PET塑料廢棄物及微塑料生物降解與轉(zhuǎn)化的研究現(xiàn)狀與展望

劉欣悅，崔穎璐

(1.中國科學院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室 生理與代謝工程重點實驗室，北京 100101；2.中國科學技術(shù)大學 生命科學學院，安徽 合肥 230026)

自20世紀50年代以來，塑料以其無限的創(chuàng)新潛力塑造了世界，為人類快速變化的需求提供可持續(xù)解決方案，已成為現(xiàn)代社會中不可或缺的一部分[1]。2019年，全球塑料產(chǎn)量達到了3.68億t[1]，預計到2040年，行業(yè)規(guī)模將進一步增大，達到每年8億t[2]，其中，大約有40%的塑料包裝垃圾會被填埋，而32%的塑料將會從收集系統(tǒng)中逃脫[3]。據(jù)統(tǒng)計，每年至少有800萬t塑料進入海洋[3]，這些難以自然降解的塑料在環(huán)境中可存在數(shù)十年甚至上百年，對生態(tài)環(huán)境造成長期、深層次的危害[4]。更令人擔憂的是，這些暴露的塑料制品在物理作用、光降解等過程影響下，可形成粒徑小、比表面積大、疏水性強的微塑料(microplastics)。目前在全球海洋塑料垃圾中，大約有92.4%是微塑料[5]，即粒徑小于5 mm的塑料顆粒[6]。一些研究指出，微塑料的吸附能力很強，可以作為重金屬和其他有毒化學物質(zhì)在不同自然生態(tài)系統(tǒng)中運輸?shù)妮d體[7-9]。隨著2019年以來新冠肺炎的暴發(fā)和流行，個人防護裝備的使用導致了大量塑料垃圾的產(chǎn)生。據(jù)統(tǒng)計，疫情可能導致全球每月使用1 290億個口罩和650億只手套[10],一旦處置不當，將會加劇微塑料處理難度。

1 聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)概述

PET是應(yīng)用最廣泛的聚酯塑料之一，年生產(chǎn)量超過3 000萬t[11]。具有優(yōu)異物理性能的PET被大量用于生產(chǎn)一次性包裝產(chǎn)品，而這些材料在消費后即成為塑料垃圾，給全球生態(tài)系統(tǒng)帶來了嚴重負擔[12]。目前，發(fā)展中國家采用的PET處理方法主要是填埋和焚燒。由于空間稀缺和成本增加，填埋處理法不能長期進行，而焚燒處理會排放含有各種毒物和飛灰的有毒煙霧，需要進一步的處理[13]。相比之下，使用更少的能源和資源并能降低碳排放的回收方法被認為是管理PET廢物的最佳方式之一[14]，主要有物理法和化學法。物理法可將回收的PET塑料經(jīng)分類、研磨、加熱等工藝再次制造成粒，但是這種向下循環(huán)的方法，大約6次循環(huán)之后，就不能再次回收[15]。此外，由于污染物的存在以及光氧化等作用可能會極大地改變PET性能，所以形成的產(chǎn)品質(zhì)量往往較差，對物理回收的可行性有著極大阻礙[16-17]。另一種則是化學法，通過糖解、醇解、水解和氨解等方法將PET廢料進行化學解聚，從而能夠回收可用于再合成的單體或反應(yīng)中間體，但其建立在高溫或使用極端化學試劑的基礎(chǔ)上，成本昂貴、容易產(chǎn)生二次污染[18]。因此，尋求新型的環(huán)境友好的PET回收方法已成為環(huán)境治理的迫切客觀需求，而利用生物法(如酶或微生物降解)將PET降解成對苯二甲酸單羥乙酯(MHET)、對苯二甲酸雙羥乙酯(BHET)、乙二醇(EG)和對苯二甲酸(TPA)等組分，然后回收再利用是最理想的方法，也是近年來的研究重點。該方法不僅避免了對環(huán)境的二次污染，還能大幅降低處理成本，為綠色環(huán)保地解決PET廢棄污染提供新契機[19-20]。

目前已篩選到多種能降解PET的細菌、真菌及微生物菌群，并從中挖掘出數(shù)十種PET降解酶[21-22]，它們對于難以收集的微塑料或可回收的PET廢棄物的降解都起著重要的作用。同時，研究人員長期致力于對不同PET降解酶進行改造，以滿足不同目的的應(yīng)用需求。

2 PET降解酶的發(fā)展與現(xiàn)狀

2.1 可回收PET塑料的生物降解及循環(huán)再利用

由PET制成的飲料瓶等回收率非常高[23]，對于這些易于收集的PET廢物，通過生物降解對其進行異位處理有著廣闊的應(yīng)用前景。因為PET在水溶液中的玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg)為65 ℃左右，在該溫度下，PET塑料的非晶態(tài)部分具有更高的柔性，從而更易被酶接觸并發(fā)生解聚。直接利用嗜熱性PET降解酶在高溫(60～70 ℃)條件下對PET進行解聚成為近年來研究的熱點，例如LCC、TfCut2、Cut190和HiC等在70 ℃下對PET均有著較高的降解活性。Then等[24]通過引入鹽橋或二硫橋代替TfCut2酶中的Ca2+結(jié)合位點來提高酶的熱穩(wěn)定性，使TfCut2突變體能夠在70 ℃反應(yīng)48 h，使PET薄膜損失了25.0%±0.8%。Kawabata等[25]通過半理性設(shè)計發(fā)現(xiàn)，相較于增加疏水性(Q138L)或環(huán)境負電荷(Q138D)，增加底物結(jié)合空間(Q138A)更能提高Cut190酶降解性能。之后該研究小組又在其第2位Ca2+結(jié)合位點引入二硫鍵，最后所獲熔融溫度(Tm)值升高的突變體在70 ℃下使PET薄膜降解達到30%以上[26]。由于PET降解產(chǎn)生的中間產(chǎn)物雙-對苯二甲酸羥乙酯(BHET)和對苯一甲酸乙二醇酯(MHET)是PET降解酶的競爭性抑制劑，會限制PET進一步降解[27]。Wei等[28]對TfCut2參與底物結(jié)合的氨基酸進行突變，得到的G62A突變體對MHET的結(jié)合力減少了5.5倍，從而使酶能在50 h內(nèi)降解超過42%的PET薄膜，與野生型相比增加了2.7倍。

由于可以集中回收并處理，生物降解后的單體對苯二甲酸(TPA)可被重新利用進行PET合成，實現(xiàn)PET閉合循環(huán)再利用。Tournier等[29]使用LCC突變體(ICCG)在10 h內(nèi)實現(xiàn)了至少90% PET廢棄物的解聚，并獲得了高水平的TPA生產(chǎn)率。隨后，該研究小組通過工業(yè)方法獲得了純度99.8%以上的TPA單體，并通過反應(yīng)重新合成“初生型”PET。由此PET生產(chǎn)的吹制新瓶子，表現(xiàn)出比商用PET瓶子更好的亮度和相似的力學特性，從而創(chuàng)造了一個閉環(huán)回收過程。包括LCC突變體在內(nèi)，至少有4種候選的PET水解酶在PET的生物回收中有可行的應(yīng)用[30-31]，表1展示了可用于PET回收的嗜熱性角質(zhì)酶類型和降解能力。

表1 可用于PET回收的嗜熱性角質(zhì)酶類型和降解能力

然而，想要通過降解酶實現(xiàn)PET回收的共同目標，還需要對降解酶和降解工藝進行進一步優(yōu)化。例如，酶基因和表達宿主的工程優(yōu)化，酶作為全細胞催化劑的微生物底盤的選擇[32]以及PET機械預處理、反應(yīng)條件改善[33-34]等。除了大腸桿菌外，這些PET降解酶已經(jīng)在Bacillusmegaterium[35]、Streptomycesrimosus[36]、B.subtilis[37-38]、Pichiapastoris[39-40]和Clostridiumthermocellum[41]等宿主中進行過表達。Shirke等[39]在Pichiapastoris中表達了LCC，并將天然LCC的3個N-糖基化位點糖基化，得到熱穩(wěn)定性提高的糖基化LCC。Wei等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在Bacillussubtilis中表達的TfCut2比在大腸桿菌中表達具有更高的熱穩(wěn)定性和活性。

綜上所述，能夠在PET的玻璃轉(zhuǎn)化溫度下進行反應(yīng)的嗜熱性角質(zhì)酶在PET廢物的生物回收方面發(fā)揮著重要作用，其中LCC突變體最接近實際應(yīng)用。目前，通過酶法對PET進行生物回收在經(jīng)濟上的可行性很大程度上取決于回收成本、系統(tǒng)性解聚工藝以及石油的價格。油價越低，基于石化產(chǎn)品的塑料材料相對于再生塑料在價格上就更有競爭力，反之，則PET生物回收的可行性越高。

2.2 不可回收PET塑料的生物降解

2016年，日本學者Yoshida等[43]分離出一種以PET為主要能源和碳源的細菌Ideonellasakaiensis201-F6，并從中獲得了對PET有降解活性的水解酶PETase和MHETase(圖1)。值得注意的是，這種新型PET水解酶與放線菌角質(zhì)酶有45%～53%的氨基酸序列同源性[44]，但能夠在30 ℃下作用6周后使1.9%結(jié)晶度的PET膜完全降解，是其他PET水解酶降解效率的120倍，極大拓寬了微塑料原位生物降解的潛力。但野生型PETase的穩(wěn)定性較低，距離這一目標的實現(xiàn)還有很大距離，為此，對于PETase同源酶的挖掘以及改造等研究都是十分必要的。

圖1 PET水解及PETase和MHETase在水解過程中的作用[43]

Almeida等[45]通過生物信息學方法從Streptomycessp.SM14中鑒定出一種具有聚酯降解活性的類似PETase的酶SM14est，該酶氨基酸序列與PETase具有41%的同源性，但其對PET的降解能力還有待研究。Bollinger等[46]則篩選了一種能夠以PET為底物的酶(PE-H)，該酶來自海洋細菌Pseudomonasaestusnigri，在30 ℃下反應(yīng)48 h后，能水解PET產(chǎn)生(4.2±1.6)mg/L MHET。近期，Sagong等[47]從Rhizobactergummiphilus中分離出一種與PETase同源性為72%的酶(RgPETase)，RgPETase具有PETase的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征，在常溫下對微晶PET表現(xiàn)出與PETase相似的PET水解活性，但其對低結(jié)晶度的PET降解活性要低于PETase。

目前已有多個團隊先后報道了PETase的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，相較于對PETase同源的中溫PET降解酶的挖掘，對PETase進行功能改造取得了更多的進展[34]。PETase具有典型的α/β水解酶折疊方式，但它還具有許多獨有的特征，使其適合于在中溫條件下對PET進行降解。PETase在活性位點附近具有一個特殊的二硫鍵DS1[48](圖2(a))，連接PETase特有的一段loop區(qū)。Fecker等[49]通過分子動力學模擬證明，DS1的斷裂將會損害催化三聯(lián)體的完整性，DS1缺失的突變體喪失了PET降解活性。與其他降解酶相比，PETase的β8-α6環(huán)中有3個額外的殘基(Asn244、Ser245和Asn246)(圖2(b))，能夠延伸底物結(jié)合口袋的裂隙來提供足夠大的空間容納PET。同時PETase口袋附近的絲氨酸殘基的位阻較小，所產(chǎn)生的較寬的口袋能有利于PET大分子進入催化中心，而傳統(tǒng)角質(zhì)酶相應(yīng)位置則是具有更大空間位阻的Phe殘基[50](圖2(c))。但Austin等[51]根據(jù)同源角質(zhì)酶的保守位點，構(gòu)建出具有縮小活性位點結(jié)合口袋的突變體S238F/W159H，該突變體在降低PET結(jié)晶度和產(chǎn)物釋放方面都優(yōu)于野生型。Ma等[52]將底物結(jié)合口袋周圍的關(guān)鍵殘基進行突變，用無細胞表達系統(tǒng)篩選得到的I179F突變體的酶活性比野生型提高了2.5倍，對PET薄膜的降解速率能達到22.5 mg/(μmol·L·d)。除此之外，在PETase的結(jié)構(gòu)中觀察到了W185的擺動現(xiàn)象，這也使得底物結(jié)合區(qū)域變得開闊，從而可以容納更大的PET分子[48](圖2(d))。Chen等[53]將其他角質(zhì)酶中保守的His/Phe殘基突變?yōu)镻ETase中W185下方側(cè)鏈基團較小的小二元體Ser/Ile，獲得了降解活性提高的突變體。

(a)紅圈內(nèi)為PETase特有二硫鍵DS1。(b)PETase獨有的NSN-loop(深紅色部位)在表面形成底物結(jié)合溝槽，而在TfCut2上該溝槽被阻斷。(c)PETase和TfCut2保守的催化三聯(lián)體與不保守的Trp/Ser和His/Phe殘基。(d)PETase的W185所在loop具有更大柔性圖中的蛋白顏色用于區(qū)分溫度因子(B-factor)：藍色表示溫度因子較低，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定；綠色表示溫度因子較高，結(jié)構(gòu)柔性較大。

這些單/雙位點突變的研究雖然有了一定成果，但通過改造對PET 降解能力的提升還有著廣闊的發(fā)展空間。近期，筆者課題組設(shè)計了一種新的計算策略——蛋白質(zhì)工程的貪婪累積策略(GRAPE)[54](圖3)，基于計算機蛋白質(zhì)設(shè)計對PETase進行了穩(wěn)定性改造，獲得了魯棒性顯著增強的重設(shè)計酶。這項策略融合了多項單點預測算法進行優(yōu)勢互補，再對實驗驗證的有益突變體進行聚類分析，并結(jié)合貪婪算法進行迭代疊加，可大幅規(guī)避不同突變位點間的負協(xié)同效應(yīng)，從而在較短時間內(nèi)最大限度地探索出疊加路徑。具體過程：首先，采用融合策略，綜合使用4種不同的單點預測算法輔以結(jié)構(gòu)缺陷分析，預測了85個潛在有益突變。隨后，對預測突變進行了實驗檢驗，獲得了21個有益單點突變(ΔTm≥ 1.5 ℃)。通過K-means聚類算法，再將21個有益單點突變分為3個Cluster，并依據(jù)貪婪算法對每個Cluster進行迭代疊加，經(jīng)過10輪迭代疊加，成功獲得熔融溫度提高31 ℃的IsPETase突變體(S214H-I168R-W159H-S188Q-R280A-A180I-G165A-Q119Y-L117F-T140D，命名為DuraPETase)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：DuraPETase在 60 ℃高溫下耐受3 d后仍保留活性；而野生型PETase在37 ℃下僅經(jīng)過12 h便完全失去PET降解活性。在37 ℃下，DuraPETase對30%結(jié)晶度PET薄膜的降解效率相較于野生型提升了300倍。通過掃描電鏡可觀察到，經(jīng)DuraPETase處理后的PET薄膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的腐蝕變化。隨后，對DuraPETase蛋白晶體結(jié)構(gòu)進行解析，驗證突變體活性位點區(qū)域氨基酸之間協(xié)同相互作用，探究了DuraPETase性能改善的分子機制，實現(xiàn)了2 g/L微塑料在溫和條件下的完全降解。這項工作為計算機輔助蛋白質(zhì)改造提供了新思路的同時，也為微塑料的原位處理的進一步發(fā)展提供了有力支持。

除了對PETase全局骨架進行改造之外，還可通過對PETase進行表面修飾來提高其降解活性。Chen等[55]將4種單體修飾到PETase上，獲得了具有更優(yōu)的酶活性、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的蛋白，其中，TBMA-PETase和DMAEMA-PETase對PET膜的生物降解效率分別是PETase的4.7和3.3倍。此外，該研究團隊還嘗試將由谷氨酸(E)和賴氨酸(K)殘基組成的兩性離子多肽融合到PETase的C末端，結(jié)果發(fā)現(xiàn)增加融合肽的長度可以提高催化性能，PETase-EK30降解高結(jié)晶度PET薄膜的產(chǎn)物釋放量是野生型的11倍以上[56]。通過將PETase轉(zhuǎn)入工程菌進行全細胞催化，再將降解單體轉(zhuǎn)化為高價值產(chǎn)品，是實現(xiàn)PET塑料循環(huán)經(jīng)濟的有效途徑。近期，Liu等[57]建立了一個用于耦合PET降解和聚羥基丁酸(PHB)生產(chǎn)的共培養(yǎng)系統(tǒng)，將表達PETase的YarrowialipolyticaPo1f和TPA降解菌株P(guān)seudomonasstutzeriTPA3一同培養(yǎng)生成PHB。該研究為PET的生物降解和升級利用提供了一種完整的生物處理策略。

MHETase也是從Ideonellasakaiensis201-F6分離出的一種的α/β水解酶，該酶負責PET降解的最后一步，將PETase中間產(chǎn)物MHET降解為TPA和EG[43]。目前，已解析出MHETase的晶體結(jié)構(gòu)[58-60]，該酶的總體結(jié)構(gòu)類似于阿魏酸酯酶，具有典型的催化三聯(lián)體和氧陰離子孔，存在的MHETase-Lid結(jié)構(gòu)域賦予其高度的底物特異性。Sagong等[59]研究發(fā)現(xiàn)，胞外產(chǎn)生的MHETase可以作為exo-PETase來水解合成的PET五聚體；經(jīng)改造的突變體MHETaseR411K/S416A/F424I表現(xiàn)出更高的BHET水解活性，從而提高了對PET薄膜的降解效率。Knott等[60]則研究了PETase和MHETase在無定形PET上的高度協(xié)同關(guān)系，并構(gòu)建出二者的嵌合蛋白用于實現(xiàn)PET的完全降解。這說明人工設(shè)計的雙酶體系用于PET廢物的解聚是一個有前途且富有成效的領(lǐng)域，值得繼續(xù)研究。目前，在嗜熱性角質(zhì)酶方面，該體系的研究已取得了一定成果，例如，Barth等[61]建立的固定化雙酶體系(TfCa-TfCut2和TfCa-LCC)能夠在60 ℃下高效降解PET薄膜，固定化TfCa可以持續(xù)水解抑制性MHET，使得雙酶協(xié)同作用的酶解產(chǎn)物總量分別增加91%和104%。Carniel 等[62]通過組合Candidaantarctica的脂肪酶CalB與HiC，可消除PET解聚產(chǎn)物MHET的積累，最終對PET 的降解效率較單酶催化系統(tǒng)提高了7.7倍。

綜上，雖然PETase對PET有著高度的底物特異性，對酶分子的改造也取得了一定的進展(表2)。如果想真正實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，還需要進一步對PETase的同源酶進行挖掘或者提高它的酶性能。

表2 PETase的同源酶及改造變體

3 展望

建立“塑料垃圾—解聚單體—高值化產(chǎn)品”的生物循環(huán)經(jīng)濟途徑，不僅能推動相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，還能遏制原油的無節(jié)制消費和溫室氣體排放，減少塑料污染。為實現(xiàn)“降塑再造”這一目標，近年來國內(nèi)外研究人員開展了各種廢塑料降解微生物資源篩選和關(guān)鍵酶元件的挖掘改造工作，在PET 酶法解聚與催化機制方面取得了重要突破。然而，塑料解聚的酶元庫仍存在催化效率低、穩(wěn)定性差、表達量低等問題，這限制了塑料解聚酶的規(guī)?；a(chǎn)與應(yīng)用。利用計算重設(shè)計、定向改造等蛋白質(zhì)工程技術(shù)，有望提高塑料解聚酶的活性、穩(wěn)定性和特異性，為塑料污染的生物處理提供資源儲備。雖然目前僅依靠生物技術(shù)手段還無法有效處理已存在的數(shù)十億t的塑料垃圾，但隨著國家政策的推進和個人生活方式的改變，塑料的回收將更加有效率，這為PET的生物降解與循環(huán)利用提供更好的機遇。