和L-纈氨酸分泌反應(yīng)最慢。另外，由于敲除aceE基因，降低編碼E1p亞基酶復(fù)合物的含量，造成丙酮酸脫氫酶不足，最終使丙酮酸濃度可達(dá)17 mmol/L。同時(shí)敲除PQO基因（編碼丙酮酸/醌氧化還原酶），以乙酸和葡萄糖為碳源，該丙酮酸脫氫酶缺陷型生產(chǎn)菌L-纈氨酸產(chǎn)量可達(dá)26.4 g/L，產(chǎn)物最大得率為0.52 mol/mol（L-纈氨酸/葡萄糖）。Kyowa等［13］通過(guò)選育，篩出對(duì)丙酮酸敏感菌株，從而降低丙酮酸脫氫酶的活性，提高丙酮酸的積累。Blombach等［14］敲除三羧酸循環(huán)的aceE基因，從而提高丙酮酸的產(chǎn)量，分批發(fā)酵L-纈氨酸產(chǎn)量高達(dá)48 g/L。Hou等［15］研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)L-纈氨酸生產(chǎn)菌迄今還分泌L-丙氨酸高達(dá)7.5 g/L。L-丙氨酸跟L-纈氨酸的化學(xué)性質(zhì)相似，這就增加分離純化的難度和成本。在谷氨酸棒狀桿菌中轉(zhuǎn)氨酶AlaT和AvtA是L-丙氨酸的合成酶。谷氨酸棒狀桿菌ΔilvAΔpanBC（pJC1ilvBNCD）滅活A(yù)laT基因，可以減少80%的L-丙氨酸合成，不過(guò)菌體生長(zhǎng)速率也下降50%。

2.3終端代謝途徑

在谷氨酸棒狀桿菌中L-纈氨酸合成與L-異亮氨酸合成共用AHAS、AHAIR、DHAD和TA這四種酶，主途徑對(duì)AHAS的親和性小于L-異亮氨酸途徑。這導(dǎo)致丙酮酸優(yōu)先被利用于合成L-異亮氨酸，對(duì)合成L-纈氨酸是不利的［16-17］。

2.3.1過(guò)表達(dá)主途徑基因

乙酰乳酸合成酶包括催化亞基和調(diào)節(jié)亞基，其中由ilvN編碼的小亞基具有調(diào)節(jié)功能，由ilvB編碼的大亞基具有催化功能［18］。在大腸桿菌中存在三種同工酶，AHAS I、AHAS II、AHAS III，而AHAS I的活性最高，其基因ilvBN的啟動(dòng)子具有獨(dú)特調(diào)控途徑，是降解物阻遏系統(tǒng)中的cAMP-依賴(lài)性蛋白誘導(dǎo)的唯一操縱子，與ilvC基因形成的操縱子是過(guò)表達(dá)L-纈氨酸的關(guān)鍵［19］。Tobias Bartek等［20］將含基因ilvBNCDE的質(zhì)粒ΔaceE pJC4ilvBNCE導(dǎo)入缺陷丙酮酸脫氫酶的谷氨酸棒狀桿菌中，其中ilvBN基因編碼乙酰乳酸合酶過(guò)表達(dá)，有效轉(zhuǎn)化丙酮酸，減少丙氨酸產(chǎn)生，增加L-纈氨酸產(chǎn)量，有效減少α-酮異戊酸。纈氨酸產(chǎn)量為12.3 g/L，而丙酮酸降為0.09 g/L，α-酮異戊酸降為0.24 g/L。Hoechst等［21］將基因ilvE克隆到pBR322質(zhì)粒中，使重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌DG30中，構(gòu)建的工程菌能過(guò)表達(dá)支鏈轉(zhuǎn)移酶，可以提高L-纈氨酸的產(chǎn)量。

2.3.2解除調(diào)節(jié)反饋抑制

乙酰乳酸合成酶受到三種氨基酸的抑制，依次為L(zhǎng)-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸，其50%抑制濃度分別為0.9、3.1和6 mmol/L［22］。L-纈氨酸合成的第一限速酶是乙酰乳酸合成酶，受L-纈氨酸反饋抑制，也受末端產(chǎn)物多階阻遏。將乙酰乳酸合成酶調(diào)節(jié)亞基的Gly-Ile-Ile突變?yōu)锳sp-Asp-Phe完全解除支鏈氨基酸對(duì)乙酰乳酸合成酶的反饋抑制。可以通過(guò)敲除ilvA基因和leuA基因來(lái)解除L-異亮氨酸和L-亮氨酸對(duì)乙酰乳酸合成酶的抑制，還可以弱化其啟動(dòng)子，降低這兩種氨基酸的產(chǎn)量，形成滲透性缺陷型［23］。Holatkod等［24］增強(qiáng)ilvD和ilvE基因的啟動(dòng)子活性，降低ilvA和leuA基因的啟動(dòng)子活性，發(fā)酵48 h搖瓶培養(yǎng)積累15.9 g/L。通過(guò)對(duì)ilvGMEDA操縱子進(jìn)行基因重組修飾，將ilv操縱子敲除破壞或敲除操縱子中的ilvE基因，減弱蘇氨酸脫氨酶活性，減弱旁路代謝流，進(jìn)而提高L-纈氨酸產(chǎn)量。由于ilvBNC的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄弱化，而對(duì)于轉(zhuǎn)錄弱化來(lái)說(shuō)，前導(dǎo)肽的翻譯是比較重要的，只是ilvBNC的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)和翻譯起點(diǎn)相距僅有1 bp，沒(méi)有核糖體結(jié)合點(diǎn)，可以通過(guò)改變前導(dǎo)序列纈氨酸的密碼子，進(jìn)而解除弱化。此外，短導(dǎo)肽的轉(zhuǎn)錄和ilvBNC的轉(zhuǎn)錄還受到2-酮丁酸的誘導(dǎo)，說(shuō)明ilvBNC的表達(dá)不是獨(dú)立機(jī)制，還受其他物質(zhì)調(diào)控。

2.4提高NADPH的策略

NADPH在合成L-纈氨酸中扮演重要角色。每合成1 mol L-纈氨酸需要消耗1 mol葡萄糖和2 mol NADPH。NADPH在合成L-纈氨酸中消耗占總量的39.78%，其產(chǎn)生途徑主要是HMP途徑，應(yīng)改變NADPH代謝流，使NADPH更多地流向L-纈氨酸合成途徑。NADPH與NADH存在動(dòng)態(tài)平衡，每合成1 mol NADH需要消耗2 mol NADPH，從而造成NADPH流失。而NADPH作用于乙酰羥酸異構(gòu)還原酶和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的催化反應(yīng)中，提高其催化效率能提高L-纈氨酸的合成。NADH的合成主要在糖酵解途徑，關(guān)鍵酶磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（PGI，由pji基因編碼）催化合成。敲除該基因可以使葡萄糖更多流向HMP途徑，從而提高NADPH產(chǎn)量。另外，通過(guò)過(guò)表達(dá)膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶可促進(jìn)NADH向NADPH轉(zhuǎn)化［25］。根據(jù)代謝網(wǎng)絡(luò)分析，不同的模式下，改變NADPH的反應(yīng)通路，產(chǎn)物最大得率由0.5 mol/mol（L-纈氨酸/葡萄糖）提高到1 mol/mol（L-纈氨酸/葡萄糖）。NADPH由異檸檬酸脫氫酶提供，產(chǎn)物最大得率僅為0.5 mol/mol（L-纈氨酸/葡萄糖）。碳通量的重新定向，明顯提高磷酸戊糖途徑，產(chǎn)生更多NADPH，產(chǎn)物最大得率提高到0.86 mol/mol（L-纈氨酸/葡萄糖），從而減少碳源的浪費(fèi)。在這條路線上，丙酮酸羧化酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的催化下將NADH的氫傳遞到NADPH［26］。

2.5 L-纈氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)

在谷氨酸棒狀桿菌中將L-纈氨酸輸送到胞內(nèi)是通過(guò)brnQ基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BrnQ完成的，然后通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體BrnFE分泌到胞外。如果L-纈氨酸不及時(shí)地排出體外，則造成對(duì)L-纈氨酸合成途徑關(guān)鍵酶受到抑制，同時(shí)弱化編碼基因的轉(zhuǎn)錄，最終造成L-纈氨酸合成減少。研究表明全局調(diào)控因子Lrp可結(jié)合在lrp和brnF之間的DNA上，能刺激BrnFE的表達(dá)［27］。

2.6代謝流的全局調(diào)控

傳統(tǒng)上代謝工程主要是根據(jù)代謝調(diào)控機(jī)制采用一些常規(guī)手段，由基因缺失、基因突變、關(guān)鍵酶表達(dá)以及基因重組等來(lái)構(gòu)建新的合成途徑。由于L-纈氨酸途徑只涉及一種或多種基因的表達(dá)或調(diào)控，往往只能實(shí)現(xiàn)局部途徑最優(yōu)化，很難實(shí)現(xiàn)細(xì)胞全局最優(yōu)化。因此從全局分析，綜合考察基因的調(diào)控與表達(dá)、酶活性的調(diào)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)代謝流，同時(shí)還涉及細(xì)胞能量、輔酶因子、前體等變化的過(guò)程，將高通量組學(xué)分析技術(shù)和構(gòu)建基因組水平的代謝網(wǎng)絡(luò)等現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用到全局系統(tǒng)代謝工程上，進(jìn)而對(duì)整個(gè)合成途徑進(jìn)行全局優(yōu)化。Park等［28］用代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)基因進(jìn)行模擬敲除，構(gòu)建出高產(chǎn)L-纈氨酸的工程菌。Magnus等［29］將谷氨酸棒狀桿菌ΔilvAΔpanBC （pJC4ilvBNCD）根據(jù)動(dòng)態(tài)胞內(nèi)代謝數(shù)據(jù)，進(jìn)行代謝控制分析和應(yīng)用動(dòng)力學(xué)L-纈氨酸路徑模型，該模型推測(cè)出丙酮酸供應(yīng)仍是受限的，需要用L-纈氨酸途徑的基因過(guò)表達(dá)進(jìn)行平衡，經(jīng)預(yù)測(cè)DHAD是各反應(yīng)中最快的，在L-纈氨酸分泌途經(jīng)序列中，AHAIR、TA和L-纈氨酸排出為反應(yīng)最慢的。Hasegawa等［30］敲除乳酸脫氫酶基因，過(guò)表達(dá)關(guān)鍵酶基因ilvBN、ilvC、ilvD以及ilvE，構(gòu)建工程谷氨酸棒狀桿菌，并進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，發(fā)酵48 h時(shí)L-纈氨酸產(chǎn)量達(dá)到227 g/L，是目前最高水平。Park等［31］采用代謝工程改造L-纈氨酸生產(chǎn)菌，分析其代謝網(wǎng)絡(luò)定點(diǎn)敲除基因ilvA、panB、leuA、lacI，解除了其合成途徑中反饋抑制，阻斷其他途徑的消耗，除去發(fā)酵副產(chǎn)物，糖酸轉(zhuǎn)化率提高10倍（為0.22 g/g）。其中用轉(zhuǎn)錄組分析雙重減少lrp基因的表達(dá)，lrp基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能有效激活ilvIH的表達(dá)。因此，將lrp基因?qū)胭|(zhì)粒pTrc184并過(guò)表達(dá)，較原菌株L-纈氨酸產(chǎn)量可提高22%。另外，過(guò)表達(dá)ygaZH操縱子，可使E. coli Val（pKBRilvBNCED）（pTrc184ygaZHlrp）產(chǎn)量提高7.61 g/L。

3　展望

代謝工程通過(guò)系統(tǒng)分析L-纈氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)，找出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，用特定手段進(jìn)行改進(jìn)，對(duì)途經(jīng)進(jìn)行修飾。代謝工程目的性強(qiáng)，最大程度提高L-纈氨酸產(chǎn)量，減小副產(chǎn)物的產(chǎn)量，也為下游分離提純降低成本。未來(lái)對(duì)L-纈氨酸生產(chǎn)菌進(jìn)行基因水平、蛋白質(zhì)水平等多層次分析，對(duì)L-纈氨酸生產(chǎn)菌所有節(jié)點(diǎn)進(jìn)行全局分析，再結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)以及計(jì)算機(jī)建模等現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行改良，一定會(huì)通過(guò)理性設(shè)計(jì)構(gòu)建出穩(wěn)定性好、副產(chǎn)物少，更適合工業(yè)化生產(chǎn)的L-纈氨酸生產(chǎn)菌株。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Advances in metabolic engineering for L-valine production

SU Yuewen，ZHANG Xin，WANG Jian
（College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130022，China）

Abstract：As one of eight essential amino acids of human，L-valine belongs to branched-chain amino acid and is widely used in food，medicine，feed，cosmetics and other fields. Because of its special physiological functions，traditional fermentation cannot meet the demand of market，which makes L-valine production a major concern. Rational design of metabolic pathway has been widely used in amino acid production. This review focuses on the key enzymes and their metabolic regulation in L-valine biosynthetic pathway. Moreover，the related metabolic regulation strategy and research status of metabolic engineering of L-valine were summarized. Finally，the rational design of L-valine producing strain was discussed.

Keywords：L-valine；fermentation；biosynthetic pathway；metabolic engineering

作者簡(jiǎn)介：蘇躍穩(wěn)（1990—），男，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向?yàn)榘被岽x工程，E-mail：suyw0820@126.com.

收稿日期：2015-12-20

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ92

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-2214（2016）02-0118-05