不同殺青工藝對裸花紫珠主要有效成分的影響

宋 瀟 左美玲 楊中保

湖南省長沙市第四醫(yī)院 湖南師范大學附屬長沙醫(yī)院藥學部，湖南長沙 410006

裸花紫珠是馬鞭草科紫珠屬的干燥葉，裸花紫珠性味苦、微辛、平。具有止血、消炎、化濕濁、解腫毒的功能。主治細菌性感染引起炎癥腫毒，急性傳染性肝炎，內(nèi)外傷出血[1-4]。裸花紫珠主要含有黃酮類、苯丙素類與有機酸類成分[5-10]。據(jù)報道，鮮葉被采摘后，其葉內(nèi)原果膠酶、轉化酶、淀粉酶等活性增強，加速淀粉、蛋白質(zhì)的水解[11]；殺青過程通過熱化學反應，可迅速滅活生物活性酶[12-14]。因此從酶滅活角度進行闡釋，“殺青”作為中藥材初加工方式應用廣泛，對中藥材特別是葉類、花類中藥材的活性成分影響十分顯著[15-17]。如枇杷花茶經(jīng)殺青后，黃酮、總酚、三萜酸含量增加，且香氣更加濃郁[18]。隨著中藥傳統(tǒng)炮制技術與現(xiàn)代化工藝的相結合，殺青技術在中藥加工中的應用成為研究熱點。在殺青過程中，不同的工藝參數(shù)對飲片質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響，目前關于裸花紫珠初加工的研究甚少。因此，本研究通過殺青時間和干燥溫度這兩項工藝參數(shù)研究，觀察其對裸花紫珠主要有效成分含量的影響，旨在提供適宜裸花紫珠炮制的加工方式，為裸花紫珠的加工生產(chǎn)提供理論和技術支持。

1 材料

1.1 藥材

本研究所用的裸花紫珠藥材采自海南，經(jīng)湖南中醫(yī)藥研究院謝昭明研究員鑒定為馬鞭草科植物裸花紫珠的干燥葉。

1.2 儀器與試藥

儀器：Waters e2695-2998 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；電子天平，萬分之一，AR220（日本島津公司）；電子天平，十萬分之一，CP225D（sartorius 公司）；KQ300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山儀器）；Milli-Q 純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

試劑：乙腈為色譜純；水為Millipore 制備的超純水；其他試劑均為分析純。

對照品：木犀草苷（批號：11720-201408，含量測定用，中國食品藥品檢定研究院）；毛蕊花糖苷（批號：111530-201208，含量測定用，中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取本品粉末（過4 號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

取木犀草苷、毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，分別加70%甲醇制成每1 ml 含木犀草苷20 μg、毛蕊花糖苷40 μg 的溶液，即得。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性

Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典AKZO NOBEL 公司），乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫0～30 min，16%A，30～41 min，16%→80%A，41～51 min，80%A；木犀草苷檢測波長為350 nm，毛蕊花糖苷檢測波長為330 nm；柱溫為35℃；流速：1 ml/min；進樣量：10 μl。毛蕊花糖苷色譜圖見圖1，木犀草苷對照品色譜見圖2，裸花紫珠供試品色譜圖見圖3～4。

2.4 線性關系考察

2.4.1 對照品母液的制備 取木犀草苷對照品、毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，分別加70%甲醇制成每1 ml 含木犀草苷、毛蕊花糖苷1 mg 的溶液，即得。

2.4.2 對照品溶液的制備 分別精密吸取對照品母液5、2、1、0.8、0.6 ml 置于10、10、10、50、50 ml 的容量瓶中，加甲醇至刻度，與母液一起制成系列不同濃度的對照品溶液（0.5、0.25、0.1、0.05、0.008、0.006 mg/ml）。

2.4.3 測定法 按“2.3”項下分別進樣，以峰面積為縱坐標，以對照品溶液濃度為橫坐標進行線性回歸。結果顯示：毛蕊花糖苷、木犀草苷對照品分別在1.852～9.260 μg、2.140～10.700 μg 范圍內(nèi)線性關系良好，毛蕊花糖苷的回歸方程分別為：Y=2721.6X+212.49，r=0.9999；木犀草苷的回歸方程：為Y=1490.6X+294.66，r=0.9998。

2.5 精密度試驗

取毛蕊花糖苷、木犀草苷對照品溶液于同1 d 內(nèi)重復進樣連續(xù)進樣6 次，計算毛蕊花糖苷、木犀草苷峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.14%、0.26%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一裸花紫珠樣品，連續(xù)在分別在0、6、12、18、24 h 進樣測定毛蕊花糖苷、木犀草苷峰面積。毛蕊花糖苷、木犀草苷峰面積RSD 分別為2.00%、0.54%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗

取同一裸花紫珠樣品，按“2.1”項下平行制備6 份，依法測定，計算毛蕊花糖苷、木犀草苷的含量RSD 分別為1.51%、1.58%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的供試品6 份（木犀草苷含量為1.28 mg/g，毛蕊花糖苷含量為43.65 mg/g），分別精密加入一定量的毛蕊花糖苷和木犀草苷對照品，照“2.3”項下制備回收率試驗液，依法測定，計算回收率。見表1。

表1 方法回收率試驗結果（n=6）

2.9 試驗方法及測定指標

將裸花紫珠鮮葉充分混勻，均分為10 份，每份100 g，使用網(wǎng)袋裝好。2 因素3 水平完全隨機區(qū)組試驗，設殺青時間和干燥溫度兩因素，蒸汽殺青時間設0.5、1、1.5 min 3 個水平，干燥溫度分別以60、70、80℃3 個水平進行烘干見表2；另取一份樣品直接以60℃烘干，至葉恒重，將處理好的裸花紫珠葉粉碎，過4 號篩，分別測其毛蕊花糖苷、木犀草苷的含量。重復加工鮮葉樣品2 次，共計20 份樣品，試驗結果取平均值。結果顯示，直接以60℃烘干的樣品木犀草苷含量為1.21 mg/g，毛蕊花糖苷含量為31.59 mg/g，以殺青時間1 min 干燥溫度60℃為最優(yōu)的蒸汽殺青條件。見表3。

表2 優(yōu)選裸花紫珠加工工藝因素-水平

表3 不同加工方式裸花紫珠單體成分含量比較（mg/g）

3 討論

本研究建立了同時測定裸花紫珠葉中一種黃酮類成分和一種苯乙醇苷類成分含量的高效液相色譜法，所建立的方法操作簡便、結果準確且重復性好。毛蕊花糖苷屬于苯乙醇苷類成分，木犀草苷屬于黃酮類成分，這兩個成分在裸花紫珠中含量較高且屬于主要活性成分[19-21]，因此，選擇同時測定這兩個成分可以作為裸花紫珠藥材質(zhì)量控制的有效方法之一。

本研究通過木犀草苷和毛蕊花糖苷的高效液相色譜法含量測定，結果顯示蒸氣殺青處理后以不同溫度干燥對裸花紫珠化學成分保留效果優(yōu)于不殺青直接干燥處理。同時研究了不同殺青時間和不同的干燥溫度對裸花紫珠有效成分的影響，結果顯示以殺青時間1 min干燥溫度60℃為最優(yōu)的蒸汽殺青條件。

裸花紫珠為海南傳統(tǒng)民族藥材，臨床應用已有數(shù)千年的歷史，是我國中醫(yī)藥文化的重要傳承之一[22]，裸花紫珠目前以曬干為主要的加工方式，存在受環(huán)境影響較大，生產(chǎn)效率低，藥材質(zhì)量控制不易等問題。中國中藥生產(chǎn)、加工炮制在長期的生產(chǎn)實踐和經(jīng)驗積累形成了獨具特色、內(nèi)容豐富、較為系統(tǒng)的中藥材初加工方法和技術，現(xiàn)代的科技發(fā)展為中藥傳統(tǒng)生產(chǎn)加工技術和質(zhì)量控制也提供了更詳細的理論基礎和技術設備支持，現(xiàn)代殺青手段也越來越多，如微波殺青、熱風殺青等[23-24]。下一步將結合不同的殺青技術以及不同的殺青設備，研究其對裸花紫珠的有效成分含量變化，為裸花紫珠的炮制加工提供進一步的科學依據(jù)，提高裸花紫珠的生產(chǎn)效率，加速裸花紫珠的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化發(fā)展。