羊肚菌的栽培、液體發(fā)酵及開發(fā)利用研究進展*

朱永樂，高夢祥

（長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434022）

羊肚菌（Morchella spp.）屬于子囊菌亞門（Ascomycotina） 盤菌綱 （Discomycetes） 盤菌目 （Pezizales） 羊肚菌科 （Morchellaceae） 羊肚菌屬（Morchella）[1]，又名編笠菌、草笠竹、羊肚菜，因菌蓋表面生有許多小凹坑，外觀極似羊肚而得名[2]。羊肚菌是一種具有重要經(jīng)濟價值的食藥兼用大型真菌，因具有較高的商業(yè)價值、美麗的外觀、藥用特性和獨特的風味而受到廣泛關(guān)注[3]。

1 人工栽培的研究

1.1 人工栽培技術(shù)

野生羊肚菌馴化難度極高，最初由美國科學(xué)家Ower[4]首次開展羊肚菌的人工栽培研究，隨后經(jīng)許多中國科學(xué)家的不懈探索，于1993年實現(xiàn)了國內(nèi)羊肚菌人工栽培的技術(shù)突破[5]。如今，大棚栽培以產(chǎn)量更高、風險更小且可以錯開時節(jié)出菇等優(yōu)勢，成為了目前國內(nèi)羊肚菌栽培的主要方式[6]。為了倡導(dǎo)綠色健康發(fā)展，套種、輪作、沙漠栽培等各種栽培模式也被運用于羊肚菌生產(chǎn)領(lǐng)域[7-9]。

1.2 人工栽培羊肚菌的種類及分布

目前，可實現(xiàn)人工栽培的羊肚菌種類達20余種，其中廣泛栽培的品種有六妹羊肚菌（Morchella sextelata）、七妹羊肚菌 （Morchella septimelata）、梯棱羊肚菌 （Morchella importuna）、粗柄羊肚菌（Morchella crassipes） 等[7]。不同的品種各有優(yōu)劣，不同地區(qū)受環(huán)境因素影響，適宜栽培的羊肚菌種類也有所差異。羊肚菌是一種中低溫菌類，通常在北方栽培較多。貴州省和甘肅省中部的榆中縣、隴南市等地氣溫適宜，因此大多以不耐高溫但產(chǎn)量高、品相好的六妹羊肚菌為主[7-9]。四川省的旺蒼縣和江安縣、山東省的淄博市和滕州市以及湖北省等地大面積栽培梯棱羊肚菌，主要原因在于梯棱羊肚菌耐儲存和運輸，方便銷往全國各地[10-14]。西藏自治區(qū)、云南省麗江市、山西省等地大規(guī)模栽培粗柄羊肚菌[15-17]。而南方沿海地區(qū)近幾年也開始引進羊肚菌，如浙江省仙居縣、嘉興市于2020年開始栽培羊肚菌；由于南方氣溫較高，通常選擇抗性較強的六妹羊肚菌[18-19]。

2 液體發(fā)酵的研究

野生羊肚菌供不應(yīng)求，人工栽培的推廣也存在許多不足之處。例如，羊肚菌栽培技術(shù)要求較高，菌核的形成以及出菇管理等關(guān)鍵點難以把握；羊肚菌生長條件苛刻，環(huán)境條件控制較為困難；病蟲害時有發(fā)生；使用大棚栽培前期投入成本高[10，13，20]。而研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌液體發(fā)酵菌絲的活性成分種類與子實體基本相同，且發(fā)酵周期短，生產(chǎn)效益高，因此目前許多學(xué)者著眼于羊肚菌液體發(fā)酵[21]。

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源

碳源會影響羊肚菌菌絲體的生長和代謝產(chǎn)物的含量。六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌在麥芽糖培養(yǎng)基中菌絲、菌核生長狀態(tài)較好，而在蔗糖培養(yǎng)基中長勢最弱[22]。在以紅糖作為碳源的培養(yǎng)基中，六妹羊肚菌的生物量比對照組增加了112%[23]。此外，碳源中添加生梨50 g和葡萄糖5 g的營養(yǎng)物，六妹羊肚菌菌絲長勢更好[24]。以淀粉作為碳源，六妹羊肚菌菌絲在平板培養(yǎng)基上的生長速度最快，為2.43 cm·d-1[25]。以淀粉和乳糖為復(fù)合碳源，比僅添加乳糖和淀粉，對羊肚菌菌核與菌絲的生長促進作用更顯著[26]。以葡萄糖及玉米粉混合作為天然培養(yǎng)料，比不加玉米粉培養(yǎng)基中的菌絲體干質(zhì)量增加了51.8%[27]。

2.1.2 氮源

氮源主要分為有機氮和無機氮，在篩選培養(yǎng)基氮源時發(fā)現(xiàn)羊肚菌在蛋白胨、黃豆粉、酵母膏等有機氮中均能很好地生長，而在尿素、硫酸銨、硝酸鉀等無機氮中生長不良[28]。以酵母膏為氮源時羊肚菌菌絲體生物量比硝酸鉀、硫酸銨等作為氮源時平均增加了近50%[29]。氮源為蛋白胨時羊肚菌菌絲體含量顯著高于硝酸鉀作為氮源時的含量[30]。有機氮對羊肚菌生長的促進作用普遍優(yōu)于無機氮，其主要原因可能是有機氮中蛋白質(zhì)比較多，能促進多種酶反應(yīng)的發(fā)生，產(chǎn)生種類豐富的氨基酸；而無機氮源成分比較單一，不利于菌絲體的生長代謝[31]。也有文獻報道，硝酸銨、硝酸鈉等無機氮作為氮源與有機氮相比，菌絲體干質(zhì)量無顯著差異[23]。造成這種差異的主要原因可能是羊肚菌品種的不同。

2.1.3 金屬離子

金屬離子是羊肚菌菌絲生長不可或缺的一類物質(zhì)。通常通過影響跨膜運輸、微生物的生理生化反應(yīng)來調(diào)控羊肚菌的生長和次級代謝產(chǎn)物合成。

不同的離子對羊肚菌的影響也不盡相同。適宜濃度的MgSO4能夠促進羊肚菌多糖的代謝[32]。孟祥麟等[33]選擇梯棱羊肚菌為試驗菌株，KH2PO4和Mg－SO4分別按 2 g·L-1的量添加，VB1按 10 mg·L-1的量添加，菌絲生長速率最快。但朱永真等[34]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KH2PO4對六妹羊肚菌菌絲生長有一定抑制作用，MgSO4的促進作用也不顯著，雖然最低離子含量也為0.2 g·L-1，但可能因培養(yǎng)基及菌種的不同而產(chǎn)生了不同。

2.2 發(fā)酵條件的確定

羊肚菌的基礎(chǔ)發(fā)酵條件目前并沒有統(tǒng)一的結(jié)論，除了供試菌株的不同之外，研究重點不同也是主要原因。多糖、蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物開始大量代謝的時間不同，對溶氧量、pH、溫度等條件的要求也不相同[35]。羊肚菌菌絲體的適宜生長條件為溫度25℃，初始pH為7，接種量為5%，培養(yǎng)時間為5 d[36]。在羊肚菌富硒發(fā)酵研究中，當250 mL錐形瓶中裝入發(fā)酵液100 mL，培養(yǎng)條件為溫度24℃、時間5 d、轉(zhuǎn)速100 r·min-1時，硒化蛋白和多糖含量明顯增加[37]。在羊肚菌多糖積累發(fā)酵研究中，當250 mL錐形瓶中裝入發(fā)酵液100 mL，發(fā)酵條件為溫度25℃、pH 6、發(fā)酵天數(shù)5.98 d、轉(zhuǎn)速217.44 r·min-1時發(fā)酵效果最好[38]。研究羊肚菌蛋白質(zhì)的理化特性時，最佳發(fā)酵條件為接種量15%、轉(zhuǎn)速180 r·min-1、溫度25℃、培養(yǎng)時間7 d[39]。羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)凝集素（蛋白質(zhì)或糖蛋白）的最優(yōu)條件為pH 7、溫度28℃、培養(yǎng)7 d[40]。綜上分析，羊肚菌蛋白質(zhì)積累需要更長的時間，普遍比菌絲的最佳生長周期多2天左右；且羊肚菌多糖發(fā)酵對溶氧量的要求更高。

2.3 誘導(dǎo)因子的研究

微生物所受到的各種誘導(dǎo)因子或信號分子的脅迫，主要分為物理、化學(xué)、生物3種誘導(dǎo)方式。關(guān)于羊肚菌中運用物理和化學(xué)方法進行誘導(dǎo)的相關(guān)研究比較多，但關(guān)于真菌激發(fā)子等生物誘導(dǎo)方法鮮有報道。誘導(dǎo)因子的作用機制一般都是通過激發(fā)細胞的防御機制或者影響轉(zhuǎn)錄因子的積累，進而影響相關(guān)酶基因的表達，最終影響次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

2.3.1 化學(xué)誘導(dǎo)

近年來，將生長激素應(yīng)用于食用菌菌絲的培養(yǎng)，成為了食用菌發(fā)酵研究的熱點之一。植物激素的作用機理主要分為2種途徑：1）通過一些信號通道加快能量轉(zhuǎn)化效率，增加酶的活性促進菌絲生長；2）改變細胞形態(tài)，通過細胞延長、拉伸以及加快細胞成熟來增強營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。赤霉素GA（gibberellins） 和 α-萘乙酸 NAA （1-naphthlcetic acid）對羊肚菌液體發(fā)酵均具有促進作用，對比不加激素的處理，菌絲生長速率增加了26.7%；且GA的促進作用比NAA更明顯[41]。熊亞等[42]選擇吲哚乙酸IAA（3-Indoleacetic acid）、NAA、VB1、VB2、VB6、VB12、VC、葉酸等作為生長因子，發(fā)現(xiàn)添加NAA的促進作用最明顯，羊肚菌菌絲體干質(zhì)量最大可以達到4.7 g·L-1。

除了生長激素之外，一些成分復(fù)雜的混合提取液也常作為誘導(dǎo)劑應(yīng)用于食用菌產(chǎn)業(yè)[43]。研究表明，在液體發(fā)酵時添加木醋液可顯著促進羊肚菌菌絲的生長；與不添加木醋液的對照組相比，生物量最高增加了87.50%[44-45]。中藥黃芪的提取液可顯著提高羊肚菌深層發(fā)酵后菌絲體多糖和胞外多糖的含量[46]。

外源添加代謝途徑的中間產(chǎn)物也可以促進菌絲體生長。如研究環(huán)腺苷酸cAMP（cyclic adenosine monophosphate）對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發(fā)生的影響時，發(fā)現(xiàn)cAMP對菌絲生長作用不顯著，但顯著抑制菌核發(fā)生；而其降解產(chǎn)物腺苷酸AMP（adenine nucleotides）對菌核沒有明顯作用，但是可以促進羊肚菌的菌絲生長[47]。

2.3.2 物理誘導(dǎo)

物理信號因子誘導(dǎo)不僅刺激微生物生長，還能誘導(dǎo)一些有益代謝產(chǎn)物的積累[48]。舒黎黎等[49]研究發(fā)現(xiàn)，混合光源比單光源對羊肚菌的生長更為有利，對子實體的原基形成和生長促進作用顯著。

3 主要代謝產(chǎn)物的分離提取

3.1 常用的提取方法

羊肚菌的主要代謝產(chǎn)物有多糖、蛋白質(zhì)、三萜等，通常通過分離提取獲得，以不同物質(zhì)在不同溶劑中的溶解性不同達到分離的目的。這些提取方法的主要差別在于，采取不同的處理方法提高代謝產(chǎn)物的得率，可達到更好的提取效果。對于羊肚菌多糖的提取，通常先采用丁醇-氯仿除去蛋白沉淀，再通過水提醇沉的方法獲得多糖[55]。三萜提取同樣依據(jù)其溶于醇的特性，先破碎羊肚菌菌絲細胞，繼而提取獲得三萜[50]。黃酮多酚等功能成分的提取方法也大同小異[51]。影響提取效果的因素主要有提取劑的比例、提取溫度、提取時間等。目前，對于各種物質(zhì)都已經(jīng)各自形成一套行之有效的提取步驟，當前的研究熱點逐漸轉(zhuǎn)到采用適合的輔助手段來提高得率和產(chǎn)物活性。

3.2 輔助提取方法

不同輔助提取方法均可顯著地提高產(chǎn)物得率[52]。超聲波輔助提取是先用超聲波勻漿器粉碎菌絲，再提取羊肚菌多糖，能更好地將胞內(nèi)產(chǎn)物釋放出來，使多糖得率增加了26%[53]。超聲輔助熱水浸提提取羊肚菌發(fā)酵菌絲體三萜化合物，提取量可以達到166 mg·L-1，顯著高于對照組[54]。超聲-微波協(xié)同法UMSE（ultrasonic-microwave synergistic extraction）提取羊肚菌多糖，最適提取條件下多糖得率可達60.17%[54]。與超聲輔助萃取法和微波輔助萃取法相比，UMSE的提取效率最高[55]。脈沖電場PEF（pulsed electric fields） 法提取羊肚菌多糖，不僅縮短了提取周期，且具有較高的提取率[56]。

生物酶法可以破碎細胞，或者將大分子先降解為更容易被分離提取的小分子，以提高提取效率。比如用木瓜蛋白酶輔助提取羊肚菌蛋白質(zhì)水提物MPH（Morchella protein hydrolysate），在最適酶解條件下，制備的MPH活性更好，得率更高[57]。提取羊肚菌的主要呈味物質(zhì)谷氨酸時，先用外肽酶與外切β-葡聚糖酶進行水解，谷氨酸含量可達20.91 g·kg-1，而且對其他有益成分的損害顯著降低[58]。

4 羊肚菌功能成分的研究與開發(fā)

4.1 羊肚菌的功能成分與生物活性

從營養(yǎng)角度看，與許多其他真菌一樣，羊肚菌中的主要營養(yǎng)成分包括糖類、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、脂肪酸、礦物質(zhì)、多酚類化合物、生物堿等[59-60]。

4.1.1 羊肚菌多糖

從羊肚菌發(fā)酵液和菌絲體中分離得到的功能性多糖具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，羊肚菌多糖MEP（Morchella esculenta polysaccharides） 多以葡萄糖吡喃基或半乳糖吡喃基鏈為主，同時還含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、n-乙酰氨基葡萄糖等單糖[61-62]。不同菌株、溫度、培養(yǎng)基類型、pH、提取方法等，對多糖得率和生物活性均有影響；糖苷鍵構(gòu)型、糖殘基類型和比例、糖殘基連接位點和順序、分子量等各種差異，導(dǎo)致了羊肚菌多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，也影響其生物活性[63]。但是總體來說，MEP具有廣泛的生物活性，包括抗腫瘤、抗氧化、抑菌抗炎等[64-66]。

4.1.2 羊肚菌蛋白質(zhì)

羊肚菌菌絲體中的蛋白質(zhì)含量豐富，研究人員發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)提取物具有較強的抗氧化能力[67]。而蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值與所含氨基酸的類型和數(shù)量密切相關(guān)。羊肚菌中氨基酸含量高，包括多種必需氨基酸；其中谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸和亮氨酸[68]。還含有幾種稀有氨基酸，如順3-氨基-l-脯氨酸和亮氨酸等，也是構(gòu)成羊肚菌鮮味的主要成分[69]。

4.1.3 脂肪酸及其他成分

羊肚菌中含有豐富的脂肪酸，以亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸為主，占比高達85.38%，能有效防治高血壓、高血脂、高血糖、冠心病及腎功能不全等；且具有抗衰老、清除自由基的能力[70-71]。羊肚菌也產(chǎn)生其他幾種次級代謝物，包括酶、甾醇、類黃酮、生物堿等[72]。

4.2 羊肚菌產(chǎn)品的開發(fā)

4.2.1 初級加工

初級加工主要包括羊肚菌鮮品保鮮處理與干品處理。鮮品的口味最佳，營養(yǎng)價值最高，品相好壞決定價格。個頭大、品相好的多用于高檔宴席，品質(zhì)稍次的用于家庭烹飪或中低端市場銷售[70]。由于鮮品儲存、運輸困難，市面上常見多為干制品。不同的干制方法對羊肚菌的破壞程度也不相同，目前常用的是變溫烘干法和階段式凍干法。凍干羊肚菌風味濃郁，凍干法處理的羊肚菌復(fù)水性及營養(yǎng)物質(zhì)保留顯著高于烘干羊肚菌，但成本和能耗較高，且操作不便[73-74]。高壓靜電處理對羊肚菌保鮮和烘干均有明顯作用，靜電處理可將鮮品的保質(zhì)期延長至20 d，顯著高于對照組，同時其他品質(zhì)也優(yōu)于對照。并且由于電場具有常溫、干燥的特性，可使干制品最大程度地保留風味成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)[75]。

4.2.2 精深加工

食用菌精深加工是指通過物理、化學(xué)、生化等技術(shù)提取食用菌的有效成分，加工成各種產(chǎn)品[76]。目前，比較常見的是以羊肚菌為原料，采用不同的加工工藝與其他材料搭配生產(chǎn)的產(chǎn)品。比如用豬肉和羊肚菌復(fù)合制作的羊肚菌肉丸；以羊肚菌、精瘦肉和菜籽油為主要原料制成的羊肚菌肉醬；以羊肚菌為原料制作的酸奶等[77-79]。此外還有用酶處理羊肚菌，以酶解液為底物制備羊肚菌美拉德反應(yīng)肉味調(diào)味基料，將其應(yīng)用于調(diào)味品[80]。但這些產(chǎn)品在本質(zhì)上是對羊肚菌整體的利用，不適用于羊肚菌液體發(fā)酵液。

隨著羊肚菌液體發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的逐漸擴大，研究者開始著眼發(fā)酵液中具有廣泛生物活性的各種物質(zhì)，嘗試將羊肚菌液體發(fā)酵產(chǎn)生的功能成分制作為保健食品[81]。如將羊肚菌的膳食纖維應(yīng)用在固體飲料中，制作了酸、堿2款溶解片，并確定了溶解片的主體配方[82]。通過羊肚菌富硒發(fā)酵工藝產(chǎn)生的硒多糖、硒蛋白以及硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸等，為富硒羊肚菌的開發(fā)利用提供了新路徑[83]。利用羊肚菌菌絲水提液對草莓果實感染灰霉病菌的抑制作用，提高草莓果實對病原菌的抗性和采后品質(zhì)[84]。

5 展望

我國羊肚菌的人工栽培處于世界領(lǐng)先水平，最早在云、貴、川等地大力發(fā)展羊肚菌產(chǎn)業(yè)，并逐漸在全國范圍推廣。但目前還面臨著許多困難，如人工栽培技術(shù)還不成熟，菌種選育和遺傳育種工作難以進行等?？衫迷|(zhì)體融合等適當手段，培育優(yōu)良的品種或菌株[85]。

在羊肚菌工廠化發(fā)酵方面，研究最多的是對培養(yǎng)基、發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以獲得目標產(chǎn)物。未來的方向應(yīng)該是篩選性價比高的大范圍工業(yè)化培養(yǎng)基原料，并且根據(jù)生產(chǎn)目的的不同選擇專一性更強的培養(yǎng)基。另外，針對羊肚菌主要代謝產(chǎn)物的外源表達研究較少，在大腸桿菌等模式菌株體內(nèi)進行生物合成，將是獲得羊肚菌獨特代謝產(chǎn)物的有效途徑。

誘導(dǎo)是常用于液體發(fā)酵中擴大產(chǎn)量的方法，目前化學(xué)誘導(dǎo)在羊肚菌培養(yǎng)中應(yīng)用廣泛。但是由于對羊肚菌中一些產(chǎn)物的產(chǎn)生機制仍不明確，以外源添加中間產(chǎn)物促進次級代謝產(chǎn)物積累的研究，還依賴于機制研究的進一步突破。在生物誘導(dǎo)方面，微生物的細胞表面結(jié)構(gòu)，如一些膜蛋白，以及菌絲降解物、真菌體外分泌物等，會使細胞內(nèi)的某些基因得到表達，從而激活某些次生代謝途徑，這方面的研究在羊肚菌液體發(fā)酵領(lǐng)域還未見報道。物理誘導(dǎo)方法如光照、變溫發(fā)酵等，目前只有零星報道，超聲、磁場、電場等輔助手段目前還沒有運用于羊肚菌發(fā)酵。由于物理誘導(dǎo)具有無污染、綠色環(huán)保等優(yōu)點，未來可進一步開展相關(guān)研究。同時，因微波、電場等措施能在不降低提取效率的基礎(chǔ)上最大限度保留原有成分的生理生化特性，能夠為羊肚菌主要成分提取中存在的產(chǎn)物得率低、活性損失等問題提供解決方法。綜上可以看出，物理手段的合理運用將成為羊肚菌研究領(lǐng)域的一個重要研究方向。

羊肚菌是一種食藥兼用的真菌，目前主要作為食品受到大眾喜愛，比如羊肚菌調(diào)味品、飲料、醬制品等，在市面上均有售賣。而其藥用功能，如降血脂、減輕因放療、化療引起的副作用等，尚停留在實驗室研究階段，很少有相關(guān)藥品出現(xiàn)在大眾視野。因此，對其藥用成分進行深入研究，開發(fā)療效好、副作用小的新藥，并深入探索藥用成分的結(jié)構(gòu)，進行化學(xué)合成，加快羊肚菌下游產(chǎn)品的開發(fā)進程，具有廣闊的商業(yè)前景。此外，羊肚菌發(fā)酵液的主要成分還具有抗衰老的作用，可以改善皮膚狀態(tài)，提高皮膚細胞活力。可以預(yù)見，羊肚菌發(fā)酵液作為化妝品原料在化妝品領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景。