非天然氨基酸及非天然蛋白合成的研究進(jìn)展

劉玉美，毋 彤，陳振婭，霍毅欣

(北京理工大學(xué) 生命學(xué)院 分子醫(yī)學(xué)與生物診療工業(yè)和信息化部重點實驗室，北京 100081)

蛋白質(zhì)是生物體維持結(jié)構(gòu)和功能的重要生物大分子。蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)可讀取64種三聯(lián)體密碼子，編碼20種天然氨基酸(natural amino acids, nAAs)，進(jìn)而合成天然蛋白質(zhì)(圖1)[1-2]。雖然20種天然氨基酸的編碼足以維持生物體的基本生長和代謝水平，但蛋白質(zhì)需要額外的化學(xué)基團(tuán)(如，磷酸基團(tuán)、甲基、羥基和乙?；?來實現(xiàn)更復(fù)雜的生理功能。20種數(shù)量有限、結(jié)構(gòu)保守的氨基酸極大限制了蛋白質(zhì)的種類和功能應(yīng)用，已經(jīng)無法滿足生物科學(xué)、化學(xué)以及醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究需求[3]。

藍(lán)色氨基酸是由6個同義密碼子編碼；橙色氨基酸是由3～4個同義密碼子編碼；黑色氨基酸是由1～2個密碼子編碼；紅色是終止密碼子。蛋白石終止密碼子和琥珀終止密碼子分別被天然編碼為硒代半胱氨酸(SeC)和吡咯賴氨酸(Pyl)

隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)計算和生物正交化學(xué)反應(yīng)的快速發(fā)展，具有新型結(jié)構(gòu)特性或功能的蛋白質(zhì)有望成為現(xiàn)實[4]。作為天然氨基酸的衍生物——非天然氨基酸(unnatural amino acids, unAAs)，它們帶有獨特化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)多樣的側(cè)鏈基團(tuán)，將其整合到天然蛋白質(zhì)中可增強(qiáng)蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，包括生物催化活性[5]、結(jié)構(gòu)和熱學(xué)穩(wěn)定性[6]及底物特異性等[7]，這些特性的改變可應(yīng)用于新型生物高分子材料[8]和新型蛋白藥物[9]等。盡管unAA有著巨大的潛力[10-12]，但其合成仍是一個挑戰(zhàn)。雖然有一系列化學(xué)合成方法用于制備unAAs，但化學(xué)合成的反應(yīng)步驟復(fù)雜繁多、產(chǎn)率低且成本高。相比之下，代謝工程更易實現(xiàn)unAAs的綠色高產(chǎn)?；诖耍疚木C述了非天然氨基酸的生物合成方法，分析了非天然氨基酸生物合成目前存在的難點，提出了可能的解決方案，總結(jié)了非天然氨基酸插入蛋白質(zhì)中的方法，并分析了不同方法的利弊。此外，本文總結(jié)了由非天然氨基酸合成的非天然蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 unAAs的生物合成

unAAs又稱非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(nsAAs)、非典型氨基酸(ncAAs)或非蛋白原氨基酸(npAAs)等，它們廣泛存在于動物、植物和微生物中，是天然氨基酸的前體物、類似物或代謝中間體[13-14]，如L-高絲氨酸是生物合成中必需氨基酸如L-蛋氨酸、L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的前體[15]。瓜氨酸和鳥氨酸是尿素循環(huán)中的兩種中間體，在臨床上常用于修復(fù)肝細(xì)胞的損傷；羥基賴氨酸和羥基脯氨酸是膠原酸水解的副產(chǎn)物，分別來源于前體賴氨酸和脯氨酸，由于其結(jié)構(gòu)特異性，在臨床檢測中作為組織和器官異常的指標(biāo)[16]。目前，unAAs主要依賴于化學(xué)合成，但unAAs的化學(xué)合成步驟復(fù)雜且產(chǎn)物通常是混合L型和D型的外消旋體[13]，這會影響實際應(yīng)用。同時，一些由化學(xué)法合成的分子量大的unAAs，在細(xì)胞攝取時可能會受到天然氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的限制，不易被細(xì)胞吸收利用[17]，這些問題都是化學(xué)合成方法的弊端。

代謝工程已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于unAAs合成，特別是隨著對所涉及酶的遺傳和生化信息的了解，一些關(guān)鍵異源酶可以在具有遺傳優(yōu)勢的微生物宿主中重組、修飾和優(yōu)化，從而使代謝工程建立unAAs生產(chǎn)平臺成為可能。Lin等[18]在色氨酸高產(chǎn)的大腸桿菌底盤宿主中通過對來自黃單胞菌(Xanthomonascampestris)的苯丙氨酸-4-羥化酶(XcP4H)進(jìn)行改造，并構(gòu)建輔因子再生途徑，通過分批補(bǔ)料發(fā)酵，最終使5-羥基色氨酸(5-HTP)產(chǎn)量達(dá)到1.1～1.2 g/L，實現(xiàn)了5-HTP在微生物中高效、快速、低成本生產(chǎn)。Mora-Villalobos等[19-20]借助序列分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和功能差異分析等工具，對來自臺灣的銅綠假單胞菌(Cupriavidustaiwanensis)的芳香族氨基酸羥化酶(CtAAAH)的底物特異性位點進(jìn)行預(yù)測、篩選和點突變設(shè)計，將酶的底物偏好性從苯丙氨酸轉(zhuǎn)移到色氨酸，從而以色氨酸為底物生產(chǎn)5-HTP。同時，Mora-Villalobos等[20]還在含有色氨酸脫羧酶的重組菌株中實現(xiàn)了5-HTP到5-羥色胺(5-HT)的生物轉(zhuǎn)化，獲得了154.3 mg/L 5-HT。除此之外，還可以通過敲除unAA合成的競爭和降解途徑基因、過表達(dá)合成途徑的關(guān)鍵酶基因及增強(qiáng)代謝通量等提高unAA的合成效率和產(chǎn)量，如高絲氨酸(L-Hse)[21-22]、γ-氨基丁酸(GABA)[23-24]及反式-4-羥基脯氨酸(trans-Hyp)[25-26]等的合成。表1總結(jié)了unAA生物合成的宿主、產(chǎn)量改造策略及發(fā)酵方式等。

表1 非天然氨基酸的生物合成

然而，目前只有少數(shù)unAAs的生物合成途徑得到了驗證(圖2)，大多數(shù)unAAs的生物合成途徑仍不明晰。因此，構(gòu)建完整的生物合成途徑仍需進(jìn)一步努力，可以借助先進(jìn)的生物信息工具或生物合成模擬工具來設(shè)計、挖掘自然界中未發(fā)現(xiàn)的合成途徑和人工酶，進(jìn)一步拓展unAAs的生物合成途徑。但有些unAAs的生物合成依賴于昂貴的輔因子[18-20]，這會增加工藝成本，因此需要搭建有效的輔因子再循環(huán)利用途徑。還有一些unAAs可能會抑制底盤宿主的生長，在擴(kuò)大生物合成產(chǎn)量時會有困難，因此需要篩選或工程改造更多對特定unAA具有更強(qiáng)耐受性或易達(dá)到代謝平衡的底盤宿主。

藍(lán)色代表天然氨基酸，橙色代表非天然氨基酸。(1)—鹵化酶；(2)—色氨酸羥基化酶或芳香族氨基酸羥化酶；(3)—色氨酸脫羧酶；(4)—PapA,PapB and PapC；(5)—支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶；(6)—酪氨酸酚裂解酶；(7)—苯丙氨酸氨基變位酶；(8)—ilvCD途徑；(9)—leuABCD途徑；(10)—谷氨酸脫氫酶；(11)—谷氨酸脫羧酶；(12)—鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶；(13)—茶氨酸合成酶；(14)—脯氨酸-4-羥化酶；(15)—天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；(16)—天冬氨酸激酶；(17)—天冬氨酸半醛脫氫酶；(18)—高絲氨酸脫氫酶；(19)—高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶。p-AF—對氨基苯丙氨酸；L-DOPA—多巴(3,4-二羥基苯丙氨酸)；Nva—正纈氨酸；Nle—正亮氨酸；Orn—鳥氨酸；Cit—瓜氨酸；L-Hcy—同型半胱氨酸

2 unAAs插入蛋白方法

2.1 固相肽合成插入法

固相肽合成(SPPS)自首次報道以來[45]，已經(jīng)發(fā)展成為一種強(qiáng)大的肽合成方法。固相肽合成類似于天然合成蛋白質(zhì)的生物學(xué)過程，通過肽鍵將多個氨基酸連接起來生產(chǎn)多肽。在SPPS中，第一個氨基酸的氨基被保護(hù)基團(tuán)保護(hù)后，其C末端通過共價鍵連接到高分子樹脂上，隨后除去保護(hù)基團(tuán)，產(chǎn)生一個自由的氨基，準(zhǔn)備與下一個氨基被保護(hù)且羧基被活化的氨基酸耦合(圖3)，以此延伸肽鏈長度。因此，SPPS的一般原理包括耦合—沖洗—去保護(hù)—沖洗—耦合的重復(fù)循環(huán)。多肽被固定在固相表面上，并且可以在整個過程中被保留，待完全組裝后，用三氟乙酸(TFA)將多肽從樹脂上分離下來，同時可除去保護(hù)基團(tuán)。常用的氨基保護(hù)基團(tuán)是9-芴甲氧羰基(Fmoc)和叔丁氧羰基(tBoc)[46-47]。目前，unAAs通過SPPS化學(xué)合成重組蛋白已有實際應(yīng)用，如催化酶[7]和抗菌肽[46,48]等。

圖3 固相肽合成法

雖然，SPPS可合成細(xì)胞難以表達(dá)的多肽，如由D型氨基酸組成的多肽，并且還可對肽或蛋白質(zhì)進(jìn)行主鏈修飾，尤其適用于摻入對細(xì)胞有毒或翻譯機(jī)制不相容的氨基酸類似物，但是多肽的化學(xué)合成會受到合成長度和速度的限制，當(dāng)合成較大的多肽時，化學(xué)合成過程會變得繁瑣、成本偏高及耦合效率低，合成的多肽有低產(chǎn)量、低純度等缺點[49]。通常SPPS合成不超過50個氨基酸殘基的多肽。

2.2 選擇性壓力插入法

選擇性壓力插入法(SPI)依賴于一種或多種特定nAAs的營養(yǎng)缺陷型宿主，并利用天然氨基酸的內(nèi)源氨酰tRNA合成酶(endogenous aaRS)的錯氨?；?，為內(nèi)源tRNA(endogenous tRNA)提供與缺陷氨基酸結(jié)構(gòu)和電荷特性相似的unAAs[49-51](圖4)。營養(yǎng)缺陷型菌株首先在含有特定量的nAAs培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)相應(yīng)的nAAs耗盡后，細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)生長狀態(tài)并開始表達(dá)重組蛋白時，開始補(bǔ)加外源nAAs類似物，同時通過誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控靶蛋白基因的表達(dá)，使得蛋白質(zhì)翻譯依賴于培養(yǎng)基中unAAs的可用性[52]。迄今為止，已有約50種unAAs(大多是蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸和賴氨酸的類似物)使用該方法整合到蛋白質(zhì)中[2]。當(dāng)天然翻譯機(jī)制不支持與unAAs結(jié)合時，可以過表達(dá)特定內(nèi)源aaRS[53]或定向進(jìn)化改造內(nèi)源aaRS的氨基酸結(jié)合口袋[54]，提高aaRS對unAAs的親和力。

NNN表示天然密碼子

SPI能夠在整個蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)摻入多個位點的unAAs，這種多重取代可能會導(dǎo)致unAAs的累積或協(xié)同效應(yīng)，因此對某些蛋白質(zhì)性能的改變要比單一取代的效果更明顯。但是該方法的特點是一把“雙刃劍”，一方面，它有利于得到全新高度改性的蛋白，另一方面它無法保證單個位點特異性摻入，這對精細(xì)改造蛋白位點的研究并不友好。同時，若在特定營養(yǎng)缺陷型菌株表達(dá)大量非天然蛋白，則需要供應(yīng)大量成本昂貴的unAAs，因此無法實現(xiàn)該方法的工業(yè)化應(yīng)用。

2.3 遺傳密碼擴(kuò)展方法

遺傳密碼擴(kuò)展(GCE)方法，又稱遺傳密碼工程[55]。類似于天然翻譯過程，該策略將unAAs整合到蛋白質(zhì)中需要高效和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆g機(jī)制，每個氨基酸都有對應(yīng)的“密碼子”。該方法是通過正交翻譯系統(tǒng)(OTS)實現(xiàn)的，其關(guān)鍵成分包含具有嚴(yán)格正交性的外源tRNA(exogenous tRNA)和外源aaRS(exogenous aaRS)(圖5)，氨?；膖RNA攜帶著unAAs與重新分配的密碼子互補(bǔ)配對，從而將unAAs傳遞到延長的肽鏈中。該正交系統(tǒng)不能與內(nèi)源性翻譯系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng)，否則就會失去正交性，導(dǎo)致翻譯系統(tǒng)紊亂(圖5灰色虛線)。為了防止這些錯誤交叉反應(yīng)的發(fā)生，每個正交翻譯系統(tǒng)都要經(jīng)過幾輪正篩和反篩過程。表2匯總了常用正交對的來源及應(yīng)用。

黑色實線代表嚴(yán)格正交，灰色虛線代表非嚴(yán)格正交

表2 正交對在遺傳密碼擴(kuò)展中的應(yīng)用

2.3.1 基于終止密碼子抑制的遺傳密碼擴(kuò)展

終止密碼子抑制(SCS)是利用抑制型tRNA識別終止密碼子，從而翻譯為unAAs的過程(圖6)。在天然翻譯體系中，有3種終止密碼子，分別是琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子(UAA)和蛋白石密碼子(UGA)，它們通常不編碼任何氨基酸，而是與釋放因子(RF)識別，終止翻譯過程。20世紀(jì)80年代末，Schultz團(tuán)隊的Noren等[55]在大腸桿菌宿主的體外試驗中發(fā)現(xiàn)，unAA可以插入終止密碼子UAG替換的有義密碼子位置。這就利用了3種終止密碼子的簡并性。在原核生物中，終止翻譯過程需要兩種釋放因子RF1和RF2，對應(yīng)的終止密碼子具有交叉識別性，即RF1可以識別UAA和UAG，RF2可以識別UAA和UGA，因此遺傳密碼子中至少存在1個“冗余”密碼子，可以擴(kuò)展為“有義密碼子”，進(jìn)而翻譯unAAs。

XYZ表示重分配密碼子

由于釋放因子和抑制型tRNA都可以識別終止密碼子，而釋放因子的競爭識別會導(dǎo)致翻譯過早終止，從而產(chǎn)生截短的蛋白，使得unAA的插入效率降低且蛋白產(chǎn)量和純度降低。2013年，Lajoie等[87]利用多重可自動化基因組工程(MAGE)和共軛組裝基因組工程(CAGE)將大腸桿菌基因組上所有321個UAG密碼子全部替換為同義的UAA密碼子，同時在不影響菌株生長的情況下刪除了編碼釋放因子RF1的基因prfA，構(gòu)建了一個基因組重新編碼的大腸桿菌生物體(GRO)——E.coliC321.ΔA，從而完全消除UAG密碼子被RF1識別而終止蛋白合成的功能。結(jié)果證明，與野生型菌株相比，基因重新編碼的菌株顯示出更高的unAA摻入效率[88-90]。到目前為止，基因組重編碼的生物體只有以大腸桿菌為底盤宿主的改造例子，因此需要開發(fā)新的適用于基因組改造的底盤宿主，從而擴(kuò)大unAA摻入蛋白，基于這一原理優(yōu)化底盤宿主的可應(yīng)用范圍，如谷氨酸棒狀桿菌、枯草芽孢桿菌等。

2.3.2 基于有義密碼子再分配的遺傳密碼擴(kuò)展

20種天然氨基酸中的18個氨基酸都由不少于1個的密碼子編碼，如絲氨酸、亮氨酸和精氨酸最多由6個同義密碼子編碼，蛋氨酸和色氨酸最少由1個密碼子編碼(圖1)。有義密碼子再分配是利用密碼子的簡并性，在全基因組范圍內(nèi)用同義密碼子替換為同一個密碼子，減少編碼天然氨基酸的同義密碼子數(shù)量，就可以產(chǎn)生可再編碼的密碼子，重新分配被“釋放”的密碼子以指導(dǎo)細(xì)胞將unAA納入氨基酸鏈中。這種將有義密碼子重新分配其他nAA或unAA的方法又稱為有義密碼子壓縮[91](圖5)。Mukai等[92]利用大腸桿菌內(nèi)精氨酸的稀有密碼子AGG實現(xiàn)了體內(nèi)精氨酸到高精氨酸的重新分配。Fredens等[93]使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了一株名為Syn61的大腸桿菌菌株，該菌株具有61個密碼子，包括59個密碼子編碼20種天然氨基酸和2個密碼子終止翻譯。Robertson等[94]將絲氨酸密碼子UCG、UCA和終止密碼子UAG分別替換為它們的同義密碼子AGC、AGU和UAA，并刪除對應(yīng)的tRNA和編碼RF1的prfA基因，從而使UCG、UCA和UAG這3個密碼子可重新編碼，并成功在該菌株中將3種unAAs同時整合到單個蛋白質(zhì)中。然而，在基因組水平上重新分配有義密碼子仍然是一個重大技術(shù)挑戰(zhàn)，從基因組上完全“消除”數(shù)量眾多的密碼子并不容易，并且同義密碼子的選擇會影響基因表達(dá)和細(xì)胞適應(yīng)度[95]、翻譯速度[96-97]等。更重要的是，并非所有的同義密碼子都能壓縮。

2.3.3 基于新密碼子庫的遺傳密碼擴(kuò)展

除了將有義密碼子擴(kuò)展為unAAs的密碼子外，四聯(lián)體密碼子也可以編碼氨基酸，以響應(yīng)反密碼子環(huán)中有額外核苷酸的tRNA突變體(有8個核苷酸，而非7個核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)反密碼子環(huán))，這樣就可以將44=256個四聯(lián)體密碼子分配給unAAs，四聯(lián)體密碼子的使用更加靈活，可以不通過大規(guī)模改造基因組就實現(xiàn)unAAs的插入[61,98-100]。雖然四聯(lián)體密碼子翻譯過程是自然發(fā)生的，但天然核糖體解碼四聯(lián)體密碼子的效率很低，甚至?xí)?dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤合成，產(chǎn)生毒性。因此Neumann等[101]開發(fā)了新的正交核糖體，使其更有效地解碼四聯(lián)體密碼子。

非天然堿基對(UBP)的出現(xiàn)也擴(kuò)充了密碼子庫。2014年，Malyshev等[69]首次報道人工合成的堿基對X-Y(X表示NaM，Y表示d5SICS)后，又將dNam-d5SICS堿基對改造為dNam-dTPT3堿基對，并將綠色熒光蛋白非關(guān)鍵區(qū)域上的酪氨酸密碼子TAC替換為AXC，構(gòu)建了含有反密碼子GYT的MmtRNAPyl(GYT)/MmtRNAPyl(GYT)正交系統(tǒng)，成功將N6-[(2-propynyloxy)carbonyl]-L-lysine(PrK)摻入靶蛋白中[70]。

3 非天然蛋白質(zhì)的應(yīng)用

3.1 非天然蛋白質(zhì)探針

蛋白質(zhì)組學(xué)一直面臨著一個挑戰(zhàn)，即分析細(xì)胞中任何給定的蛋白質(zhì)與其他分子之間的相互作用。目前的方法都依賴于蛋白質(zhì)的親和純化，但從細(xì)胞中分離純化出完整的蛋白質(zhì)及其復(fù)合物又是一大難點。即使一些蛋白可以在細(xì)胞裂解或親和純化過程中被解離出來，但其蛋白質(zhì)的相互作用圖像仍可能是不完整的，所以位點特異性的蛋白質(zhì)光交聯(lián)探針已經(jīng)成為研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵工具[76,102-104]。Chin等[105]利用進(jìn)化的MjTyrRS/MjtRNA這一正交對響應(yīng)琥珀密碼子TAG，將光交聯(lián)氨基酸對苯甲?；?L-苯丙氨酸(pBpa)插入蛋白中；在350～365 nm的紫外光激發(fā)下，pBpa的二苯甲酮基團(tuán)會與附近的C—H鍵發(fā)生交聯(lián)，這樣就可以得到該氨基酸附近相互作用的伴侶蛋白信息。

另一類非天然蛋白質(zhì)探針是在蛋白質(zhì)中引入具有熒光特性的unAAs，這類熒光探針已經(jīng)成為探究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化、定位和分子相互作用的強(qiáng)有力工具。Curnew等[106]利用特定的正交系統(tǒng)將熒光性unAA——Anap摻入丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白中，實現(xiàn)蛋白可視化，這種熒光性unAA標(biāo)記病毒蛋白的方法可消除蛋白質(zhì)可視化對抗體或標(biāo)簽的需求。還有一些熒光性unAAs的摻入可作為蛋白質(zhì)動力學(xué)探針，如吖啶酮-2-基丙氨酸(Acd)和氨基吖啶丙氨酸(Aad)[107-108]等。

3.2 非天然蛋白質(zhì)藥物

現(xiàn)代藥物的開發(fā)主要是從化合物庫中進(jìn)行篩選，缺乏對蛋白質(zhì)藥物的精準(zhǔn)設(shè)計和改造，并且一些蛋白質(zhì)藥物難以化學(xué)合成。因此，基于非天然蛋白質(zhì)藥物的研究已經(jīng)成為新興的熱點，unAAs特殊的化學(xué)功能基團(tuán)極大地拓展了蛋白質(zhì)藥物的設(shè)計空間，為生物醫(yī)藥領(lǐng)域帶來了新的機(jī)遇[109-111]。Wang團(tuán)隊的Li等[112]利用一種臨近反應(yīng)療法(PERx)來開發(fā)共價蛋白藥物，通過GCE方法將具有活性的unAA——氟硫酸鹽-L-酪氨酸(FSY)引入人程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(PD-1)中，在免疫人源化小鼠中，共價的PD-1(FSY)表現(xiàn)出比非共價的野生型PD-1更強(qiáng)的抗腫瘤作用，有更好的治療效果。此外，抗體偶聯(lián)藥物(ADC)已經(jīng)成為治療腫瘤的有效策略，目前已有超過40種抗體偶聯(lián)藥物處于臨床開發(fā)階段[113]。遺傳編碼的unAAs為位點特異性偶聯(lián)開辟了新途徑，也使抗體偶聯(lián)藥物具有良好的藥代動力學(xué)、效價和抗原結(jié)合特性，解決了常規(guī)依賴于半胱氨酸殘基修飾所帶來的位置局限性問題[114]，已被廣泛應(yīng)用[109,113,115]。

3.3 非天然蛋白質(zhì)材料

非天然蛋白在高分子材料領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景。海洋貽貝富含3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)的貽貝黏附蛋白，可以在惡劣條件下表現(xiàn)出強(qiáng)大的水下黏附能力。貽貝黏附蛋白是天然的抗水生物黏合劑，在生物醫(yī)療和工業(yè)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用引起了極大關(guān)注[116-118]，但因為其黏附特性依賴于氨基酸的翻譯后羥基化，而這種羥基化修飾只能在真核細(xì)胞中完成，所以其重組生產(chǎn)仍是一個重大的生物技術(shù)挑戰(zhàn)。Hauf等[119]使用GCE新策略，通過工程高效的aaRS/tRNA正交系統(tǒng)增強(qiáng)光籠型非天然氨基酸鄰硝基芐基多巴(ONB-DOPA)的摻入，就可以在體內(nèi)實現(xiàn)貽貝黏附蛋白的生產(chǎn)。這種策略提供了一種無需翻譯后修飾就能生產(chǎn)生物黏合劑的直接方法，使它們的生產(chǎn)更具成本效益和時間效益。

4 結(jié)論與展望

目前已知的代謝途徑僅涵蓋數(shù)量有限的unAAs，并且一些已知途徑缺乏關(guān)鍵酶信息，因此需要進(jìn)一步研究來挖掘和闡明一些典型unAAs的代謝途徑和關(guān)鍵酶。隨著合成生物學(xué)技術(shù)和平臺技術(shù)的快速發(fā)展，預(yù)計可以構(gòu)建更多unAAs生物合成途徑。假如unAAs的生成是“基石”，那么實現(xiàn)靶蛋白的unAAs插入則是“點石成金”，尤其是遺傳密碼擴(kuò)展的多種策略，完全打破了遺傳密碼的“冰凍”理論，顯示了標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼的可塑性和可進(jìn)化性，為設(shè)計更高級的生命形式開辟了一條道路。但是該策略涉及的正交翻譯系統(tǒng)的數(shù)量和改造有限，因此需要工程改造或技術(shù)手段激發(fā)其他新的正交翻譯系統(tǒng)的出現(xiàn)。

非天然蛋白的應(yīng)用則更進(jìn)一步體現(xiàn)了前兩者的意義，并且其應(yīng)用領(lǐng)域的廣泛性超出了預(yù)期。已有完全自主型宿主系統(tǒng)，即該宿主可同時實現(xiàn)unAAs生物合成和unAAs特異性位點插入蛋白中，從而改變蛋白功能的一體化過程。這實現(xiàn)了代謝工程和遺傳密碼工程的結(jié)合，將會促進(jìn)新方法及新擴(kuò)展技術(shù)的開發(fā)，如升級的計算機(jī)輔助蛋白/酶分子預(yù)測以及生物合成途徑模擬工具等，最大限度去開發(fā)unAAs的生物合成途徑及其提高插入蛋白改造的潛力和效率，以實現(xiàn)更多自主型細(xì)胞的出現(xiàn)和應(yīng)用，使其能夠更好地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及工業(yè)生產(chǎn)研究。