PHA生物制造及加工過程進(jìn)展

劉凱旋,沈宏偉，謝鑫穎，楊 昊，呂金艷，葉健文

(1.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東荷風(fēng)生物技術(shù)有限公司，廣東 湛江 524300；3.珠海麥得發(fā)生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519031)

聚羥基脂肪酸酯(PHA)是由微生物合成的具有良好生物相容性和生物可降解性的高分子聚酯材料。當(dāng)前隨著限塑令升級(jí)、碳中和及碳達(dá)峰目標(biāo)的提出，特別是在民眾對(duì)生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識(shí)增強(qiáng)的大背景下，以基因工程改造的微生物為細(xì)胞工廠合成PHA的工業(yè)生物技術(shù)已獲得越來越多的產(chǎn)業(yè)驗(yàn)證及市場(chǎng)關(guān)注。得益于合成生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，研究者構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠,優(yōu)化底盤菌株的工作效率，PHA的高效合成得以實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，針對(duì)PHA下游提純瓶頸問題進(jìn)行工藝及生產(chǎn)菌株優(yōu)化,也將有利于生物制造成本的進(jìn)一步降低。

其中，傳統(tǒng)工業(yè)生物技術(shù)(CIB)與下一代工業(yè)生物技術(shù)(NGIB)分別以不同生長(zhǎng)特性的微生物為底盤，構(gòu)建不同PHA的合成途徑，并利用基因工程手段對(duì)PHA產(chǎn)量、產(chǎn)率及底物轉(zhuǎn)化率的優(yōu)化展開了系列深入的研究。其中，由清華大學(xué)陳國(guó)強(qiáng)教授提出的NGIB以其開放無滅菌、高生產(chǎn)強(qiáng)度等特性，在PHA生產(chǎn)成本上實(shí)現(xiàn)了里程碑的突破。然而，不論是CIB或NGIB技術(shù)體系，PHA的提純、改性加工、產(chǎn)品制備等工藝的開發(fā)將是進(jìn)行PHA規(guī)?；a(chǎn)與市場(chǎng)應(yīng)用的關(guān)鍵。

本文總結(jié)近年來基于基因工程改造的微生物合成PHA、菌株優(yōu)化、生物發(fā)酵生產(chǎn)體系、PHA提純與改性加工等方面的研究進(jìn)展，提出了未來PHA生物合成仍需解決的潛在問題，并展望了其未來發(fā)展的必然性與重要性。

1 PHA工業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)狀

1.1 基于CIB的PHA生物合成進(jìn)展

隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，高效的基因編輯方法及工具得以開發(fā)，這加快了微生物的工程改造效率，進(jìn)一步推動(dòng)生物技術(shù)與生物制造工業(yè)的發(fā)展與進(jìn)步[1]。因此，工業(yè)生物技術(shù)可通過大規(guī)模的微生物發(fā)酵培養(yǎng)來合成多元化的目標(biāo)產(chǎn)品[2]，而PHA作為生物基聚酯材料是最為典型且重要的產(chǎn)物之一。在PHA傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)用較廣的微生物底盤有大腸桿菌、真氧產(chǎn)堿桿菌和假單胞菌等，這些菌株的基因組信息、基因改造方法、發(fā)酵過程控制等均被較深入地研究，取得了一系列的研究成果，并在國(guó)內(nèi)外有一定的產(chǎn)業(yè)建設(shè)基礎(chǔ)。如TianAn Biopolymer公司以真氧產(chǎn)堿桿菌為底盤生產(chǎn)聚(3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸)(PHBV)可達(dá)到2 000 t/a[3]，GreenBio公司以大腸桿菌為底盤生產(chǎn)聚(3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸)(P34HB)可達(dá)10 000 t/a[3]。

截至目前，針對(duì)PHA合成的底盤微生物研究頗多，且已在多方面實(shí)現(xiàn)重要的成果突破[4-16](表1)。由于假單胞菌(Pseudomonassp.)含有第Ⅱ類PHA聚合酶(PhaC-Ⅱ)，對(duì)中長(zhǎng)碳鏈(M/LCL)的單體有天然的聚合特異性,同時(shí)假單胞菌可利用的碳源種類多(如不同的脂肪酸等),因此可合成種類繁多的PHA。如Koller等以水解乳清滲透液和戊酸鹽為原料培養(yǎng)Pseudomonashydrogenovora合成PHBV，其產(chǎn)量及對(duì)3-羥基戊酸(3HV)的摩爾收率分別達(dá)1.44 g/L和21%；Li等[5]通過弱化Pseudomonasentomophila的β-氧化途徑，以葡萄糖和脂肪酸(碳鏈長(zhǎng)度可從C9～C18)為原料,合成出P(3HB-co-MCL/LCL 3HAs)，并且細(xì)胞生物量(以干質(zhì)量計(jì))和PHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到9 g/L和60%，Vo等[6]通過在PseudomonasputidaKCTC1639中過表達(dá)phaJ基因，以辛酸為原料，可使MCL-PHA的產(chǎn)量從0.38 g/L提高至0.51 g/L。Salvachúa等[7]通過基因改造構(gòu)建PseudomonasputidaAG2162菌株，以木質(zhì)素為原料可實(shí)現(xiàn)65.4 g/L細(xì)胞生物量的積累，且MCL-PHA達(dá)17.7%(摩爾百分?jǐn)?shù))。Hokamura等[8]以Pseudomonassp.61-3為出發(fā)菌，利用大豆廢水提取的粉末(SWP)作為碳氮源,最終得到5.5 g/L的細(xì)胞生物量，PHA含量達(dá)32%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

表1 基于CIB的PHA生物合成概覽

大腸桿菌具有生長(zhǎng)速度快、細(xì)胞培養(yǎng)密度較高、基因改造便捷以及胞內(nèi)沒有降解PHA聚合物的解聚酶等優(yōu)點(diǎn)，因此作為工程底盤被廣泛用于PHA發(fā)酵生產(chǎn)。Choi等[9]通過基因改造,以葡萄糖和硫胺素為原料,最終細(xì)胞生物量和PHB產(chǎn)量分別達(dá)到194.1和141.6 g/L。Boontip等[10]引入CupriavidusnecatorA-04中的phaCAB基因簇,在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)89.8%的PHB積累，且生產(chǎn)強(qiáng)度高達(dá)0.43 g/(L·h)。

真氧產(chǎn)堿桿菌Ralstoniaeutropha(別名為C.necator)是一株能天然合成PHA的菌株[11]，底物利用相對(duì)較廣,除常規(guī)的碳源(如葡萄糖、脂肪酸等)外,它還能利用CO2、廢油、植物油及動(dòng)物脂肪等[12]。C.necatorH16/Pmpas03菌株以芥花油為原料，可產(chǎn)生生物量為6.32 g/L的細(xì)胞，PHA共聚物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到66.1%[13]；C.necatorH16(pMRC03)菌株以菜籽油為碳源，可積累細(xì)胞生物量6.2 g/L，PHA共聚物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)96%[14]；以葡萄糖為原料，基于Alcaligeneseutrophus菌株的分批補(bǔ)料發(fā)酵可生產(chǎn)232 g/L的PHB，產(chǎn)率高達(dá)3.14 g/(L·h)[15]。此外，以咖啡渣廢油為原料培養(yǎng)RalstoniaeutrophaRe2133[16],同時(shí)過表達(dá)phaJ和phaC2基因，敲除phaB1、phaB2和phaB3基因，最終實(shí)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)69%的PHA積累，其中3-羥基己酸(3HHx)的摩爾比例高達(dá)22%。Mizuno等[17]將PhaC1-Ps聚合酶引入RalstoniaeutrophaPHB-4中，實(shí)現(xiàn)含有特殊官能團(tuán)結(jié)構(gòu)(苯環(huán))單體的PHA合成，如P(3HB-co-8.9% 3H3PhP)。

然而,傳統(tǒng)工業(yè)底盤的PHA生產(chǎn)過程仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先,為保證無菌的菌種生長(zhǎng)環(huán)境，需投入大量的能耗產(chǎn)生蒸汽，用于滅菌、復(fù)雜的防染菌措施等，使得生產(chǎn)的能耗成本、過程控制成本居高不下。其次,生產(chǎn)過程不能連續(xù)、碳源轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物產(chǎn)率低等因素也一定程度上增加了PHA的生產(chǎn)成本[18]。最后,下游分離提純產(chǎn)品收率低、工藝過程復(fù)雜等增加了PHA生產(chǎn)過程的能耗與產(chǎn)品損耗[19]。因此，開發(fā)更簡(jiǎn)便、節(jié)能、經(jīng)濟(jì)的工業(yè)生物技術(shù)體系是解決以上工業(yè)瓶頸問題的關(guān)鍵策略之一。

1.2 NGIB的優(yōu)缺點(diǎn)

由于傳統(tǒng)工業(yè)生物技術(shù)所使用的底盤微生物只能在中性pH、無菌及低滲透壓的條件下生長(zhǎng)[20],因此極易出現(xiàn)染菌現(xiàn)象。為降低發(fā)酵生產(chǎn)過程中水電氣的消耗并實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，已開發(fā)基于嗜鹽微生物的NGIB平臺(tái)(圖1)[19]。目前，NGIB平臺(tái)主要是基于極性微生物實(shí)現(xiàn)連續(xù)、開放、節(jié)能的高效生產(chǎn)。其中，在高堿、高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)的嗜鹽單胞菌屬(Halomonasspp.)作為NGIB實(shí)例，已實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用。因?yàn)樵擃惥瓴粌H可以在高鹽、高堿且非滅菌條件下快速生長(zhǎng)[20],而且還是天然的PHB合成菌株[21]。野生型H.bluephagenesisTD01可利用葡萄糖在連續(xù)、開放過程中積累細(xì)胞生物量達(dá)80 g/L，PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)80%,且過程中葡萄糖轉(zhuǎn)化率最高接近50%[21]。在南海冰里發(fā)現(xiàn)的Halomonassp.363菌株攜帶著3種PHA聚合酶，并且它具有3種不同的PHA合成途徑,因此可以同時(shí)合成SCL-PHA和MCL-PHA[22]。在埃及的Mariout 鹽水湖分離出2株能合成PHBV的鹽單胞菌(HalomonaspacificaASL10 和HalomonassalifodianeASL11)，其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的PHBV產(chǎn)量分別達(dá)到5.5和6.2 g/L[23]。此外，Kawata等[24]篩選的Halomonassp.KM-1菌株可利用含有葡萄糖的硝酸鹽作為原料，其批次發(fā)酵培養(yǎng)可分泌(R)-3-羥基丁酸(BHB)達(dá)40.3 g/L，產(chǎn)率達(dá)0.48 g/(L·h)。

圖1 傳統(tǒng)工業(yè)生物技術(shù)與下一代工業(yè)生物技術(shù)對(duì)比

為了進(jìn)一步強(qiáng)化NGIB技術(shù)平臺(tái)生產(chǎn)PHA及其單體種類,針對(duì)H.bluephagenesisTD01的基因改造方法已被逐步開發(fā)、建立，其中包括CRISPR基因編輯技術(shù)、表達(dá)元件及系統(tǒng)等，已在PHA合成中得以應(yīng)用。如，Zhao等[25]開發(fā)了新型類T7的表達(dá)系統(tǒng)用于細(xì)胞形態(tài)控制與PHB合成途徑的調(diào)控,實(shí)現(xiàn)超過100倍的細(xì)胞長(zhǎng)度增加和高達(dá)92%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的PHB積累。Fu等[26]通過敲除prpC基因構(gòu)建菌株HalomonasTD04，利用丙酸和葡萄糖合成HBV共聚物，積累量達(dá)70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以上。Chen等[27]通過在H.bluephagenesisTD01的基因組上整合引入orfZ基因,在1 000 L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵，細(xì)胞生物量83 g/L，并積累近50 g/L的P34HB共聚物。Ren等[28]過表達(dá)phaCAB基因簇構(gòu)建的H.bluephagenesisTDHCD-R3-8-3菌株，可在搖瓶培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)15 g/L細(xì)胞干生物量的積累，其中PHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)94%,而在7 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)的細(xì)胞生物量和PHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到90 g/L和79%。Yu等[29]在鹽單胞菌種中引入PhaCJ4AK4，利用葡萄糖和5-己烯酸、己酸等為原料，合成短鏈和中長(zhǎng)鏈PHA的共聚物(S/MCL-PHA),且5-己烯酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)到91%。Ling等[30]通過調(diào)整鹽單胞菌胞內(nèi)NADH/NAD+比例，使得PHB的積累量增加了6%。以上基因工程改造實(shí)例從不同角度對(duì)鹽單胞菌的PHA合成進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)后續(xù)的PHA工業(yè)生產(chǎn)有著重要的推進(jìn)作用。

一般來講，PHA的生產(chǎn)成本[31]主要來源于原料與能耗，而發(fā)酵過程的動(dòng)力消耗是最主要部分，包括攪拌、滅菌及空氣供給等,此外下游的分離純化也是主要的耗能單元[20]。然而，由于鹽單胞菌特有的高鹽堿生長(zhǎng)特性,可以利用海水進(jìn)行開放發(fā)酵，大幅降低了PHA的發(fā)酵能耗。而且，經(jīng)過一系列的基因工程改造，該菌株目前可實(shí)現(xiàn)含有3HB、4HB、3HV、3HHx和3HP等多種聚合單體的PHA均聚及共聚物合成，使得熱力學(xué)性能更優(yōu)的聚酯材料制備[2,26-27,29]的人力成本進(jìn)一步降低，目前已建成年產(chǎn)千噸級(jí)的PHA生產(chǎn)線(MedPHA Co.Ltd.)[19]。然而，NGIB也同樣面臨著若干困難，如鹽單胞菌底盤細(xì)胞的基因組信息研究不夠深入、基因改造方法的效率相對(duì)不高，還需對(duì)能利用廉價(jià)原料的菌株進(jìn)一步改造篩選等。同時(shí)，提高開放發(fā)酵體系的提取純化效率、減少廢水排放等策略仍待完善。此外,在代謝動(dòng)態(tài)控制[32]、低成本誘導(dǎo)[2]、高通量細(xì)胞改造設(shè)計(jì)[28]等領(lǐng)域均需要進(jìn)一步探索挖掘?，F(xiàn)將CIB和NGIB技術(shù)的典型菌種生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)對(duì)比總結(jié)于表2中。

表2 重組鹽單胞菌合成PHA的工業(yè)優(yōu)勢(shì)

2 PHA合成強(qiáng)化策略

PHA合成強(qiáng)化策略主要有細(xì)胞攝氧能力強(qiáng)化、細(xì)胞形態(tài)工程、人工固定CO2途徑和廢棄生物質(zhì)利用這四方面，具體過程見圖2。

2.1 細(xì)胞攝氧能力強(qiáng)化

由于PHA的發(fā)酵生產(chǎn)過程是強(qiáng)耗氧過程,O2參與了ATP合成與許多細(xì)胞活動(dòng)所必需的生化反應(yīng)，因此O2供給控制是影響胞內(nèi)代謝的重要因素。研究表明，在不同的曝氧和攪拌條件下，溶氧對(duì)PHBV發(fā)酵生產(chǎn)的提高是顯著的[35]。然而，純氧及富氧空氣的供給不僅昂貴，增加了生產(chǎn)成本，而且還易引起爆炸[36]。Ouyang等[37]在鹽單胞菌中將血紅蛋白定位至細(xì)胞周質(zhì)空間以強(qiáng)化微生物的O2攝取能力，從而使得細(xì)胞生物量增加1倍(圖2(a))。

2.2 細(xì)胞形態(tài)工程

在微生物胞內(nèi)產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)過程中,細(xì)胞體積的大小將一定程度上限制目標(biāo)產(chǎn)物積累能力的發(fā)揮[38]。PHA作為細(xì)胞內(nèi)積累的包涵體[39]，通過改變細(xì)胞形態(tài)大小可進(jìn)一步提高PHA的積累。Jiang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合抑制編碼細(xì)菌分裂環(huán)和細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的基因(ftsZ和mreB)表達(dá)[40]，可獲得更長(zhǎng)和更大的細(xì)胞空間，使得PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從40%提升至80%(圖2(b))[41]。此外，在鹽單胞菌H.bluephagenesisTD01中，包涵體包裹蛋白PhaP的敲除，可以獲得單一的胞內(nèi)PHA顆粒[42]；同時(shí)，通過過表達(dá)minC和minD(編碼分裂Z環(huán)定位蛋白)基因,使得PHA顆粒大小增大至10 μm[43]。該研究的成功對(duì)于PHA的下游分離純化有著重要的應(yīng)用價(jià)值。

圖2 PHA生物合成過程強(qiáng)化

2.3 人工固定CO2途徑

在微生物有氧生長(zhǎng)的碳代謝過程中，碳源進(jìn)入細(xì)胞代謝后轉(zhuǎn)化為丙酮酸并獲得ATP和NADPH,丙酮酸進(jìn)一步代謝則得到乙酰輔酶A。而在這個(gè)代謝過程中,每生成1個(gè)乙酰輔酶A將會(huì)產(chǎn)生2個(gè)CO2，造成嚴(yán)重的碳原子流失，從而難以實(shí)現(xiàn)更高的底物轉(zhuǎn)化率[44]。Bogorad等[45]設(shè)計(jì)了1個(gè)從己糖、戊糖和丙糖磷酸鹽出發(fā)的非氧化糖酵解途徑(NOG)，使糖分解為乙酰輔酶A的碳完全保留，達(dá)到100%碳產(chǎn)率。Li等[46]和Wang等[47]通過結(jié)合糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑，在大腸桿菌中構(gòu)建了1個(gè)名為EP-bifido途徑的碳保護(hù)系統(tǒng)，在提高葡萄糖到乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化率的同時(shí),也提供細(xì)胞所需的NADPH，從而獲得更高的PHB轉(zhuǎn)化率，且PHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)85.1%(圖2(c))。

2.4 廢棄生物質(zhì)利用

利用廢棄生物質(zhì)作為底物生產(chǎn)PHA也是目前的研究熱點(diǎn)之一，包括紡織廢棄物、木質(zhì)纖維素、粗甘油、玉米深加工副產(chǎn)物等(圖2(d))。如，Tamboli等[48]以紡織染料Direcr Red 5B 降解后產(chǎn)生的生物質(zhì)為碳源合成了聚-3-羥基十六烷酸酯(PHD)。Munir等[49]使用揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和葡萄糖作為混合碳源培養(yǎng)假單胞菌,獲得了更高的PHA產(chǎn)量。Bengtsson等[50]利用活性污泥處理廢水中富含的揮發(fā)性脂肪酸(主要由羥基丁酸鹽和羥基戊酸鹽組成)為碳源合成PHA,且PHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)污泥干質(zhì)量的48%。Ye等[51]使用廢葡萄糖酸鹽母液作為H.bluephagenesis的底物，在7 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)PHA高產(chǎn)，細(xì)胞生物量達(dá)70 g/L以上。此外，木質(zhì)纖維素(LF)也是近年來生物質(zhì)利用研究的熱點(diǎn)。木質(zhì)纖維素主要由多糖組成，可以經(jīng)物理化學(xué)及生物轉(zhuǎn)化成為發(fā)酵用糖，從而合成PHA。因此，使用LF作為底物不僅可以降低PHA原料成本，而且也可促進(jìn)木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化利用[52]。

3 PHA分離純化

有機(jī)/非有機(jī)(水相提取)溶劑法是目前常用的PHA提取純化方法。一般而言，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的材料提取制備及醫(yī)療級(jí)的PHA制備多采用有機(jī)溶劑法，而工業(yè)級(jí)的PHA提純則采用非有機(jī)相提取方法。有機(jī)相提取方法有提取純度高、材料分子量損失小等優(yōu)勢(shì)，但過程不環(huán)保，也難以實(shí)現(xiàn)大宗材料的規(guī)模化制備。而水相提純方法過程相對(duì)簡(jiǎn)單、提取成本較低，可以很好地實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，但存在提取純度不高、雜質(zhì)含量可控性差且會(huì)有一定的分子量損失等缺點(diǎn)。在PHA工業(yè)化生產(chǎn)過程中，PHA的提純工藝開發(fā)對(duì)于PHA材料穩(wěn)定性、生產(chǎn)成本等有著舉足輕重的影響。因此，以提取純化過程問題為導(dǎo)向的菌株反向設(shè)計(jì)，同時(shí)結(jié)合下游工藝及設(shè)備改進(jìn)，可有效改良生產(chǎn)中的PHA提純工藝，實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)、低成本的PHA生產(chǎn)。

PHA的非有機(jī)提取流程主要包括兩步：第一步為細(xì)胞分離及破碎，第二步為PHA純化。目前，細(xì)胞破碎主要有化學(xué)法、物理法和酶法3種。劉永東等[53]基于KOH的2次消化提取法獲得的PHA純度達(dá)98.3%，其特性黏度為1.02 mL/mg，收率達(dá)到75%。可見，二次消化提取有利于提高PHA的純度和降低KOH對(duì)PHA大分子的降解。潘貴全等[54]利用次氯酸鈉與氯仿(體積比1∶1)混合液從重組大腸桿菌中提取PHA時(shí)發(fā)現(xiàn)，次氯酸鈉可快速實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破壁，同時(shí)PHA分子可及時(shí)溶解于氯仿中以防止分子量損失，最終PHA的純度可達(dá)90%。但在堿性條件下，次氯酸鈉將導(dǎo)致嚴(yán)重的PHA降解(下降約50%)[55]。此外，使用溫和極性溶劑及攪拌輔助對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可削弱細(xì)胞包膜，也可改善PHA后續(xù)的溶劑提取效率[56-57]。非離子表面活性劑(如Tween20、BrijL4 和 TritonTMX-114等)預(yù)處理含PHA的菌體，提純的PHA 純度超90%，分子量損失低于24%[58]。近年來，超臨界流體萃取也越來越多地用于天然高值物質(zhì)的高效萃取[57]，而且超臨界 CO2(sCO2)由于對(duì)許多疏水化合物具有較高溶解度，被認(rèn)為是一種非常便捷且安全的溶劑，具有提取后可立即完全揮發(fā)、無任何殘留物的優(yōu)點(diǎn)。因此，sCO2也被作為溶劑用于PHA的提取純化[59-60]。高壓均質(zhì)破碎和十六烷基磺酸鈉(SDS)破壁是目前主要的物理和化學(xué)細(xì)胞破碎方法，其中，PHA最大回收率可達(dá) 98%，純度最高可達(dá)95%[61]。此外，利用超聲和滲透壓也可促進(jìn)細(xì)胞破碎，能提高PHA的回收效率[61-62]。

仲丁醇作為溶劑來預(yù)處理細(xì)胞，PHA分子質(zhì)量損失小(達(dá)83萬)，提取收率達(dá)78%，產(chǎn)品純度達(dá)99%以上[63]。利用正丁醇也可進(jìn)一步將PHA純度從 91.2% 提高到98.0%[64]。在有機(jī)溶劑提取過程中，通過聚合物在溶劑中重復(fù)溶解和析出沉淀的方式，也可極大地提高最終PHA的純度[65]。典型的鹵化物萃取溶劑如氯仿、二氯甲烷等在PHA提取和純度方面表現(xiàn)良好[57]。在提取PHA后，添加“PHA反溶劑”(通常是低分子醇)降低PHA的溶解度，從而獲得高純度的PHA[66]，但該方法需要添加近10～20倍體積的反溶劑，大規(guī)模制備難度較大，可行性不高[67]。

此外，伽馬輻射也可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破裂并促進(jìn) PHA與非PHA的細(xì)胞生物量的分離，同時(shí)誘導(dǎo)PHA分子交聯(lián)以增加摩爾質(zhì)量，利于細(xì)胞內(nèi)PHA的提取[68]。而通過蛋白酶水解，添加核酸酶、磷脂酶及溶菌酶等可提高PHA的提取效率、收率及純度；或結(jié)合酶混合、表面活性劑和加熱的方法，即提取過程中通過熱處理(約150 ℃)可使核酸變性并啟動(dòng)細(xì)胞裂解，通過胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等催化作用對(duì)細(xì)胞生物質(zhì)進(jìn)行酶解，再使用陰離子表面活性劑溶解去除殘留生物質(zhì)，可大幅提高PHA的提純效率，最終提取的PHA純度超95%[69]。

4 PHA改性加工

由于前期缺乏穩(wěn)定、大批量的PHA材料供給，因此PHA的下游改性加工工藝及設(shè)備開發(fā)仍處于萌芽期。而且，PHA材料種類繁多、聚合單體的比例及種類多樣，造就了PHA材料豐富的熱力學(xué)性能特性的同時(shí)，也為其改性加工帶來了一定的前期研發(fā)成本。目前，物理共混、化學(xué)改性等是研究較多的PHA改性加工方式。

例如，微螺桿擠出機(jī)可制備木粉和PHA復(fù)合材料，其過程的設(shè)備和工藝參數(shù)評(píng)價(jià)是決定工藝可靠性的關(guān)鍵，微螺桿類型、制備速度、層厚和噴嘴直徑等對(duì)新材料性能有顯著的影響。因此，印刷產(chǎn)品的性能可以通過擠出流量與螺桿速度相關(guān)的比率來控制[70]。Marmol等[71]研究發(fā)現(xiàn)，添加微纖維素(MF)可使PHA強(qiáng)度增加23%，紫外線阻隔效果更佳，但同時(shí)也增加了材料表面的粗糙度。此外，添加γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)改性粉煤灰可改善PHA與粉煤灰間的相容性，使得PHA的韌性明顯增強(qiáng)，而且粉煤灰的添加也改善了PHA材料的熱學(xué)性能[72]。而高強(qiáng)度硼酸鋁納米晶須對(duì)PHA復(fù)合材料的力學(xué)性能也具有明顯的增強(qiáng)作用，在添加量為0.4%時(shí)PHA抗拉強(qiáng)度達(dá)到最大(38.5 MPa，增加109%)，同時(shí)，抗屈服強(qiáng)度提高近3倍(達(dá)到26.2 MPa)，斷裂伸長(zhǎng)率提高24.5%，楊氏模量提高4倍以上(達(dá)到7.6 MPa)。另外，斷裂面分析表明納米晶須和PHA結(jié)合力較好[73]。

由于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與PHA具有較好的相容性，張永霞等[74]研究利用熔融共混技術(shù)制備PHA/PVP復(fù)合材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PVP用量的增加，斷裂功和結(jié)晶度在PVP用量為4%時(shí)出現(xiàn)最大值，復(fù)合材料的力學(xué)性能和結(jié)晶性能得到顯著改善。曹偉娜等[75]在PHA中添加聚己內(nèi)酯(PCL)制備成共混復(fù)合材料，以提高PHA的結(jié)晶度，但發(fā)現(xiàn)對(duì)PHA熔點(diǎn)沒有影響，而隨著體系中PCL含量的增加，PHA結(jié)晶度呈現(xiàn)先增大而后降低的趨勢(shì)，在PHA與PCL的質(zhì)量比為60∶40時(shí)共混材料性能表現(xiàn)最佳。

王淑芳等[76]研究發(fā)現(xiàn)，熔融共混聚乳酸(PLA)和PHBHHx時(shí)，隨著PHBHHx比例的增加，共混材料的拉伸強(qiáng)度和楊氏模量降低，而生物降解速率顯著提高。當(dāng)共混材料PLA/PHBHHx質(zhì)量比為2∶8時(shí)，力學(xué)性能和生物降解性能達(dá)到最優(yōu)的均衡值。將甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)接枝的PHBV(PHBV-GMA)與聚碳酸亞丙酯(MA-PPC)進(jìn)行反應(yīng)性共混，通過反應(yīng)接枝MA-PPC，使得PHBV部分?jǐn)U散進(jìn)入MA-PPC相區(qū)，降低PHBV結(jié)晶度，當(dāng)PHBV球晶的尺寸降低，可改善PHBV和MA-PPC共混組分的相容性[77-78]。陶劍等[79]將聚乳酸(PLA)、聚碳酸酯(PPC)及PHBV共混制備各種不同比例的三元共混膜，可實(shí)現(xiàn)三者的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)：PLA對(duì)材料強(qiáng)度有增強(qiáng)作用，PPC有助于材料斷裂伸長(zhǎng)，PHBV則可提高材料在環(huán)境中的生物降解速率。Lin等[80]通過PHB和聚(己二酸丁二醇對(duì)苯二甲酸酯)(PHB/PBAT)共混，結(jié)合制備靜電紡絲技術(shù)可制備生物降解的納米纖維膜，并通過接枝1-烯丙基乙內(nèi)酰脲和全氟丙烯酸辛酯到纖維膜上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該納米纖維膜對(duì)大腸桿菌(ATCC 43895)和金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性，且對(duì)UV-A光照具有良好的穩(wěn)定性和耐久性。

5 總結(jié)與展望

PHA作為全生物合成、全生物降解的高分子材料，近年來受到了產(chǎn)業(yè)和市場(chǎng)的廣泛關(guān)注。而且，PHA上游發(fā)酵生產(chǎn)與下游應(yīng)用加工的相關(guān)研究及工業(yè)化探索也不斷取得突破性進(jìn)展。本文從生物制造體系比較分析、PHA細(xì)胞合成優(yōu)化、下游分離純化與改性加工3個(gè)方面對(duì)PHA的產(chǎn)學(xué)研進(jìn)行了介紹。相比于傳統(tǒng)工業(yè)技術(shù)，下一代工業(yè)生物技術(shù)在PHA的生物合成中體現(xiàn)出良好的平臺(tái)化特性，且利于下游分離純化的節(jié)能減排，該技術(shù)體系的規(guī)?；I(yè)應(yīng)用對(duì)于PHA放大生產(chǎn)與市場(chǎng)化應(yīng)用有著重要的價(jià)值。而PHA下游分離純化和改性加工在工藝優(yōu)化和設(shè)備改造方面仍有著一定的優(yōu)化空間，也將是銜接目前產(chǎn)線擴(kuò)量和終端產(chǎn)品應(yīng)用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其體系的建立更是未來PHA進(jìn)入規(guī)?；袌?chǎng)應(yīng)用的有力保障。與此同時(shí)，基于下一代工業(yè)生物技術(shù)，不斷優(yōu)化PHA合成效率，加強(qiáng)其以工業(yè)生產(chǎn)問題導(dǎo)向的反向工程菌設(shè)計(jì)、開發(fā)，是進(jìn)一步降低成本的有效策略之一。