解脂耶氏酵母合成萜烯的進展：見微知著的改造策略

劉 琪，戴宗杰，王欽宏

(1.中國科學院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308；2.國家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308；3.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457)

萜類化合物也稱為類異戊二烯類化合物，是自然界廣泛存在的一種次級代謝物，幾乎在所有單細胞或多細胞生物(包括細菌，古細菌，原生生物和真核生物)中都有發(fā)現(xiàn)，并發(fā)揮著重要功能[1]。所有的萜類化合物均衍生自C5單元前體化合物異戊烯基二磷酸(IPP)及其異構(gòu)體二磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)，種類繁多且結(jié)構(gòu)多樣，根據(jù)C5單元數(shù)量的不同可以分為單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)和四萜(C40)等[2]。因萜類化合物在食品、醫(yī)藥、香料香精和生物燃料等領(lǐng)域具有重要價值，其需求量亦日益增加[3]。

傳統(tǒng)上，萜類化合物主要通過化學合成或植物提取的方法進行生產(chǎn)。但萜類化合物具有雜環(huán)或手性碳等化學合成難度高的結(jié)構(gòu)，導致化學合成效率低、成本高[4]。植物中萜類化合物的含量低，并且純化時易受雜質(zhì)影響導致難以獲得純提取物。此外，許多植物因受到嚴格的地理和氣候條件限制而生長緩慢，原材料獲取難度高，所以植物提取的方式不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)萜類化合物[5-6]。融合了生物學、化學、物理學、信息學與人工智能等學科的代謝工程與合成生物學為利用異源底盤細胞進行萜類化合物大規(guī)模生產(chǎn)提供了新思路。

合適的底盤細胞對萜類化合物的生物合成至關(guān)重要。研究者們已經(jīng)在模式菌株大腸桿菌和釀酒酵母中成功實現(xiàn)了多種功能性萜類及衍生物的生產(chǎn)[7-8]。但是，大腸桿菌存在內(nèi)毒素、乙酸脅迫和缺乏轉(zhuǎn)錄后修飾與完整的內(nèi)膜系統(tǒng)等缺點，限制了許多真核來源的基因表達和目標產(chǎn)物合成的效率[9-10]。與大腸桿菌相比，釀酒酵母雖然具有完整的翻譯后修飾和細胞器及內(nèi)膜系統(tǒng)，但釀酒酵母存在較高的培養(yǎng)基需求及以葡萄糖為碳源進行有氧發(fā)酵時存在合成乙醇的Crabtree效應等缺點，限制了其工業(yè)化應用[5,11]。

非傳統(tǒng)酵母——解脂耶氏酵母因其高效的脂質(zhì)積累和多底物利用能力且對多種有機溶劑、高滲透壓和酸堿環(huán)境的耐受性而備受關(guān)注，日漸成為合成生物學研究與代謝工程改造的底盤菌株[12]。隨著對解脂耶氏酵母生理代謝研究的不斷深入和遺傳改造技術(shù)(如，CRISPR/Cas、Cre/LoxP等)的快速發(fā)展，解脂耶氏酵母代謝工程改造的進程加快[13]。解脂耶氏酵母與釀酒酵母、大腸桿菌作為萜類化合物細胞工廠特性比較[5]見表1。

表1 3種萜類化合物細胞工廠的特征比較

充足的前體物質(zhì)供應和優(yōu)良的產(chǎn)物儲存能力是解脂耶氏酵母進行萜類化合物合成的優(yōu)勢。近年來，解脂耶氏酵母已被工程化地用于合成多種萜類化合物，例如檸檬烯、芳樟醇、α-法尼烯、角鯊烯、β-胡蘿卜素、番茄紅素和蝦青素等[14-36](表2)，表現(xiàn)出巨大的工業(yè)化應用潛力(圖1)[14]。

ERG10—acetyl-CoA acetyltransferase; ERG13—HMG-CoA synthase; HMG1—HMG-CoA reductase; ERG12—mevalonate kinase; ERG8—phosphomevalonate kinase; ERG19—mevalonate diphosphate decarboxylase; IDI1—IPP isomerase; ERG20—farnesyl pyrophosphate synthetase; ERG9—squalene synthase; TS—terpene synthase; GPP—geranyl diphosphate; FPP—farnesyl diphosphate; GGPP—geranylgeranyl diphosphate

表2 解脂耶氏酵母中合成萜烯的代表性實例

因此，本文從關(guān)鍵酶挖掘與改造、代謝途徑優(yōu)化與設(shè)計、細胞器工程以及細胞全局水平調(diào)控這4個層次總結(jié)了現(xiàn)有解脂耶氏酵母中萜類化合物的合成策略，最后展望了進一步提高該宿主中萜類化合物產(chǎn)量的研究方向與工程方法，旨在為利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)萜類化合物提供新的策略。

1 酶與途徑工程

1.1 萜烯合酶的挖掘

目前已經(jīng)分離鑒定出超過80 000種天然萜類化合物，功能多樣的萜烯合酶(TS)是合成結(jié)構(gòu)多樣的萜類化合物的基礎(chǔ)[37-38]。萜烯合酶的挖掘與產(chǎn)物合成一般在遺傳操作工具成熟的模式菌株如釀酒酵母或大腸桿菌中進行。解脂耶氏酵母的萜烯合成所用萜烯合酶大都已經(jīng)在大腸桿菌或者釀酒酵母中應用，如來自蘋果的α-法尼烯合酶和來自天竺葵的檸檬烯合酶[15, 21]。然而，由于不同底盤細胞底物的供給水平以及內(nèi)環(huán)境的差異，會導致同種萜烯合酶在不同底盤菌株中合成效率的差異化。因此，需要挖掘表征更多其他物種來源的萜烯合酶以提高解脂耶氏酵母萜類化合物的多樣性與生產(chǎn)效率。

同一種萜烯化合物可由不同的底物經(jīng)酶催化而來，篩選針對不同底物的萜烯合酶可以使萜類化合物的合成多樣化。一般情況下，單萜由香葉基二磷酸(GPP)轉(zhuǎn)化而來，但Schilmiller等[39]發(fā)現(xiàn)二磷酸橙花酯合酶(NDPS1)可催化DMAPP和IPP生成NPP(二磷酸橙花酯)，而以NPP為底物可以生成多種單萜。將NDPS1引入解脂耶氏酵母，以NPP為底物合成單萜檸檬烯和蒎烯，豐富了單萜的合成路徑[16, 18]。除了NPP、GPP外，解脂耶氏酵母中DMAPP和IPP融合還會產(chǎn)生不同的碳骨架，如菊花基二磷酸酯(CPP)、薰衣草基二磷酸酯(LPP)、馬康內(nèi)酯二磷酸酯(MPP)或二磷酸二磷酸酯(PPP)等化合物。針對這些特殊底物的萜烯合酶挖掘鑒定也能有助于進一步豐富萜類化合物家族[40]。鑒于解脂耶氏酵母為底盤具有萜類合成前體乙酰輔酶A和NADPH代謝通量高的優(yōu)勢以及遺傳改造工具的不斷發(fā)展，以解脂耶氏酵母作為底盤進行萜烯合酶挖掘表征與改造尤為必要。

1.2 合成途徑設(shè)計與優(yōu)化

萜類化合物生物合成可分為上游前體物質(zhì)IPP、DMAPP供應和下游萜類物質(zhì)合成兩部分[41]。解脂耶氏酵母內(nèi)源甲羥戊酸(MVA)途徑不僅可以提供萜類合成所需前體物，而且還可提供細胞生長必需物質(zhì)麥角甾醇的前體物。所以，優(yōu)化上游前體物質(zhì)供應、平衡下游萜烯合成與細胞生長之間的關(guān)系是利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)萜類化合物的重要策略之一。

1.2.1 內(nèi)源前體合成途徑優(yōu)化

解脂耶氏酵母中萜類化合物合成所需的前體物質(zhì)由內(nèi)源MVA途徑提供，首先從乙酰輔酶A出發(fā)經(jīng)過6步酶促反應產(chǎn)生IPP，然后通過異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)將IPP異構(gòu)化產(chǎn)生DMAPP，最后再以IPP和DMAPP為供體合成萜類物質(zhì)的前體物質(zhì)，如GPP、法尼基二磷酸(FPP)等(圖1)。但是，較長的代謝途徑存在兩方面的缺點：一方面降低了目標產(chǎn)物的代謝通量；另一方面，較多的途徑中間體更易受本源代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控和限制。因此，過表達限速酶、強化代謝途徑整體表達水平是增加MVA途徑通量和前體供應的常用手段。

HMG1編碼的HMG-CoA還原酶HMGR催化MVA的生成，這一反應是MVA途徑的限速步驟[42]。在解脂耶氏酵母中單獨過表達HMG1即可增加2倍的紫杉二烯產(chǎn)量和20倍的角鯊烯產(chǎn)量[27, 29]。IDI是MVA途徑的另一個關(guān)鍵酶，它可催化IPP與DMAPP的相互轉(zhuǎn)變。在解脂耶氏酵母中，過表達tHMG1(截短的HMG1)、IDI、ERG20和α-法尼烯合酶的基因后得到了260.0 mg/L的α-法尼烯[20]。此外，過表達HMG1和IDI的策略已被應用于提高檸檬烯、芳樟醇、法尼烯、角鯊烯、蝦青素和胡蘿卜素等萜類化合物，且取得良好效果[15-16,21,34,43]。

甲基赤蘚糖-4-磷酸(MEP)途徑是另一種合成天然萜類前體的途徑，廣泛存在于細菌、藻類和植物葉綠體中[44](圖2)。一般認為酵母中不存在MEP途徑，但近期Dissook等[45]證實解脂耶氏酵母中存在MEP途徑。Yang等[46]在大腸桿菌中證實MVA途徑與MEP途徑存在協(xié)同作用，這可以提高兩種通路的通量，其中MVA途徑的通量提高了1.5倍，MEP途徑的通量提高了4.8倍。輔因子需求差異可能是兩種前體供應途徑協(xié)同作用的原因。從葡萄糖出發(fā)，MVA途徑合成1分子IPP/DMAPP會生成4分子NADPH，這些NADPH可以用于MEP途徑的消耗。因此，協(xié)同優(yōu)化解脂耶氏酵母MVA和MEP途徑也許可以為改造解脂耶氏酵母生產(chǎn)萜類化合物提供嶄新的思路。

1.2.2 異源前體供應途徑設(shè)計

由于內(nèi)源MVA途徑存在酶促反應步驟多、碳原子轉(zhuǎn)化率低等限制，所以有研究人員將目光轉(zhuǎn)向人工設(shè)計萜類合成前體供應途徑[47](圖2)。Chatzivasileiou等[48]設(shè)計了一種兩步法合成類異戊二烯前體的途徑——異戊烯醇途徑(IUP)，該途徑第一步將底物異戊二烯醇(isoprenol)和異戊烯醇(prenol)分別磷酸化形成異戊烯基單磷酸酯(IP)和二甲基烯丙基單磷酸酯(DMAP)，IP和DMAP再次被磷酸化得到IPP和DMAPP。由于IUP途徑存在反應步驟少、碳源利用率高且不與中心碳代謝競爭的優(yōu)點，所以可規(guī)避內(nèi)源前體供應途徑的短板，從而解決萜類生物合成IPP和DMAPP供應不足的問題。之后，Luo等[36]將IUP途徑引入解脂耶氏酵母后發(fā)現(xiàn)，與MVA途徑相比，IUP途徑將IPP和DMAPP產(chǎn)量提高了15.7倍，在解脂耶氏酵母中的番茄紅素產(chǎn)量達4.2 g/L。

DXP—1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate; CDP-ME—4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol; CDP-MEP—4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphate; MEC—2C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclo-diphosphate; HMBPP—4-hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate; IP—isopentenyl monophosphate; MG-CoA—3-methylglutaconyl-CoA; MB-CoA—3-methyl-2-butenoyl-CoA; MB—3-methyl-2-butenal

然而以石油化工來源的異戊烯醇作為反應底物不利于萜類化合物可持續(xù)生產(chǎn)。Clomburg等[49]受有機物逆合成概念啟發(fā)，設(shè)計了以HMG-CoA為底物從頭合成異戊烯醇的途徑(IPA途徑)，并用于大腸桿菌中的檸檬烯生產(chǎn)。與MVA途徑相比，IPA途徑表現(xiàn)出更少的ATP需求，同時與中心代謝的直接聯(lián)系賦予IPA途徑適用于不同宿主的能力。

總之，在解脂耶氏酵母中引入人工設(shè)計前體供應途徑，如IUP途徑、IPA途徑繞過內(nèi)源途徑限速步驟、減少還原力和ATP的消耗，可避免毒性中間產(chǎn)物積累，有助于提高萜類產(chǎn)量。

1.3 下游萜類化合物合成

不同于上游前體的供應過程，下游萜類化合物合成更復雜且與細胞生長競爭必需的底物。研究證實通過蛋白質(zhì)工程和啟動子工程精準調(diào)控關(guān)鍵酶活性和表達水平，可平衡產(chǎn)物生產(chǎn)與細胞生長[33, 50-52]，如圖3所示。

圖3 平衡下游萜類化合物合成與細胞生長策略

利用蛋白質(zhì)工程設(shè)計合理的突變體可以提高底物特異性和酶促反應速率。ERG20以IPP和DMAPP為底物順序合成GPP和FPP(圖1)，但該酶促反應不積累GPP，阻礙了單萜的生物合成[53]。為了提高GPP積累能力和單萜產(chǎn)量，Ignea等[50]在模擬釀酒酵母ERG20蛋白模型時發(fā)現(xiàn)，ERG20F96W-N127W突變體在保留GPP合成能力的同時，F(xiàn)PP合成能力降低了約30倍，該突變體在提供菌株生長所需FPP的同時為單萜生產(chǎn)積累大量底物GPP；將雙突變應用于解脂耶氏酵母ERG20(ERG20F88W-N119W)后，與未突變菌株相比，芳樟醇的產(chǎn)量提高了3.7倍[19]。進一步開發(fā)ERG20的多底物識別和順序催化反應能力，構(gòu)建的突變體ERG20F88C可以完成從GPP到FPP再到GGPP的轉(zhuǎn)化，為解脂耶氏酵母二萜和四萜生產(chǎn)平臺菌株提供了新的底物來源方式[24,54]。

用啟動子工程控制基因轉(zhuǎn)錄水平的方法平衡萜類生產(chǎn)和細胞生長效果明顯。FPP是角鯊烯、泛醌、麥角甾醇以及其他必需甾醇物質(zhì)的前體，同時倍半萜、三萜和四萜的生物合成都需要以FPP為底物[55]。角鯊烯合酶(ERG9)負責解脂耶氏酵母中角鯊烯的生成，是與目標萜類競爭底物FPP的關(guān)鍵酶節(jié)點[29]。篩選弱啟動子(如PBTS1)、基于麥角甾醇合成過程反饋抑制機制啟動子(如PERG1和PERG11)、基于動態(tài)調(diào)控的啟動子(如PALK1和PILC1)用于降低或調(diào)控ERG9的轉(zhuǎn)錄水平，促進FPP流向萜類化合物生產(chǎn)途徑[35, 51-52]。Kildegaard等[33]將解脂耶氏酵母的ERG9啟動子PERG9分別截短為50、100和500 bp并與反饋抑制啟動子PERG1和PERG11比較后發(fā)現(xiàn)，截短50 bp的PERG9效果最優(yōu)，使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了2.5倍。

2 細胞器工程

目前，解脂耶氏酵母的萜烯生產(chǎn)策略主要集中在細胞質(zhì)空間中改造關(guān)鍵酶與代謝途徑調(diào)控。但一方面萜烯的合成前體、酶、輔因子等分布在不同亞細胞區(qū)室中，不利于細胞質(zhì)中合成萜烯化合物，另一方面利用不同細胞器的特性，有利于改善解脂耶氏酵母萜類化合物生產(chǎn)性能[56-57]。細胞器工程改造已經(jīng)在釀酒酵母合成萜類化合物中取得顯著效果。Liu等[58]在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)，油滴形態(tài)的過氧化物酶體可以作為二萜角鯊烯的動態(tài)儲存?zhèn)}庫，并完整地將供應FPP的MVA途徑定向在過氧化物酶體中，使角鯊烯產(chǎn)量達到1.3 g/L，與出發(fā)菌株相比，提高了138倍(圖4)，再將細胞質(zhì)與過氧化物酶體進行雙重調(diào)節(jié)，角鯊烯產(chǎn)量提高至1.7 g/L。另一項研究中，Lv等[59]將MVA途徑整合至線粒體后，獲得了2.5 g/L的異戊二烯(圖4)，這是單獨細胞質(zhì)途徑無法比擬的。

圖4 細胞器工程合成萜類化合物[58]

在解脂耶氏酵母中各細胞器區(qū)室具有不同的生理環(huán)境、生物反應過程以及酶與代謝物組成。在線粒體中，三羧酸循環(huán)(TCA)和氧化磷酸化供應輔因子和能量、過氧化物酶體β-氧化供應前體乙酰輔酶A、脂質(zhì)體特殊疏水環(huán)境等都是不同細胞器區(qū)室為萜類物質(zhì)生物合成提供的獨特優(yōu)勢條件所在(圖4)[60-62]。具有產(chǎn)油特點的解脂耶氏酵母會在胞內(nèi)積累大量脂質(zhì)體，由甘油三酯、甾醇酯和磷脂單分子層組成的脂質(zhì)體具有高度疏水環(huán)境、利于儲存極性的萜類化合物[62-63]。Barth課題組的Matthaeus等[64]通過敲除β-氧化相關(guān)基因(POX1～POX6和GUT2)使解脂耶氏酵母脂質(zhì)體膨大，從而為番茄紅素在胞內(nèi)儲存提供更多的疏水空間，在分批補料培養(yǎng)條件下最終得到16 mg/g的番茄紅素。值得一提的是，脂質(zhì)體的形成需要消耗大量碳源，因此必須平衡萜類合成與脂質(zhì)體形成。雖然解脂耶氏酵母的細胞器工程改造研究仍處于起步階段，隨著對解脂耶氏酵母細胞器區(qū)室功能研究的逐漸清晰，可以對多細胞器進行協(xié)作改造，以提高萜類化合物合成效率。

細胞器工程在精細化改造解脂耶氏酵母增加萜類生產(chǎn)水平時具有明顯優(yōu)勢，但在改造細胞器代謝時仍存在巨大挑戰(zhàn)。首先，前體供應途徑必須靶向適宜的細胞器，細胞器的選擇依賴于目標代謝物合成路徑，如利用解脂耶氏酵母的高爾基體的脂質(zhì)合成能力，實現(xiàn)了脂肪酸乙酯和烷烴的高效合成[65]。其次，細胞器定位序列對相關(guān)酶活的負面影響值得關(guān)注。為了應對這一難題，需要對信號蛋白定位、輸入以及細胞器的滲透性進行更系統(tǒng)的研究。近期，Dong等[66]挖掘靶向線粒體的無害定位標簽(MTS)，并在釀酒酵母線粒體中構(gòu)建α-檀香萜合成途徑，將該化合物產(chǎn)量提高了3.7倍。因此，需要挖掘新型蛋白定位標簽擴大酵母細胞器區(qū)室化工程的工具箱?？傊毎鞴こ逃型蔀榻庵辖湍负铣奢祁惢衔锷踔疗渌衔锏闹匾呗浴?/p>

3 細胞水平調(diào)控

細胞整體水平的調(diào)控對于提高細胞工廠合成產(chǎn)物的合成效率至關(guān)重要，因此，從提高菌株萜類化合物耐受性、萜類產(chǎn)物外排和優(yōu)化菌株發(fā)酵條件三個方面概述解脂耶氏酵母的細胞水平調(diào)控策略。

3.1 提高菌株萜類化合物耐受性

萜類化合物對微生物細胞普遍具有毒性，產(chǎn)品的細胞毒性是限制微生物高產(chǎn)萜類化合物的難題[67]。在萜類化合物中，單萜的細胞毒性最為顯著，如檸檬烯會影響酵母細胞壁的生成，嚴重干擾細胞生長與代謝[68]，所以有必要挖掘關(guān)鍵基因以提高解脂耶氏酵母的單萜耐受性。Li等[17]分析了在檸檬烯脅迫下的解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)后，在82個上調(diào)表達基因中篩選出關(guān)鍵基因YALI0F19492g，將該基因與檸檬烯合酶基因共表達后，與出發(fā)菌株相比，檸檬烯的產(chǎn)量提高了8倍，而將該基因敲除后檸檬烯產(chǎn)量則降低1.5倍。

適應性實驗室進化(ALE)和異源轉(zhuǎn)運蛋白的引入對改善細胞萜類耐受性也有幫助[67]。ALE是通過將菌株暴露在環(huán)境壓力下以提高其應變適應性。Niu等[69]將常壓室溫等離子體誘變(ARTP)后的大腸桿菌暴露在含有20 g/L蒎烯的培養(yǎng)基中進行多輪次ALE，最終得到可以在20 g/L蒎烯條件下正常生長的大腸桿菌；之后，在該大腸桿菌中分別過表達來自惡臭假單胞菌的MexF和Alcanivoraxborkumensis的AcrBDFa兩種轉(zhuǎn)運蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種轉(zhuǎn)運蛋白增加了其對蒎烯的耐受性。由于萜烯化合物結(jié)構(gòu)具有相似性，不同化合物間可能具有相同的耐受性機制，所以提高一種萜類化合物耐受性的策略也可能適用于另一種萜類化合物。所以ALE協(xié)同異源轉(zhuǎn)運蛋白表達策略可能是最大限度解除萜烯對解脂耶氏酵母細胞毒性的方案之一。

3.2 萜類產(chǎn)物外排

耐受性研究可以提高宿主細胞對萜類化合物的耐受能力，而萜類產(chǎn)物外排則可有效減少有毒化合物在胞內(nèi)積累并提高其產(chǎn)量[70]。大分子四萜類物質(zhì)因不易運輸至細胞外，存儲于胞內(nèi)脂質(zhì)體中，而脂溶性的小分子萜類化合物則可以透過細胞被動擴散到胞外。根據(jù)萜類在有機相和水相的溶解系數(shù)不同，研究者開發(fā)了十二烷-水的兩相萃取發(fā)酵體系用于促進解脂耶氏酵母中單萜和倍半萜跨膜外排[16, 23]。盡管兩相發(fā)酵方式利于小分子萜類外排和分離純化，但是細胞膜的低滲透性依然是萜類跨膜外排的障礙[71]。

外排泵是一種提高萜類轉(zhuǎn)運的直接手段。目前在解脂耶氏酵母中尚未發(fā)現(xiàn)萜類轉(zhuǎn)運蛋白，但Wang等[72]已實驗證明，部分異源ATP依賴的轉(zhuǎn)運蛋白能夠?qū)⑤祁愞D(zhuǎn)運至胞外。近期，Zhao等[28]在解脂耶氏酵母中分別引入了來自大腸桿菌的AcrB蛋白和Grosmaniaclavigera的ABC-G1蛋白，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白均可以增加甜沒藥烯的外排水平，最終甜沒藥烯α、β和γ這3種同分異構(gòu)體最高搖瓶產(chǎn)量分別達到973.1、68.2 和20.2 mg/L。

利用萜類化合物被動擴散跨膜的特性，對解脂耶氏酵母細胞膜組成進行改造是提高萜類外排水平的另一種手段。通過調(diào)控脂質(zhì)代謝必需基因OLE1、PAH1和DGK1，Zhang等[31]將解脂耶氏酵母中不飽和脂肪酸含量提高了2倍，使橢球形細胞變得狹長的同時加速了三萜羽扇豆醇外排，最終有機相中羽扇豆醇產(chǎn)量達到381.6 mg/L，搖瓶中總產(chǎn)量為411.7 mg/L。該策略對其他三萜和倍半萜的外排效果也較顯著，為改善解脂耶氏酵母中萜類產(chǎn)品的外排提供了新的思路。

3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

代謝工程改造與發(fā)酵條件優(yōu)化相結(jié)合可加速解脂耶氏酵母工業(yè)化生產(chǎn)萜烯的進程。解脂耶氏酵母具有廣泛的碳源利用譜，能夠利用葡萄糖、木糖、甘油和烷烴等多種碳源。此外，解脂耶氏酵母又是嚴格需氧型酵母，且對高滲透壓和酸堿環(huán)境有高耐受性[12]。因此，根據(jù)解脂耶氏酵母的生理特性，來探索最佳的萜烯發(fā)酵條件。

倍半萜法尼烯在藥物、化妝品、調(diào)味品和生物能源等方面具有巨大的經(jīng)濟價值，法尼烯發(fā)酵的最佳碳源和最適發(fā)酵工藝已經(jīng)被較為廣泛地研究[73]。Liu等[22]比較工程解脂耶氏酵母LSC17利用檸檬酸、果糖、甘油和葡萄糖等7種不同碳源生產(chǎn)β-法尼烯的能力，最后發(fā)現(xiàn)，以甘油為碳源時產(chǎn)量最高，以果糖為碳源時生物量最大，而以檸檬酸為碳源時得率最佳；進一步在5 L發(fā)酵罐中分批補料發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)，以甘油為碳源的β-法尼烯產(chǎn)量比以葡萄糖為碳源時的高了60%。而Liu等[21]優(yōu)化了解脂耶氏酵母菌株生產(chǎn)α-法尼烯的發(fā)酵工藝，確定了最優(yōu)條件組合：30 ℃發(fā)酵、pH5.5、1.5 vvm的空氣流量和500 r/min的攪拌速度，結(jié)合補料，最終α-法尼烯的產(chǎn)量為25.6 g/L，是已報道的解脂耶氏酵母中最高的萜類化合物產(chǎn)量。這些研究證實了優(yōu)化解脂耶氏酵母發(fā)酵工藝的重要性。

另一方面，培養(yǎng)基中的碳源與氮源的含量對解脂耶氏酵母中萜類合成影響顯著。培養(yǎng)基中碳源與氮源比例稱為碳氮比(C/N)，氮源含量不變時，較高的碳氮比會增強脂質(zhì)或其他碳原子占比高的化合物(如，胡蘿卜素、萜類化合物)生物合成過程[74-75]。Gao等[35]在限氮條件下培養(yǎng)解脂耶氏酵母，調(diào)控脂質(zhì)的積累與β-胡蘿卜素的生成，最終產(chǎn)量為3.7 g/L。Larroude等[34]對培養(yǎng)基的碳氮比和β-胡蘿卜素之間的關(guān)系進行更全面研究時發(fā)現(xiàn)：在高碳氮比時，產(chǎn)物的產(chǎn)量最高，而在低碳氮比時，產(chǎn)物的得率最高，即低葡萄糖濃度下的分批補料方式利于提高解脂耶氏酵母的β-胡蘿卜素產(chǎn)量與得率；在20 g/L酵母提取物、40 g/L蛋白胨和5 g/L葡萄糖培養(yǎng)基條件下，采用分批補料方式得到6.5 g/L的β-胡蘿卜素，這是迄今為止工程酵母中最高的β-胡蘿卜素產(chǎn)量。因此，探究解脂耶氏酵母最優(yōu)的萜類產(chǎn)物發(fā)酵條件，是從細胞水平提高萜類產(chǎn)量促進工業(yè)應用最重要的策略之一。

4 解脂耶氏酵母生產(chǎn)萜烯的關(guān)鍵問題

解脂耶氏酵母因在乙酰輔酶A和還原力供給、底物利用和環(huán)境耐受性方面的優(yōu)勢，已被用于多種高價值萜類化合物的合成。但綜合現(xiàn)有解脂耶氏酵母中萜類化合物的合成策略，我們認為充分發(fā)揮解脂耶氏酵母的特性，最大化提高萜類化合物合成效率，至少需要在功能基因組學、遺傳操作工具開發(fā)和基因組尺度代謝模型(GEM)方面進行更深入研究。

目前，由于解脂耶氏酵母多數(shù)基因功能尚不明晰、基礎(chǔ)代謝網(wǎng)絡(luò)不明確，所以這限制了開發(fā)利用該菌的深度與進度。因此，利用功能基因組學完善解耶氏酵母的基因功能注釋和代謝調(diào)控分析是必不可少的。Patterson等[76]通過Hermes DNA轉(zhuǎn)座子誘變方式，將解脂耶氏酵母約22%的基因歸類為必需基因，并評估了非必需基因在甘油和葡萄糖為碳源時的生長貢獻。但與釀酒酵母相比，解脂耶氏酵母的功能基因組學研究還遠遠不夠，因此進一步完善解脂耶氏酵母基因功能的注釋與表征，建立類似釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫(SGD)的平臺網(wǎng)站，是建立解脂耶氏酵母代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和設(shè)計構(gòu)建細胞工廠的重要基礎(chǔ)。

高效的遺傳操作工具是精細的代謝工程改造的基礎(chǔ)。DNA水平的遺傳修飾(如，基因敲除、插入和替換)的實現(xiàn)依賴于細胞DNA修復機制。解脂耶氏酵母傾向于利用非同源末端連接(NHEJ)而非同源重組(HR)進行DNA損傷修復，因此同源重組效率一直是對解脂耶氏酵母進行定點精準基因編輯的障礙[77]。Ku70/Ku80蛋白復合體負責DNA雙鏈斷裂時的NHEJ修復，敲除Ku70可以提高解脂耶氏酵母利用CRISPR/Cas9技術(shù)提高基因改造的效率[78-80]，但Ku70基因敲除后細胞的生長變慢、抗逆性下降。而在畢赤酵母中，過表達基因Rad52并敲除MPH1，可避免NHEJ修復，同時將HR效率提高至68%～90%[81]。另一方面，利用解脂耶氏酵母的NHEJ修復能力，對甲羥戊酸途徑進行染色體水平的隨機整合也可以提高萜類化合物產(chǎn)量[21]。因此，對解脂耶氏酵母DNA修復機制進行深入研究，將有助于開發(fā)高效的遺傳操作工具。

基因組尺度代謝模型(GEM)的建立對縮短設(shè)計—構(gòu)建—測試—學習(DBTL)循環(huán)的時間，滿足多元化菌株構(gòu)建的需求有重要意義。根據(jù)基因組詳細功能注釋定義并將所有代謝基因的基因-酶-反應相關(guān)聯(lián)，共同描述該細胞的代謝網(wǎng)絡(luò)即GEM，代表著生物體特定的生理和遺傳知識庫[82]。已有研究從釀酒酵母GEM出發(fā)，基于基因組同源性建立了解脂耶氏酵母的GEM，并用于指導脂質(zhì)的高效生產(chǎn)[83-84]。高質(zhì)量和廣泛適用的GEM需要將酶促反應動力學、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白組學等基于新的耦合算法和模擬策略整合來建立和優(yōu)化解脂耶氏酵母的GEM，以指導多樣化工程改造解脂耶氏酵母[85]。這將在解脂耶氏酵母的基礎(chǔ)研究和各類化學品合成細胞工廠設(shè)計中發(fā)揮重要作用。

5 結(jié)論與展望

在“碳達峰”與“碳中和”的背景下，工業(yè)生產(chǎn)正趨向低碳低能耗的綠色發(fā)展。微生物合成具備反應條件溫和、可循環(huán)的特點，有望成為未來合成高價值萜類化合物的重要途徑。代謝工程和合成生物學的發(fā)展促進了解脂耶氏酵母細胞工廠的構(gòu)建，為萜類化合物化學合成和植物組織提取提供了替代方案。不同層次改造策略的精細協(xié)作、功能基因組學研究的逐步深入、基因組編輯工具的不斷完善和高質(zhì)量可視化GEM的建立將加深研究人員對解脂耶氏酵母獨特生理特性的認識，豐富精準高效遺傳改造的手段，都可加速多樣高效的萜烯生產(chǎn)菌株的構(gòu)建與工業(yè)化應用進程。